Summary
In vivo imaging är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka de cellulära mekanismerna bakom nervsystemet utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler i realtid inom den växande zebrafish nervsystemet.
Abstract
Utveckling av ryggradsdjur nervsystemet kräver en exakt samordning av komplexa cellulära beteenden och interaktioner. Användningen av högupplösta in vivo bildtekniker kan ge ett tydligt fönster in i dessa processer i den levande organismen. Till exempel kan dela celler och deras avkomma följas i realtid som nervsystemet bildas. Under de senaste åren har tekniska framsteg inom multicolor tekniker utökat de typer av frågor som kan undersökas. Den multicolor Brainbow metoden kan användas för att inte bara skilja mellan liknande celler, men också att färgkod flera olika kloner av relaterade celler som var och en härrör från en stamcell. Detta möjliggör en multiplex härstamning analys av många olika kloner och deras beteenden samtidigt under utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler över realtid inom den växande zebrafish nervsystemet. Detta är särskilt användbart för att följa cellulära interaktioner mellan liknande celler, som är svåra att märka differentiellt med traditionella promotordrivna färger. Vår metod kan användas för att spåra härstamning relationer mellan flera olika kloner samtidigt. De stora datamängder som genereras med hjälp av denna teknik ger omfattande information som kan jämföras kvantitativt över genetiska eller farmakologiska manipulationer. I slutändan de resultat som genereras kan bidra till att svara på systematiska frågor om hur nervsystemet utvecklas.
Introduction
I de tidiga utvecklingsfaserna delar sig pooler av specialiserade stamceller upprepade gånger i proliferativa zoner, vilket producerar olika matriser av dotterceller. De celler som föds under denna utvecklingsperiod kommer sedan att differentiera och resa för att bilda de begynnande organen. I nervsystemet, förfäder såsom radiell glia ge upphov till omogna nervceller i ventrikulära zoner. Som nervceller migrera bort från ventriklarna och mogna, den expanderande vävnaden bildar så småningom de mycket komplexa strukturerna i hjärnan1,2,3,4,5,6. Samordningen mellan uppdelning av stamfader och differentiering och migration av nervceller kommer att avgöra den slutliga storleken, formen, och därmed funktionen av hjärnan, direkt påverkar beteende7,8,9,10. Även om snäv kontroll över dessa processer är helt klart avgörande för normal hjärnans utveckling, de globala mekanismer som reglerar dessa dynamik är inte väl förstådda. Här beskriver vi ett verktyg för att studera nervsystemet utveckling på en cellulär upplösning, så att forskare att visualisera stamceller och nervceller in vivo i utvecklingen zebrafish hjärnan med Brainbow och spåra deras beteende över tiden via time-lapse confocal mikroskopi11. Tillvägagångssättet kan också anpassas för att visualisera andra delar av det utvecklande embryot.
För att observera och skilja mellan celler i den utvecklande zebrafiskhjärna har vi anpassat Brainbow cellmärkningsteknik11. Brainbow använder slumpmässigt bestämd, kombinatoriskt uttryck för tre distinkta fluorescerande proteiner (FPs) för att märka en population av celler. Medan standarduttrycket för Brainbow uttryck är den röda FP dTomato, återkombinering av enzymet Cre recombinase resulterar i uttryck för mCerulean (cyan fluorescerande protein, CFP) eller gult fluorescerande protein (YFP)12,13. Den sammanlagda mängden av varje FP uttryckt i en cell ger det en unik nyans, vilket möjliggör tydlig visuell åtskillnad från angränsande celler. Dessutom, när en stamcell delar sig, varje dotter cell kommer att ärva färgen från sin modercell, producerar färgkodade kloner och tillåter forskare att spåra cell härstamning11,14. Medan ursprungligen används för att analysera neuronala kretsar hos möss12, Brainbow har sedan dess uttryckts i en mängd olika modellorganismer, inklusive zebrafisk15.
Vår teknik bygger på tidigare multicolor märkning och bildframställning metoder för att direkt bild flera färgkodade kloner över tiden i levande zebrafisk. På grund av deras optiska öppenhet som embryon, zebrafisk är väl lämpade för bildbehandling experiment16, och tidigare studier har använt Brainbow i zebrafiskar att studera en mängd olika vävnader, inklusive nervsystemet11,15,17,18,19,20,21,22,23,,24,25, 26,27. Förmågan att direkt avbilda in i den levande organismen, tillsammans med deras snabba ex utero utveckling, gör zebrafisk en värdefull modell av ryggradsdjur utveckling. I motsats till däggdjurshjärnan är hela den proliferative zonen i zebrafisk hindbrain lätt tillgänglig för avbildning utan avbrott i dess endogena miljö6. Detta gör det möjligt att genomföra experiment i den levande organismen, snarare än i in vitro- eller fasta vävnadspreparat. I motsats till fasta bildframställning experiment, in vivo studier möjliggör en longitudinell design, producerar timmar av data som kan analyseras för mönster, vilket ökar sannolikheten för att observera relativt sällsynta händelser. Beroende på hastigheten och längden på händelser av intresse, kan forskarna välja att utföra korta (1-2 h) eller långa (upp till ~ 16 h) time-lapse imaging experiment. Genom att använda zebrafisk värme chock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttryck kan vara tidsmässigt kontrolleras28,29. Dessutom är mosaik uttryck framkallas av denna promotor väl lämpad för märkning och spåra många kloner11.
Förmågan att visuellt identifiera flera kloner i den levande hjärnan är en fördel med denna metod. Viktiga tidigare studier som undersökte klonernas roll inom utvecklingen av nervsystemet använde retrovirala vektorer för att märka en enda stamcell och dess avkomma med hjälp av ett enda FP eller annat lätt visualiserat protein. En sådan märkning gör det möjligt för forskare att observera en enda klon över tiden, antingen in vitro eller in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,38. I motsats till metoder för att spåra beteendet hos celler inom en klon, de distinkta färgerna i Brainbow tillåter forskare att observera dynamiken bland kloner. Dessutom, genom att använda Brainbow att märka många kloner i hjärnan, ytterligare data om kloniska beteende samlas in i förhållande till tekniker som etikett en enda klon11. Viktigt, de metoder som beskrivs här kan utökas för att generera utvecklingsmässiga jämförelser mellan fisk som har genomgått olika genetiska eller farmakologiska manipulationer18. Sammantaget gör dessa fördelar time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrycker zebrafisk idealisk för forskare utforska utvecklingen av ryggradsdjur nervsystemet, särskilt de som är intresserade av rollen som kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försök med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Lewis & Clark College.
1. Mikroinjektion av Zebrafish Embryon
- Ställ in vild typ, vuxna zebrafiskar i könssegregerade parningstankar på eftermiddagen innan du utför mikroinjektioner39,40.
- Förbered DNA-lösningen på morgonen av mikroinjektionerna. Späd hsp: Zebrabow11 plasmid DNA till en koncentration av ~10 ng/μL i 0,1 mM KCl, tillsammans med 2,5% fenol röd och 3.75U Cre recombinase enzym.
- Utför mikroinjektioner av DNA-lösning i encelliga zebrafiskembryon inom 45 min befruktning39,,41. Injicera cirka 4,2 nL av denna lösning i varje embryo, motsvarande ~42 pg plasmid-DNA.
OBS: Mikroinjektionssteget kan utelämnas om en transgen, Brainbow-uttryckande zebrafisklinje paras i stället, såsom Tg(ubi:Zebrabow)15 och Tg(neurod:Zebrabow)18. Utföra microinjections kan vara fördelaktigt eftersom det tillåter forskare att titrera kopieringsnummer och märkning densitet. Dessutom kan en andra DNA-konstruktion som taggar eller manipulerar en specifik genprodukt injiceras tillsammans med Brainbow om så önskas (t.ex. ett långtrött fluorescerande protein som kompletterar Brainbow18). - Underhåll injicerade embryon i petriskålar på E3 medium39 i en 28 °C-inkubator i 24 timmar.
2. Värmechock för att inducera Brainbow Uttryck
OBS: Om plasmid-DNA-värdet injiceras eller transgenen uttryckt inte använder hsp70 promotorn för att driva uttrycket, kan värmechocksteget hoppas över, och friska embryon bör omedelbart överföras till fenythiourea (PTU) vid 24 h efter befruktning (hpf).
- Vid 24 hpf, slakta döda och deformerade embryon från gruppen av injicerade embryon. Överför sedan de friska embryona till ett 50 ml-rör, med upp till 20 embryon/rör.
- Fyll rören med 10 ml E3. Placera ett lock ovanpå varje rör men stäng inte tätt.
- Placera rörstället som innehåller 50 ml-rören upprätt i ett 37 °C vattenbad. Se till att vattennivån i badet är högre än E3:ns nivå i rören och lämna dem i 80 till 90 minuter.
- Ta bort rörstället med embryona från vattenbadet och återgå till 28 °C-inkubatorn upprätt. Låt upp till 1 h för E3 svalna och embryona gradvis acklimatisera sig till temperaturen. Överför sedan embryona till petriskålar på 0,2 mM PTU i E3 som värms upp i inkubatorn för att förhindra pigmentering av embryon.
VARNING: PTU är en giftig kemikalie som ska hanteras varsamt och kasseras på lämpligt sätt. Bära handskar föreslås.
3. Screening embryon för Brainbow Uttryck
- Vid 2 till 4 h efter värmechock, undersöka embryon under en standard fluorescens dissekering mikroskop för uttryck av CFP eller YFP, vilket indikerar framgångsrika Brainbow rekombination (från standard uttryck för dTomato).
OBS: Om det finns flera alternativ för fluorescensfilter är screening för bestruken fiskeripolitik det effektivaste sättet att identifiera välkombinerad fisk. Om CFP- och YFP-filter inte är tillgängliga kan YFP också visualiseras svagt under GFP-filter (Green Fluoresccent Protein) på grund av överlappningen i deras spektrala profiler. - Välj embryon med robust FP-uttryck hela och överför till en separat maträtt med PTU. Bildembryon vid 1 dag efter befruktningen (dpf; 28 hpf eller senare) eller behålla embryon i PTU och bild vid 2 eller 3 dpf.
4. Montering av embryon för In Vivo Imaging
-
Före experimentdagen ska du förbereda bildbehandlingskammaren och embryomanipulationsverktyget.
- Förbered bildkammaren genom att försiktigt supergluing en plastring till mitten av en 60 mm petriskål.
- Alternativt förbereda en skräddarsydd embryo manipulator att flytta embryon i skålen och orientera embryon under montering. Konstruera manipulator genom att supergluing en liten längd av nylon fiskelina (~ 1 / 2 i, ~ 6 lb) till slutet av en trä bomullspinne pinne som har skurits till en ~ 4 i längd.
- Vid behov (dvs. avbildning vid 2 dpf eller tidigare) innan embryona monteras med sprutor under dissektionsmikroskop.
-
Söva zebrafisk embryon.
- Fyll en 60 mm petriskål halvvägs med E3 och tillsätt 5–6 droppar 4 mg/ml MS-222 Tricaine-S till en slutlig koncentration på ~0,2 mM. Snurra för att blanda.
VARNING: Tricaine ska hanteras varsamt och kasseras på lämpligt sätt. - Överför embryon från PTU till trikainlösningen, vilket säkerställer att så lite PTU överförs som möjligt. Medan fiskreflexer bör upphöra efter 1-2 min, lämna embryona i trikain i upp till 10 min för att säkerställa noggrann anestesiisering för time-lapse imaging experiment.
- Bekräfta att embryona är ordentligt sövda. Bedöm startelreflexen genom att försiktigt röra vid embryosvansarna med embryomanipulatorn. Om en reflexrörelse observeras, tillsätt en extra droppe trikain till skålen så långt från embryona som möjligt och snurra för att blanda. Observera embryopulsen under dissekeringsomfattning. Om det är onormalt långsam, tillsätt ytterligare droppar av E3 till skålen för att minska trikainkoncentrationen.
- Fyll en 60 mm petriskål halvvägs med E3 och tillsätt 5–6 droppar 4 mg/ml MS-222 Tricaine-S till en slutlig koncentration på ~0,2 mM. Snurra för att blanda.
-
Montera bedövningsmbryrta embryon i agarose.
- Överför fisken till mitten av plastringen i bildkammaren och ta bort så mycket överskott E3 som möjligt med hjälp av en finspetsad överföringspipette.
- Täck fisken med 1,0 % lågsmält agaros (LMA) i E3 som förvaras vid 42 °C och fyll hela plastringen med ett tunt lager agaros. Använd en överföringspisett för att försiktigt dra upp embryona i pipettspetsen och tillbaka in i agarose utan att införa luftbubblor.
- Innan agarose hårdnar, snabbt använda ett embryo manipulator för att orientera fisken på lämpligt sätt. Om avbildning med ett upprätt mikroskop, placera embryona så nära den övre ytan av agaros som möjligt. Placera embryona parallellt med undersidan av bildbehandlingskammaren med svansen rak.
OBS: För hindbrain imaging, embryon kan placeras i en dorsala eller sagittal vy. Man bör se till att embryonas huvuden inte sjunker medan agaroset fortfarande är flytande. Andra inriktningar kan vara lämpliga för att rikta andra utveckla vävnader för bildbehandling. För inverterade mikroskop, montering skulle göras annorlunda, vanligtvis placera fisken nära botten av en glasbottnad petriskål.
- Vänta tills agaten härdar och fyll sedan bildkammaren med E3. Lägg till så mycket E3 som möjligt för att ta hänsyn till avdunstningen under bildbehandlingen.
5. Time-lapse Confocal Imaging av utveckla Zebrafish Hindbrain
-
Placera bildbehandlingskammaren på konfokalmikroskopet som förberedelse för avbildningen.
- Placera bildbehandlingskammaren med fisken och E3 på konfiktmikroskopet.
- Välj ett mål med hög numerisk bländare och ett långt arbetsavstånd, till exempel ett 20x vattennedsänkningsmål (1,0 NA).
- Hitta en region med lämpligt tät och ljus märkning av celltyper av intresse.
OBS: Ett temperaturkontrollerat stadium/apparat på mikroskopet kan också användas för att reglera temperatur och fuktighet under långa bildsessioner. Detta kan minska avdunstningen.
-
Ställ in förvärvsparametrarna för Brainbow imaging.
- Bild varje FP-kanal sekventiellt. Om du använder en kommersiell programvara (t.ex. Zen-programvara) görs detta genom att förbereda tre "spår". Använd en Argon laser för att excitera CFP på 458 nm och YFP på 514 nm. Använd en DPSS 561 nm laser för att excitera dTomato. Samla in utsläpp mellan 463–509 nm för CFP, 519–555 nm för YFP och 566–691 nm för dTomato.
- För skärmvisning kodar du CFP som blå, YFP som gul och dTomat som röd.
OBS: Dessa inställningar varierar beroende på vilka laserlinjer och andra funktioner som finns tillgängliga på konfokalmikroskopet. För att öka hastigheten på bildframställning, CFP och dTomato kanaler kan avbildas samtidigt utan märkbar genomblödning. Om en separat FP också avbildas, till exempel en långröd FP, kan detta avbildas sekventiellt eller samtidigt med YFP. - Ställ in de allmänna bildningsparametrarna så att de tar 16-bitarsbilder med en upplösning på minst 1024 x 1024 och i genomsnitt två gånger. Justera zoomen beroende på region och celltyp av intresse (dvs. för hindbrain imaging med ett 20x mål zoomen kommer att variera från 1,0 till 2,5). Maximera synfältet för att möjliggöra tillväxt av fisken över tiden.
- Visa ett spår i taget (och stänga av andra lasrar för att förhindra fotobleaching), optimera förvärvsinställningarna för varje FP individuellt (t.ex. lasereffekt, hålstorlek, fotomultiplikatorrörsförstärkning, etc.).
- Välj Z-stackområde till bild.
OBS: För långa bildsessioner (>2 h), ta hänsyn till att fisken kommer att fortsätta att växa under hela bildbehandlingen, vilket innebär att både XY-fältet och Z-stack-området bör ta hänsyn till detta med extra utrymme. Om avbildning hindbrain, inkludera utrymme i fältet för vävnaden att flytta rostrally under bildbehandlingsperioden. Utrymme måste också inkluderas för tillväxt i Z-dimensionen. Inkludera i bilden cirka 10–20 μm över den område av intresse, om fisken är placerad för sagittal eller dorsal vy.
-
Ställ in parametrar för timelapse-avbildning.
- Välj ett tidsintervall. Intervalllängden varierar mellan 10-30 min för att spåra mitotiska och apoptotiska händelser i den utvecklande hindbrain. Intervalllängden varierar beroende på hastigheten på de händelser av intresse och den totala tid det tar att fånga en enda Z-stack.
- Välj längden på bildsessionen. Timelapse-bildsessioner inträffar i allmänhet över natten och kan pågå i minst 16 timmar.
-
Kör experimentet.
OBS: Fisken kan avlivas omedelbart efter avbildning eller noggrant dissekeras från agaros med sprutor och returneras till E3 för att återhämta sig. Återvunnen fisk kan sedan avbildas igen vid en senare tidpunkt, men cellens position och djup kommer att skifta under denna period på grund av den totala tillväxten.
6. Time-lapse Filhantering
-
Importera bildfilen till analysprogrammet.
- Om du använder Zen-programvaran sparar du filen i .czi-format när bildinhämtningen är klar. Se till att spara rådata i ett format som är kompatibelt med Fiji42 och/eller annan programvara.
- Importera till Fiji programvara med BioFormats Importer.
OBS: Timelapse-filer kommer att vara stora och kan kräva betydande mängder tid och minne för att öppna för analys. Därför är det bra att vara strategisk i hur de sparas och öppnas. Det kan vara användbart att spara en lägre kvalitet version som kan öppnas lättare att söka efter händelser av intresse genom ögat.
- Om du använder Fiji skapar du mindre, mer hanterbara delmängder av timelapse-filer. Generera delmängder antingen efter tid (t.ex. visning av full Z-stack vid första tidpunkten) eller efter djup (t.ex. visa de första 50 Z-sektionerna vid varje tidpunkt) genom att klicka på Bild| Staplar| Verktyg| Gör Substack.
7. Kvantitativ klonal färganalys av Brainbow Bilder
- Mät intensitetsvärdena för medelvärdet för röda, gröna och blå (RGB) för de celler som är av intresse i Fiji.
OBS: Dessa instruktioner är specifika för bildanalys i Fiji. Men forskare kanske föredrar att få genomsnittliga RGB intensitetsvärden i ett alternativt program.- Kontrollera att filen är korrekt beskuren så att det inte finns något svart utrymme runt bildens kanter. Svart utrymme kommer artificiellt sänka den minimala intensitet mätningar som behövs för analysen. Om filen behöver beskäras markerar du knappen För val av rektangel och ritar ett område av intresse (ROI) runt visningsfältet, exklusive allt svart utrymme. Klicka på Bild| Beskär.
- Ställ in mätverktyget så att medelvärdet, minimi- och maxmåtten för grått värde ska mätas. Klicka på Analysera| Ställ in mått. Kontrollera att kryssrutorna för Min & Max grått värde och Genomsnittligt grått värde är markerade.
- Visa rådata filer eller subsetted Z-stackar i Fiji, hitta celler av intresse för klonal färganalys. I hindbrain kan förmodade kloner identifieras visuellt genom sin delade nyans samt deras radiella orientering. Markera inte celler som är i nära kontakt med, och därmed svåra att lösa från, angränsande celler av en annan färg. Det kan vara svårt att kvantifiera deras nyans.
- Hitta mitten Z-planet av cellen av intresse med hjälp av Z-scrollbar. Högerklicka på knappen Oval markering och välj knappen Elliptisk markering. Andra markeringsverktyg är lämpliga för olika celltyper. Rita en elliptisk AVKASTNING runt den centrala ~ 2 / 3 av cellkroppen.
- Välj den röda kanalen (dTomato) med C-rullningslisten. Ta medelintensitetsmätningen för den här kanalen genom att välja Analysera| Mät. Upprepa med samma ROI och fokalplan för de gröna (YFP) och blå (CFP) kanalerna och spara alla medelintensitetsvärden.
- Klicka var som helst på bilden för att ta bort den elliptiska avkastningen i den cell av intresse.
- Om du vill mäta bakgrundsnivåer för normalisering använder du C-rullningslisten och väljer den röda kanalen (dTomato). Ta den lägsta intensitetsmätningen för hela fältet i den här kanalen genom att välja Analysera| Mät. Upprepa med samma fokalplan för de gröna (YFP) och blå (CFP) kanalerna och spara alla minimiintensitetsvärden.
- Beräkna relativa RGB-kanalvikter för de celler som är av intresse.
Beräkning av relativa RGB-kanalvikter från dessa intensitetsvärden kan utföras i en mängd olika program, till exempel Microsoft Excel eller R43.- Normalisera mätningen av medelintensiteten för cell-ROI för varje kanal genom att subtrahera den minimala intensiteten från hela fältet i kanalen och fokalplanet.
- Summera de normaliserade genomsnittliga RGB-intensitetsvärdena från varje kanal för att hitta den totala normaliserade RGB-intensiteten för cellen.
- Beräkna den relativa kanalvikten för varje kanal genom att dividera det normaliserade medelintensitetsvärdet för den kanalen med den totala normaliserade RGB-intensiteten.
- Visa relativa RGB-kanalvikter som ternära tomter med hjälp av ternära paket för R43,44. Ternära tomter är användbara för att visualisera klustring av liknande färger i 3D RGB-utrymme.
- Beräkna färgspridningskoefficienten för att kvantifiera skillnaden mellan cellfärger.
- Beräkna det euklidiska avståndet mellan de två färgerna i 3D RGB-utrymme med hjälp av följande ekvation:
där R, G och B är de relativa RGB-kanalvikterna som beräknas i 7.2. - För att underlätta förståelsen, normalisera färgavståndet genom att dividera med √2, det maximala möjliga avståndet mellan färgerna, för att få en färgspridningskoefficient mellan 0 och 1, där 0 indikerar exakt samma färg och 1 indikerar helt olika färger (t.ex. ren röd och ren blå).
- Beräkna det euklidiska avståndet mellan de två färgerna i 3D RGB-utrymme med hjälp av följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här avsnittet illustrerar exempel på resultat som kan erhållas med hjälp av in vivo multicolor time-lapse imaging metod som beskrivs här. Vi visar att Brainbow färgkodade kloner av celler i proliferative Ventrikulärt zonen i den växande zebrafish hindbrain14 (Figur 1).
Typiskt, när Brainbow-märkta celler arrangerades längs en viss radiell fiber, delade de samma färg (figur 1D), som kan kvantifieras som den relativa RGB kanal vikter (Figur 1E). Detta tyder på att dessa radiella grupper var kloner av dela celler och att deras liknande färg kan användas för att identifiera dem som klonala relaterade, som observerats i tidigare studier i zebrafisk, mus och chick14,15. När Brainbow märkning densitet är relativt gles, denna färgkodning kan användas för att tydligt visualisera och spåra många distinkta radiella kloner inom proliferative regioner i den levande ryggradsdjur hjärnan.
En kvantitativ färganalys visade att dotterceller uttryckte samma färg som sin modercell (stamcell) (figur 1F), men att angränsande radiella kluster av celler kan skiljas från varandra11 (figur 1E). Detta innebär att många kloner av relaterade celler kan följas samtidigt över timmar in vivo (figur 2), vilket möjliggör en multiplex härstamning analys och jämförelse. Kvantifiering av färguttryck i kloner vid 2 dpf och sedan igen vid 3 dpf (Figur 2A-B) visade att Brainbow uttryck också förblev relativt konstant från 2-3 dagar in vivo11. Enskilda celler kan därmed identifieras och spåras i realtid under relativt långa tidsperioder under utveckling.
Time-lapse imaging visade många celler som genomgår interkinetic nukleära migration och cell division under perioden från 1-2 dpf (Figur 2C–F)11, tillåter studie av cellcykeln. Med hjälp av ett tidsfördröjningsintervall på 30 min fångade vi inte alltid den mitotiska figuren under celldelning. Detta introducerade ett potentiellt fel på upp till 30 minuter till den tilldelade tiden för celldelning. Dessutom observerade vi några kloner som verkar innehålla två stamceller (t.ex. figur 2F). Inom dessa begränsningar kan längden på cellcykeln mätas. Genom att spåra enskilda Brainbow-märkta stamfader över tiden beräknade vi en genomsnittlig cellcykel på 8,4 ± 1,5 h, jämförbar med tidigare mätningar i zebrafisk1,,45,46. Dessutom, med hjälp av Brainbow time-lapse imaging teknik, kunde vi också observera enskilda celler som genomgår stereotypa morfologiska förändringar i samband med apoptos (figur 3)11, såsom membran blebbing och cell fragmentering47,48.
Figur 1: Brainbow märkta clonally relaterade kluster av dela celler i utvecklingen zebrafish hindbrain. (A)Schematisk av hsp:Zebrabow (Brainbow) DNA transiently uttryckt till färg-kod kloner. b)In vivo överförde ljusbilder av zebrafisk som utvecklades vid 1 och 2 dpf. pilarna anger den allmänna hindbrainregionen som är avsedd för bildbehandling. Embryonas genomskinlighet visas genom en mikrometer som placeras under varje fisk. Experimentell tidslinje som visar injektioner i encelligt stadium, värmechock (HS) vid 24 hpf och bildbehandling från 1–3 dpf. (C)Dorsal vy av 29 hpf zebrafisk hindbrain märkt med Brainbow. Den överförda ljuskanalen visade morfologi av hindbrain och ventrikel överlagrad med maximal intensitet projektion av Brainbow-märkta kloner som representerar 165 μm. Rostral är uppe. (D)In vivo Brainbow uttryck i bakhjärnan, visas i maximal intensitet prognoser som representerar 41 μm i glest märkta 51 hpf zebrafisk(D1),och 81 μm i 63,5 hpf zebrafisk (D2). I båda panelerna är dorsal upp och rostral är till vänster. E) Cellernas färg i D1 och D2 kvantifierades som relativa kanalvikter i motsvarande ternära områden (n = 54 celler E1; 461 celler E2). (F) Cellfärg förblev relativt konstant i dotter celler efter celldelning. Serie tidspunkter som visar in vivo mitotiska händelser i hindbrain av 29 hpf Brainbow-märkta zebrafiskar över 1 h (F1, högsta intensitet prognoser, 30 μm djup). Färgen på mor och dotter celler, som anges av de svarta rutorna i F1, representeras som relativa kanal vikter i ternära tomten i F2. Indraget visar en zoom av samma ritordning för att visa tätt klustrade cellfärger (M är mamma; D1 och D2 är döttrar på 30 min/rutor och 60 min/trianglar). Skalstänger = 30 μm (C), 20 μm (D1), 16 μm (D2) och 5 μm (F1). I C, D och F kodas dTomato som röd, YFP kodas som grön och cfp kodas som blå. Bilder omtryckta med tillstånd från Brockway et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Time-lapse in vivo imaging kombinerat med Brainbow färgkodning framstående flera angränsande kloner av celler som genomgår interkinetisk nukleär migration och delning. (A)Färgkodade radialkluster märkta i bakhjärnan hos en fisk som uttrycker Brainbow vid 2 dpf (55 hpf; A1) och 3 dpf (71 hpf; A2). högsta intensitetsprognoser som motsvarar 62 μm respektive 47 μm. Tre färgkodade radialkluster identifieras med pilspetsar vid varje tidpunkt. ( B)Färgen på alla Brainbow-märkta celler i A1 och A2 kvantifierades som relativa kanalvikter i motsvarande ternära områden i B1 och B2 (n = 106 celler, 119 celler). CCZebrafisk hindbrain vid 35 hk märkt med Brainbow (högsta intensitetprojektion som visar 24 μm). infälld indikerad med streckad vit ruta är den första tidpunkt som visas i D. (D) Serie av tidspunkter som tas med 30 min intervall i hindbrain från C. En period på >9,5 h visas. De märkta cellerna genomgick interkinetisk kärnmigration. vita pilspetsar indikerar en cell vid den apikala ytan. Avrundning av cellen soma vid den apikala ytan och en motsvarande ökning av klonantalet (t.ex. röda blodkroppar vid 5,5 h och sedan 8 h) ansågs vara en mitotisk händelse. E)Dorsolateral vy över zebrafisk hindbrain vid 30,5 hpf märkt med Brainbow, där den vita streckade och streckade linjen visar den ungefärliga gränsen för huvudet, och den vita streckade rutan anger den infällda som visas i den första tidspunkten för F. (F) Tidspunkter som tas med 30 min intervaller i hindbrain från E. Under en period av 1,5 h kunde två blå celler som indikeras av de vita pilspetsarna observeras flytta till den apikala ytan och genomgå mitos, vilket tyder på en klon som innehåller två stamceller. Skalstång = 20 μm (A), 25 μm (C) och 20 μm (F). I A-D är dorsal uppe och rostral är till vänster. I E och F är rostral till vänster. I alla bilder kodas dTomato som röd, YFP kodas som grön och CFP kodas som blå. Bilder omtryckta med tillstånd från Brockway et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Time-lapse Brainbow imaging visar celler i ventrikulära zonen genomgår celldöd in vivo. (A) Zebrafish hindbrain vid 31 hpf märkt med Brainbow (maximal intensitet projektion som representerar 36 μm). Vitstreckad ruta anger infälld som visas i den första tiden i B. (B) Tidspoäng som visar hindbrain i A med 30 min intervall. Vit pilspets i den första panelen visar en lavendel cell som genomgick apoptos som visas i efterföljande paneler, indikeras av cell fragmentering följt av gradvis clearance av apoptotiska organ. Angränsande märkta celler verkade friska hela tiden. Dorsal är uppe och rostral är till vänster. Skalstång = 20 μm (B). I alla bilder kodas dTomato som röd, YFP kodas som grön och CFP kodas som blå. Bilder omtryckta med tillstånd från Brockway et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera kloner av stamceller och nervceller i utvecklingen zebrafisk hindbrain och följa dem in vivo med Brainbow och time-lapse confocal mikroskopi11. Den största fördelen med detta protokoll i jämförelse med in vitro- eller ex vivo-studier är förmågan att direkt observera den proliferativa zonen av ryggradsdjur hjärnan i sin naturliga miljö över tiden. Denna teknik bygger på tidigare studier som märkt en enda klon med retrovirala vektorer. Däremot användningen av hsp:Zebrabow konstruera färgkoder många kloner samtidigt, vilket möjliggör multiplex härstamning spårning och fokus på dynamik bland kloner11. Detta protokoll kan ändras för att fokusera på utveckling i andra system eller celltyper. Till exempel kan olika Brainbow konstruktioner uttryckas i zebrafisk embryon. Användning av zebrafisk hsp70 promotor i HSP:Zebrabow kommer att resultera i mosaik märkning av en mängd olika celltyper efter värmechock, inklusive neurala stamceller och nervceller11, och ger forskarna tidsmässig kontroll över genuttryck29. Det bör noteras att användningen av värmechock promotorn konsekvent etiketter färgkodade kloner, medan andra initiativtagare inte tydligt kan avgränsa cell härstamning på detta sätt. När klonal identitet inte är en faktor av intresse, konstruktioner som använder andra initiativtagare kan användas för att märka specifika celltyper. Till exempel kan neuroD promotorn användas för att märka omogna nervceller18,49. Dessutom, istället för att utföra microinjections, forskare kan välja att använda transgena Brainbow zebrafisk, inklusive linjer som Tg (ubi: Zebrabow)15 och Tg (neurod: Zebrabow)18. I detta fall, korsar till linjer som uttrycker Cre rekombinationsas, såsom Tg (hsp:Crea134)15, producera oinjicerade embryon som samlas in och underhålls på ett liknande sätt. Även om detta protokoll är utformat för att avbilda fisk mellan 1-3 dpf, för att sammanfalla med den stora perioden av utvecklingsneurogenesis50, zebrafisk kan upprätthållas längre beroende på utvecklingsstadiet av intresse. Värmechock för att inducera Brainbow uttryck före 24 hpf kan dock vara mer skadligt för embryon51. Beroende på ålder och vävnad av intresse, olika monteringsstrategier kommer att vara lämpligt att ha riktad vävnad orienterad korrekt.
Det finns ett antal steg som kan kräva felsökning, särskilt om ändringar görs i protokollet. Koncentrationen av DNA, bolusstorlek injiceras, och den totala mängden DNA som levereras per embryo kan alla justeras om Brainbow uttryck är svagt eller gles eller om embryon inte verkar friska. Dessutom kan längden och tidpunkten för värmechocksteget ändras om önskat uttryck inte uppnås. Förvärvsparametrarna som används vid avbildning varierar beroende på vilka laserlinjer och filter som finns tillgängliga samt hur starkt uttryck, montering och typ av analys som önskas. Dessutom måste parametrarna för timelapse justeras beroende på hastigheten på händelserna av intresse och tidsbehovet för att förvärva en enda Z-stack. Ett av de mest kritiska stegen i protokollet är lämplig montering av fisken i agaros: om fiskens vinkel är olämplig eller om fisken täcks av för mycket agaros, kommer optimal avbildning inte att vara möjlig. Optimera denna teknik kan ta viss praxis. Dessutom är det ofta användbart att montera flera fiskar före avbildning eftersom det kan vara svårt att avgöra om montering är lämpligt innan du tittar på FP uttryck på konfokalmikroskopet själv. Ett ytterligare kritiskt steg är screening och urval av den specifika fisk som ska avbildas. Om du utför mikroinjektioner, ljusstyrka, märkning densitet, och Brainbow kopieringsnummer kan alla variera avsevärt mellan fisk. Bilder tagna i fisk med svag märkning, alltför tät märkning eller ett lågt kopieringsnummer som resulterar i få färger kan vara svårare att analysera.
Med detta protokoll har vi kontinuerligt kunnat avbilda levande zebrafiskar upp till 16 h11. Denna tid kan begränsas genom E3 avdunstning från bildbehandlingskammaren, tillväxten av fisken ur bildplanet, död eller rörelse av fisken, eller användarens begränsningar på konfokalmikroskoptid. Avdunstning kan minskas med hjälp av ett temperaturkontrollerat tillbehör på mikroskopstadiet. Det bör noteras att 5D-datauppsättningar som genereras med denna metod tenderar att vara stora filer som kräver betydande hårddiskutrymme (t.ex. upp till ~ 100 GB för en natt time-lapse) och tillräcklig datorkraft för att analysera.
Detta protokoll vägleder forskare att visualisera färgkodade kloner inom en population av neurala förfäder och dotter nervceller i utvecklingen zebrafish hjärnan och spåra deras dynamik över tiden. En möjlig expansion är kombinationen av Brainbow time-lapse imaging med långtröda FP märkning för att bedöma rollerna för specifika gener i utveckling18. På detta sätt kan kloner som uttrycker manipulerade gener visualiseras i en distinkt färg, spåras med tiden, och jämfört med Brainbow-märkta, icke-manipulerade närliggande kloner. In vivo multicolor imaging kan användas för att ta itu med viktiga mekanistiska frågor om hur nervsystemet former och funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Y. A. Pan, J. Livet och Z. Tobias för tekniska och intellektuella bidrag. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (Award 1553764) och MJ Murdock Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL transfer pipette (fine tip) | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5 mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 42 °C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28 °C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al.
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S.
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B.
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
