Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ब्रूरेन और टाइम-लैप्स कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके ज़ेब्राफिश में विकासशील मस्तिष्क की कल्पना करना

Published: March 23, 2020 doi: 10.3791/60593
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Lewis & Clark College

Summary

वीवो इमेजिंग में एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग तंत्रिका तंत्र के विकास में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में मल्टीकलर ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं।

Abstract

कशेरुकी तंत्रिका तंत्र के विकास के लिए जटिल सेलुलर व्यवहार और बातचीत के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। वीवो इमेजिंग तकनीकों में उच्च संकल्प का उपयोग जीवित जीव में इन प्रक्रियाओं में एक स्पष्ट खिड़की प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं और उनकी संतानों को विभाजित करने का पालन वास्तविक समय में किया जा सकता है क्योंकि तंत्रिका तंत्र रूपों। हाल के वर्षों में, बहुरंगी तकनीकों में तकनीकी प्रगति ने उन प्रश्नों के प्रकारों का विस्तार किया है जिनकी जांच की जा सकती है। बहुरंगी ब्रून दृष्टिकोण का उपयोग न केवल कोशिकाओं की तरह भेद करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि संबंधित कोशिकाओं के कई अलग-अलग क्लोन रंग-कोड के लिए भी किया जा सकता है जो प्रत्येक एक जनक कोशिका से प्राप्त होते हैं। यह विकास के दौरान एक साथ कई अलग-अलग क्लोन और उनके व्यवहार के मल्टीप्लेक्स वंश विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में बहुरंगी ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। यह कोशिकाओं की तरह के बीच सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो पारंपरिक प्रमोटर संचालित रंगों का उपयोग करके अलग-अलग लेबल करना मुश्किल है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग एक साथ कई अलग-अलग क्लोन के बीच वंश संबंधों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न बड़े डेटासेट समृद्ध जानकारी प्रदान करते हैं जिनकी तुलना आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ में मात्रात्मक रूप से की जा सकती है। अंततः उत्पन्न परिणाम तंत्रिका तंत्र कैसे विकसित होते हैं, इसबारे में व्यवस्थित सवालों का जवाब देने में मदद कर सकते हैं।

Introduction

विकास के प्रारंभिक चरणों में, विशेष जनक कोशिकाओं के पूल बार-बार प्रजनक क्षेत्रों में विभाजित होते हैं, जिससे बेटी कोशिकाओं की विविध सरणी का उत्पादन होता है। इस विकास अवधि के दौरान पैदा हुई कोशिकाएं तब अंतर करेंगी और नवजात अंगों के रूप में यात्रा करेंगी। तंत्रिका तंत्र में, रेडियल ग्लिया जैसे जनक वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में अपरिपक्व न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं। जैसे ही न्यूरॉन्स वेंट्रिकल्स और परिपक्व से दूर चले जाते हैं, विस्तार ऊतक अंततः मस्तिष्क की अत्यधिक जटिल संरचनाएं1,,2,,3,,4,,5,,6बनाता है। जनकों के विभाजन और न्यूरॉन्स के भेदभाव और प्रवास के बीच समन्वय अंतिम आकार, आकार, और इस प्रकार मस्तिष्क के कार्य को निर्धारित करेगा, जो सीधे व्यवहार7,8,8,9,,10को प्रभावित करता है। जबकि इन प्रक्रियाओं पर तंग नियंत्रण सामान्य मस्तिष्क के विकास के लिए स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण है, इन गतिशीलता को विनियमित करने वाले वैश्विक तंत्र को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। यहां हम एक सेलुलर संकल्प पर तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण का वर्णन करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को बोरेन के साथ विकसित जेब्राफिश मस्तिष्क में वीवो में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की कल्पना करने की अनुमति मिल जाती है और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11के माध्यम से समय के साथ उनके व्यवहार को ट्रैक किया जा सकता है। दृष्टिकोण को विकासशील भ्रूण के अन्य हिस्सों की कल्पना करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

विकासशील जेब्राफिश मस्तिष्क में कोशिकाओं के बीच निरीक्षण और भेद करने के लिए, हमने ब्रैनबोसेल-लेबलिंग तकनीक11को अनुकूलित किया है। Brainbow कोशिकाओं की आबादी लेबल करने के लिए तीन अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की बेतरतीब ढंग से निर्धारित, संयोजन अभिव्यक्ति का उपयोग करता है । जबकि ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति के लिए डिफ़ॉल्ट अभिव्यक्ति लाल एफपी dTomato है, एंजाइम क्रे द्वारा पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप मैसेरूलन (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सीएफपी) या येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी)12,,13की अभिव्यक्ति होती है। एक सेल में व्यक्त प्रत्येक एफपी की संयुक्त राशि इसे एक अनूठा रंग देती है, जिससे पड़ोसी कोशिकाओं से स्पष्ट दृश्य भेद होता है। इसके अतिरिक्त, जब एक जनक कोशिका विभाजित होती है, तो प्रत्येक बेटी सेल अपनी मदर सेल से रंग का वारिस होगा, रंग-कोडित क्लोन का उत्पादन करेगा और शोधकर्ताओं को सेल वंश11,,14का पता लगाने की अनुमति देगा। जबकि मूल रूप से चूहों12में न्यूरोनल सर्किटरी का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है, इसके बाद से ब्रैनरेन को जेब्राफिश15सहित विभिन्न प्रकार के मॉडल जीवों में व्यक्त किया गया है।

हमारी तकनीक पिछले मल्टीकलर लेबलिंग और इमेजिंग तरीकों पर बनाता है सीधे ज़ेब्राफ़िश रहने में समय के साथ कई रंग कोडित क्लोन छवि । भ्रूण के रूप में उनकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जेब्राफिश इमेजिंग प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलहैं,और पिछले अध्ययनों ने तंत्रिका तंत्र11,,15,,17,18,,19,,20, 21,,,21,22,,23,,24,,25सहित विभिन्न ऊतकों का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश में ब्रून का उपयोग कियाहै, 26,27. जीवित जीव में सीधे छवि बनाने की क्षमता, उनके तेजी से पूर्व गर्भाशय विकास के साथ, जेब्राफिश को कशेरुकी विकास का एक मूल्यवान मॉडल बनाती है। स्तनधारी मस्तिष्क के विपरीत, जेब्राफिश हिंदब्रेन का पूरा प्रसारक्षेत्र अपने एंडोजेनस वातावरण6में व्यवधान के बिना इमेजिंग के लिए आसानी से उपलब्ध है। यह इन विट्रो या निश्चित ऊतक तैयारी के बजाय जीवित जीव में प्रयोग ों को आयोजित करने की अनुमति देता है। निश्चित इमेजिंग प्रयोगों के विपरीत, वीवो अध्ययनों में एक देशीयंधात्मक डिजाइन के लिए अनुमति देते हैं, जो पैटर्न के लिए विश्लेषण किए जा सकने वाले घंटों के डेटा का उत्पादन करते हैं, इस प्रकार अपेक्षाकृत दुर्लभ घटनाओं को देखने की संभावना बढ़ जाती है। गति और ब्याज की घटनाओं की लंबाई के आधार पर, शोधकर्ताओं ने कम (1-2 घंटे) या लंबे समय (~16 घंटे तक) समय चूक इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए चुन सकते हैं । जेब्राफिश हीट शॉक प्रमोटर 70 (एचएसपी70, एचएसपी) का उपयोग करके, ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति को28,,29को नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रमोटर द्वारा प्रेरित मोज़ेक अभिव्यक्ति कई क्लोन11को लेबल करने और ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

जीवित मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन की पहचान करने की क्षमता इस विधि का लाभ है। तंत्रिका तंत्र के विकास के भीतर क्लोन की भूमिका की जांच करने वाले महत्वपूर्ण पिछले अध्ययनों ने एक ही प्रोजेनिटर सेल और इसकी संतान को एक एफपी या अन्य आसानी से कल्पना प्रोटीन का उपयोग करके लेबल करने के लिए रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग किया। इस तरह की लेबलिंग शोधकर्ताओं को समय के साथ एक ही क्लोन का पालन करने की अनुमति देती है, या तो इन विट्रो में,या वीवो2, 30 ,31,,,32,33,3431,35 ,3636,37,38में ।, एक क्लोन के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने के तरीकों के विपरीत, Bइंद्रधनुष के अलग रंग शोधकर्ताओं क्लोन के बीच गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देते हैं । इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन लेबल करने के लिए Bइंद्रधनुष का उपयोग करके, क्लोनल व्यवहार पर अतिरिक्त डेटा तकनीकों के सापेक्ष एकत्र किया जाता है जो एक क्लोन11लेबल करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि यहां वर्णित दृष्टिकोणों का विस्तार मछली के बीच विकासात्मक तुलना उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो18में विभिन्न आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ से गुजरे हैं। कुल मिलाकर, ये फायदे वर्सेब्रेट तंत्रिका तंत्र के विकास की खोज करने वाले शोधकर्ताओं के लिए जेब्राफिश आदर्श, विशेष रूप से क्लोन की भूमिका में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए बोइंद्रधनुष-व्यक्त जेब्राफिश आदर्श के वीवो कॉन्फोकल इमेजिंग में समय-चूक करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

लुईस एंड क्लार्क कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई है।

1. जेब्राफिश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

  1. माइक्रोइंजेक्शन39,40प्रदर्शन करने से पहले दोपहर को सेक्स-अलग संभोग टैंकों में जंगलीप्रकार,वयस्क ज़ेब्राफिश की स्थापना करें।
  2. माइक्रोइंजेक्शन की सुबह डीएनए सॉल्यूशन तैयार करें। पतला एचएसपी:जेब्राबो11 प्लाज्मिड डीएनए 0.1 एमएम केसीएल में ~ 10 एनजी/μL की एकाग्रता के लिए, साथ में 2.5% फिनॉल लाल और 3.75U क्रे रिकॉम्बिनेज़ एंजाइम।
  3. निषेचन39,41के 45 मिनट के भीतर एक कोशिका जेब्राफिश भ्रूण में डीएनए समाधान के माइक्रोइंजेक्शन प्रदर्शन करें । प्रत्येक भ्रूण में इस समाधान के लगभग 4.2 nL इंजेक्ट, प्लाज्मिड डीएनए के ~ 42 स्नातकोत्तर के बराबर।
    नोट: माइक्रोइंजेक्शन कदम को छोड़ा जा सकता है यदि ट्रांसजेनिक, ब्रैनबोन-व्यक्त जेब्राफिश लाइन को टीजी (यूबीआई: जेब्राबो)15 और टीजी (न्यूरोड: जेब्राबो)18के बजाय संभोग किया जाता है। माइक्रोइंजेक्शन प्रदर्शन लाभप्रद हो सकता है क्योंकि यह शोधकर्ताओं को कॉपी नंबर और लेबलिंग घनत्व को टिट्रेट करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक दूसरा डीएनए निर्माण जो किसी विशिष्ट जीन उत्पाद को टैग या हेरफेर करता है, अगर वांछित हो तो ब्रैनरेन के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन जो ब्रैनबोन18का पूरक है)।
  4. 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में E3 मध्यम39 के पेट्री व्यंजनों में इंजेक्शन भ्रूण बनाए रखें।

2. ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए हीट शॉक

नोट: यदि प्लाज्मिड डीएनए इंजेक्शन या ट्रांसजीन व्यक्त की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए hsp70 प्रमोटर का उपयोग नहीं करता है, गर्मी सदमे कदम छोड़ दिया जा सकता है, और स्वस्थ भ्रूण तुरंत 24 घंटे पोस्ट निषेचन (hpf) में phenylthiourea (पीटीयू) को स्थानांतरित किया जाना चाहिए ।

  1. 24 hpf में, cull मृत और इंजेक्शन भ्रूण के समूह से विकृत भ्रूण । फिर, स्वस्थ भ्रूण को 50 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें, जिसमें 20 भ्रूण/ट्यूब तक हों।
  2. ई3 के 10 mL के साथ ट्यूबों भरें। प्रत्येक ट्यूब के शीर्ष पर एक टोपी रखें लेकिन कसकर बंद न करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 50 मीटर ट्यूब वाले ट्यूब रैक को सीधा रखें। सुनिश्चित करें कि स्नान में जल स्तर ट्यूबों में ई3 के स्तर से अधिक है और उन्हें 80 से 90 0 0 0 के लिए छोड़ दें।
  4. पानी के स्नान से भ्रूण के साथ ट्यूब रैक निकालें और 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर सीधे वापस आ जाते हैं। E3 के लिए 1 घंटे तक शांत करने के लिए अनुमति देते हैं और भ्रूण धीरे-धीरे तापमान के लिए फिर से acclimate करने के लिए। फिर, भ्रूण के पिगमेंटेशन को रोकने के लिए इनक्यूबेटर में गरम E3 में 0.2 mM पीटीयू के पेट्री व्यंजनों में भ्रूण स्थानांतरित करें।
    सावधानी: पीटीयू एक विषाक्त रसायन है जिसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए। दस्ताने पहनने का सुझाव दिया जाता है।

3. इंद्रधनुष अभिव्यक्ति के लिए भ्रूण स्क्रीनिंग

  1. गर्मी के झटके के बाद 2 से 4 घंटे में, सीएफपी या वाईएफपी की अभिव्यक्ति के लिए एक मानक फ्लोरेसेंस विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें, जो सफल ब्रैरेन पुनर्संयोजन (dTomato की डिफ़ॉल्ट अभिव्यक्ति से) को इंगित करता है।
    नोट: यदि कई फ्लोरेसेंस फिल्टर विकल्प उपलब्ध हैं, तो सीएफपी के लिए स्क्रीनिंग अच्छी तरह से पुनर्संयोजन मछली की पहचान करने का सबसे कारगर तरीका है। यदि सीएफपी और वाईएफपी फिल्टर उपलब्ध नहीं हैं, तो वाईएफपी को उनके स्पेक्ट्रल प्रोफाइल में ओवरलैप के कारण ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) फिल्टर के तहत भी मंद रूप से कल्पना की जा सकती है।
  2. भर में मजबूत एफपी अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण का चयन करें और पीटीयू के साथ एक अलग पकवान के लिए हस्तांतरण । इमेज भ्रूण 1 दिन पोस्ट फर्टिलाइजेशन (डीपीएफ; 28 एचपीएफ या बाद में) या पीटीयू में भ्रूण बनाए रखें और 2 या 3 डीपीएफ पर इमेज ।

4. वीवो इमेजिंग में बढ़ते भ्रूण

  1. प्रयोग के दिन से पहले, इमेजिंग चैंबर और भ्रूण हेरफेर उपकरण तैयार करें।
    1. एक प्लास्टिक की अंगूठी को 60 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में ध्यान से सुपरग्लूइंग करके इमेजिंग चैंबर तैयार करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, बढ़ते समय पकवान और ओरिएंट भ्रूण के भीतर भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक कस्टम-निर्मित भ्रूण जोड़तोड़ तैयार करें। एक लकड़ी के कपास झाड़ू छड़ी है कि लंबाई में एक ~ 4 को काट दिया गया है के अंत करने के लिए नायलॉन मछली पकड़ने की लाइन (~ 1/2 में, ~ 6 पौंड) की एक छोटी लंबाई supergluing द्वारा जोड़तोड़ का निर्माण ।
  2. यदि आवश्यक हो (यानी, 2 डीपीएफ या उससे पहले इमेजिंग), एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सिरिंज का उपयोग कर के भ्रूण dechorionate बढ़ते से पहले ।
  3. एनेस्थेटाइज़ जेब्राफिश भ्रूण।
    1. E3 के साथ आधे रास्ते में 60 मिमी पेट्री डिश भरें और ~ 0.2 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए 4 मिलीग्राम/mL एमएस-222 Tricaine-S की 5-6 बूंदें जोड़ें। मिश्रण करने के लिए भंवर।
      सावधानी: ट्रिकेन को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए।
    2. पीटीयू से भ्रूण को ट्राइकेन समाधान में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करें कि छोटे पीटीयू को यथासंभव स्थानांतरित किया जाता है। जबकि मछली सजगता 1-2 मिन के बाद बंद हो जाना चाहिए, 10 मिन तक के लिए ट्राइकेन में भ्रूण छोड़ समय चूक इमेजिंग प्रयोगों के लिए पूरी तरह से एनेस्थेटाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए ।
    3. पुष्टि करें कि भ्रूण ठीक से एनेस्थेटाइज्ड हैं। भ्रूण जोड़तोड़ के साथ धीरे से भ्रूण पूंछ को छूकर चौंकाना पलटा का आकलन करें। यदि एक पलटा आंदोलन मनाया जाता है, तो यथासंभव भ्रूण से दूर पकवान में ट्राइकेन की एक अतिरिक्त बूंद जोड़ें और मिश्रण करने के लिए भंवर करें। विच्छेदन दायरे के तहत भ्रूण हृदय गति का निरीक्षण करें। यदि यह असामान्य रूप से धीमा है, तो ट्राइकेन एकाग्रता को कम करने के लिए पकवान में E3 की अतिरिक्त बूंदें जोड़ें।
  4. अगारोज में एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण माउंट।
    1. इमेजिंग चैंबर के भीतर प्लास्टिक की अंगूठी के केंद्र में मछली स्थानांतरित करें और एक ठीक इत्तला दे दी हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर के रूप में ज्यादा अतिरिक्त E3 को हटा दें ।
    2. एक स्वच्छ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके, मछली को 42 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत E3 में 1.0% कम पिघलने वाले अगारोज (एलएमए) के साथ कवर करें और पूरे प्लास्टिक की अंगूठी को अगारोज की पतली परत से भर दें। धीरे-धीरे भ्रूण को पिपेट टिप में खींचने और हवा के बुलबुले पेश किए बिना अगारोज में वापस खींचने के लिए स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।
    3. इससे पहले कि अगारोज कठोर हो जाता है, जल्दी से मछली को उचित रूप से उन्मुख करने के लिए भ्रूण जोड़तोड़ का उपयोग करें। यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग, संभव के रूप में अगागुलाब की ऊपरी सतह के करीब के रूप में भ्रूण की स्थिति । सीधे पूंछ के साथ इमेजिंग चैंबर के नीचे के समानांतर भ्रूण की स्थिति।
      नोट: हिंदब्रेन इमेजिंग के लिए, भ्रूण को एक पृष्ठीय या सजीटल दृश्य में तैनात किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि भ्रूण के सिर डूबें नहीं जबकि अगारोज अभी भी तरल है। इमेजिंग के लिए अन्य विकासशील ऊतकों को लक्षित करने के लिए अन्य झुकाव उपयुक्त हो सकते हैं। उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए, बढ़ते अलग ढंग से किया जाएगा, आम तौर पर एक गिलास तली पेट्री पकवान के नीचे के करीब मछली स्थिति ।
  5. अगारोज को कठोर होने की प्रतीक्षा करें, फिर इमेजिंग चैंबर को E3 से भरें। इमेजिंग के दौरान वाष्पीकरण के लिए खाते में संभव के रूप में ज्यादा E3 जोड़ें।

5. जेब्राफिश हिंदब्रेन के विकास का समय-चूक कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. इमेजिंग की तैयारी में कोफोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग चैंबर रखें।
    1. इमेजिंग चैंबर को मछली और ई 3 के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रखें।
    2. एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर और एक लंबी काम करने की दूरी के साथ एक उद्देश्य का चयन करें, जैसे कि 20x पानी विसर्जन उद्देश्य (1.0 एनए)।
    3. ब्याज के सेल प्रकार (ओं) के उचित रूप से घने और उज्ज्वल लेबलिंग के साथ एक क्षेत्र का पता लगाएं।
      नोट: लंबे इमेजिंग सत्रों के दौरान तापमान और आर्द्रता को विनियमित करने के लिए माइक्रोस्कोप पर तापमान नियंत्रित चरण/तंत्र का भी उपयोग किया जा सकता है । इससे वाष्पीकरण में कमी आ सकती है।
  2. Bइंद्रधनुष इमेजिंग के लिए अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना की।
    1. प्रत्येक एफपी चैनल को क्रमिक रूप से छवि दें। यदि एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे, ज़ेन सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके, यह तीन "ट्रैक" तैयार करके किया जाता है। 514 एनएम पर 458 एनएम और वाईएफपी पर सीएफपी को उत्तेजित करने के लिए आर्गन लेजर का उपयोग करें। dTomato उत्तेजित करने के लिए एक डीपीएस 561 एनएम लेजर का प्रयोग करें। सीएफपी के लिए 463-509 एनएम, वाईएफपी के लिए 519-555 एनएम और डीटमाटर के लिए 566-691 एनएम के बीच उत्सर्जन एकत्र करें।
    2. ऑन-स्क्रीन डिस्प्ले के लिए, ब्लू के रूप में सीएफपी कोड, वाईएफपी को पीले रंग के रूप में, और लाल रंग के रूप में dTomato।
      नोट: ये सेटिंग्स अलग-अलग होंगी, जिसके आधार पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लेजर लाइनें और अन्य फीचर्स उपलब्ध हैं। इमेजिंग की गति को बढ़ाने के लिए, सीएफपी और dTomato चैनलों को सराहनीय खून के माध्यम से बिना एक साथ चित्रित किया जा सकता है। यदि एक अलग एफपी भी छवि जा रहा है, जैसे कि दूर-लाल एफपी, तो इसे क्रमिक रूप से या वाईएफपी के साथ चित्रित किया जा सकता है।
    3. कम से कम 1024 x 1024 के संकल्प के साथ 16-बिट छवियों को लेने और दो बार औसत करने के लिए सामान्य इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करें। क्षेत्र और सेल प्रकार के ब्याज के आधार पर ज़ूम को समायोजित करें (यानी, 20x उद्देश्य के साथ हिंदब्रेन इमेजिंग के लिए ज़ूम 1.0-2.5 से होगा)। समय के साथ मछली के विकास के लिए अनुमति देने के लिए देखने के क्षेत्र को अधिकतम करें।
    4. एक समय में एक ट्रैक देखना (और फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए अन्य लेजर बंद करना), प्रत्येक एफपी के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स को व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करें (उदाहरण के लिए, लेजर पावर, पिनहोल आकार, फोटोमल्टीक्यूजर ट्यूब गेन, आदि)।
    5. छवि के लिए Z-ढेर रेंज का चयन करें।
      नोट: लंबे इमेजिंग सत्रों (>2 h) के लिए, ध्यान में रखना है कि मछली इमेजिंग के दौरान विकसित करने के लिए जारी रहेगा, इस प्रकार दोनों XY क्षेत्र और जेड ढेर रेंज अतिरिक्त कमरे के साथ इस के लिए खाते में होना चाहिए । यदि हिंदब्रेन इमेजिंग कर रहे हैं, तो इमेजिंग अवधि के दौरान रोस्टरैली को स्थानांतरित करने के लिए ऊतक के लिए क्षेत्र में स्थान शामिल करें। जेड आयाम में वृद्धि के लिए अंतरिक्ष को भी शामिल करने की जरूरत है। ब्याज के क्षेत्र के ऊपर लगभग 10-20 माइक्रोन छवि में शामिल करें, चाहे मछली sagittal या पृष्ठीय दृश्य के लिए तैनात है ।
  3. समय-चूक इमेजिंग के लिए पैरामीटर स्थापित करें।
    1. एक समय अंतराल का चयन करें। विकासशील हिंदब्रेन में माइटोटिक और अपोप्टिक घटनाओं को ट्रैक करने के लिए अंतराल लंबाई 10-30 मीइन के बीच होती है। अंतराल की लंबाई ब्याज की घटनाओं की गति के आधार पर भिन्न होगी और एक जेड-स्टैक को पकड़ने में कुल समय लगता है।
    2. इमेजिंग सत्र की लंबाई का चयन करें। समय चूक इमेजिंग सत्र आम तौर पर रातोंरात होते हैं और कम से कम 16 घंटे पिछले कर सकते हैं।
  4. प्रयोग चलाएं।
    नोट:     मछली तुरंत इमेजिंग के बाद euthanized किया जा सकता है या ध्यान से सीरिंज का उपयोग कर agarose से विच्छेदित और ठीक होने के लिए E3 में लौट आए । बरामद मछली तो एक बाद के समय बिंदु पर फिर से चित्रित किया जा सकता है, हालांकि सेल की स्थिति और गहराई समग्र विकास के कारण इस अवधि के दौरान बदलाव होगा ।

6. समय-चूक फाइल प्रबंधन

  1. छवि फ़ाइल को विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात करें।
    1. यदि ज़ेन सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो छवि अधिग्रहण पूरा होने के बाद फ़ाइल को .czi प्रारूप में सहेजें। फिजी42 और/
    2. बायोफॉर्मेट्स आयातक का उपयोग करके फिजी सॉफ्टवेयर में आयात करें।
      नोट: समय-चूक फ़ाइलें बड़ी होंगी और विश्लेषण के लिए खोलने के लिए महत्वपूर्ण मात्रा में समय और स्मृति की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रकार, यह कैसे वे बचाया और खोला जाता है में रणनीतिक होने के लिए उपयोगी है । यह एक कम गुणवत्ता वाले संस्करण को बचाने के लिए उपयोगी हो सकता है जिसे आंख द्वारा ब्याज की घटनाओं की खोज करने के लिए अधिक आसानी से खोला जा सकता है।
  2. यदि फिजी का उपयोग कर रहे हैं, तो समय-चूक फ़ाइलों के छोटे, अधिक प्रबंधनीय सबसेट बनाएं। इमेजपर क्लिक करके या तो समय से सबसेट जेनरेट करें (उदाहरण के लिए, पहली बार बिंदु पर पूर्ण जेड-स्टैक देखना) या गहराई से (उदाहरण के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर पहले 50 जेड-अनुभागों को देखना) । ढेर। उपकरण। सबस्टैक बनाओ।

7. ब्रैनबोइन छवियों का मात्रात्मक क्लोनल रंग विश्लेषण

  1. फिजी में रुचि की कोशिकाओं के लिए मतलब लाल, हरे और नीले (आरजीबी) तीव्रता मूल्यों को मापें।
    नोट:     ये निर्देश फिजी में छवि विश्लेषण के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, शोधकर्ताओं ने एक वैकल्पिक सॉफ्टवेयर कार्यक्रम में मतलब RGB तीव्रता मूल्यों को प्राप्त करने के लिए पसंद कर सकते हैं ।
    1. सुनिश्चित करें कि फ़ाइल सही ढंग से फसली है ताकि छवि के किनारों के आसपास कोई काला स्थान न हो। काला स्थान कृत्रिम रूप से विश्लेषण के लिए आवश्यक न्यूनतम तीव्रता माप को कम करेगा। यदि फ़ाइल को क्रॉप करने की आवश्यकता है, तो आयत चयन बटन का चयन करें और सभी काले स्थान को छोड़कर, देखने के क्षेत्र के आसपास ब्याज (आरओआई) का क्षेत्र खींचें। क्लिक करें छवि। फसल।
    2. मतलब, न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य माप लेने के लिए माप उपकरण सेट करें। क्लिक करें विश्लेषणकरें । माप निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि मिन और मैक्स ग्रे वैल्यू के लिए चेकबॉक्स और मीन ग्रे वैल्यू दोनों चयनित हैं।
    3. फिजी में कच्चे डेटा फ़ाइलों या सबसे सेट जेड-स्टैक को देखते हुए, क्लोनल रंग विश्लेषण के लिए ब्याज की कोशिकाओं को ढूंढें। हिंदब्रेन में, ख्यात क्लोन को उनके साझा रंग के साथ-साथ उनके रेडियल ओरिएंटेशन द्वारा नेत्रहीन पहचाना जा सकता है। उन कोशिकाओं का चयन न करें जो निकट संपर्क में हैं, और इस प्रकार किसी अन्य रंग की पड़ोसी कोशिकाओं से हल करना मुश्किल है। ऐसे में उनकी छटा का अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है।
    4. जेड-स्क्रॉलबारका उपयोग करके ब्याज की सेल के केंद्र जेड-प्लेन का पता लगाएं। ओवल सेलेक्शन बटन पर राइट-क्लिक करें और एलिप्टिकल सेलेक्शन बटनका चयन करें । अन्य चयन उपकरण विभिन्न सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त होंगे। सेल शरीर के केंद्रीय ~ 2/3 के चारों ओर एक अंडाकार आरओआई ड्रा करें।
    5. सी-स्क्रॉलबारका उपयोग करके, लाल (dTomato) चैनल का चयन करें। विश्लेषणका चयन करके इस चैनल के लिए मतलब तीव्रता माप लें । उपाय। हरे (वाईएफपी) और ब्लू (सीएफपी) चैनलों के लिए एक ही आरओआई और फोकल प्लेन के साथ दोहराएं और सभी मतलब तीव्रता मूल्यों को बचाएं।
    6. ब्याज की सेल में अंडाकार आरओआई को हटाने के लिए छवि पर कहीं भी क्लिक करें।
    7. सामान्यीकरण के लिए पृष्ठभूमि के स्तर को मापने के लिए, सी-स्क्रॉलबार का उपयोग करें और लाल (dTomato) चैनल का चयन करें। विश्लेषणका चयन करके इस चैनल में पूरे क्षेत्र के लिए न्यूनतम तीव्रता माप लें। उपाय। हरे (वाईएफपी) और ब्लू (सीएफपी) चैनलों के लिए एक ही फोकल प्लेन के साथ दोहराएं और सभी न्यूनतम तीव्रता मूल्यों को बचाएं।
  2. ब्याज की कोशिकाओं के लिए सापेक्ष आरजीबी चैनल वजन की गणना करें।
    नोट:     इन तीव्रता मूल्यों से सापेक्ष आरजीबी चैनल वजन की गणना माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या आर43जैसे विभिन्न सॉफ़्टवेयर कार्यक्रमों में की जा सकती है।
    1. उस चैनल और फोकल प्लेन में पूरे क्षेत्र से न्यूनतम तीव्रता को घटाकर प्रत्येक चैनल के लिए सेल आरओआई की औसत तीव्रता माप को सामान्य करें।
    2. सेल के लिए कुल सामान्यीकृत आरजीबी तीव्रता खोजने के लिए प्रत्येक चैनल से सामान्यीकृत मतलब आरजीबी तीव्रता मूल्यों का योग करें।
    3. कुल सामान्यीकृत आरजीबी तीव्रता द्वारा उस चैनल के लिए सामान्यीकृत औसत तीव्रता मूल्य को विभाजित करके प्रत्येक चैनल के लिए सापेक्ष चैनल वजन की गणना करें।
  3. आर43,44के लिए टर्नरी पैकेज का उपयोग करते हुए टर्नरी भूखंडों के रूप में सापेक्ष आरजीबी चैनल वजन प्रदर्शित करें। टर्नरी प्लॉट 3डी आरजीबी स्पेस में समान रंगों के क्लस्टरिंग की कल्पना करने के लिए उपयोगी हैं।
  4. सेल रंगों के बीच अंतर की मात्रा निर्धारित करने के लिए रंग प्रसार गुणांक की गणना करें।
    1. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके 3डी आरजीबी स्पेस में दो रंगों के बीच यूक्लिडियन दूरी की गणना करें:
      Equation 1
      जहां आर, जी और बी सापेक्ष आरजीबी चैनल वजन 7.2 में गणना कर रहे हैं।
    2. समझ ने आसानी के लिए, 0 और 1 के बीच एक रंग प्रसार गुणांक प्राप्त करने के लिए , रंगों के बीच अधिकतम संभव दूरी , √ 2 द्वारा विभाजित करके रंग की दूरी को सामान्य करें, जहां 0 बिल्कुल एक ही रंग इंगित करता है और 1 पूरी तरह से अलग रंगों को इंगित करता है (उदाहरण के लिए, शुद्ध लाल और शुद्ध नीला)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यह अनुभाग उन परिणामों के उदाहरण दिखाता है जिन्हें यहां वर्णित वीवो मल्टीकलर टाइम-लैप्स इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। हम बताते हैं कि विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन14 (चित्रा 1)के प्रसारवेंज वेंट्रिकुलर क्षेत्र में कोशिकाओं के इंद्रधनुष रंग-कोडित क्लोन।

आमतौर पर, जब एक विशेष रेडियल फाइबर के साथ ब्रैनबो लेबल वाली कोशिकाओं की व्यवस्था की जाती थी, तो उन्होंने एक ही रंग(चित्रा 1डी)साझा किया, जिसे सापेक्ष आरजीबी चैनल वजन(चित्रा 1E)के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। इससे पता चलता है कि ये रेडियल समूह कोशिकाओं को विभाजित करने के क्लोन थे और उनके समान रंग का उपयोग उन्हें क्लोनल रूप से संबंधित होने के रूप में पहचानने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि जेब्राफिश, माउस और चिक14,,15में पिछले अध्ययनों में मनाया गया था। जब ब्रैनरेन लेबलिंग घनत्व अपेक्षाकृत विरल होता है, तो इस रंग-कोडिंग का उपयोग जीवित कशेरुकी मस्तिष्क के प्रसार क्षेत्रों के भीतर कई अलग-अलग रेडियल क्लोन को स्पष्ट रूप से कल्पना करने और ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है।

एक मात्रात्मक रंग विश्लेषण से पता चला है कि बेटी कोशिकाओं को अपनी मां (जनक) सेल(चित्रा 1F)के रूप में एक ही रंग व्यक्त किया है, लेकिन है कि कोशिकाओं के पड़ोसी रेडियल समूहों एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकताहै 11 (चित्रा 1E)। इसका मतलब यह है कि संबंधित कोशिकाओं के कई क्लोन एक साथ वीवो(चित्रा 2)में घंटे से अधिक का पालन किया जा सकता है, एक मल्टीप्लेक्स वंश विश्लेषण और तुलना के लिए अनुमति देता है । क्लोन में रंग अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण 2 डीपीएफ पर और फिर 3 डीपीएफ(चित्रा 2ए-बी)पर पता चला कि बोरेन अभिव्यक्ति भी वीवो11में 2-3 दिनों से अपेक्षाकृत स्थिर रही। इस प्रकार व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है और विकास के दौरान अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए वास्तविक समय में ट्रैक किया जा सकता है।

समय-चूक इमेजिंग ने 1-2 डीपीएफ(चित्रा 2सी-एफ)11,सेल चक्र के अध्ययन की अनुमति देने की अवधि के दौरान इंटरकाइनेटिक परमाणु प्रवास और सेल डिवीजन से गुजरने वाली कई कोशिकाओं का पता चला। 30 मिन के समय-चूक अंतराल का उपयोग करते हुए, हमने सेल डिवीजन के दौरान हमेशा माइटोटिक फिगर को कैप्चर नहीं किया। इसने सेल डिवीजन के सौंपे गए समय में 30 मिन तक की संभावित त्रुटि शुरू की। इसके अतिरिक्त, हमने दो जनक कोशिकाओं (जैसे, चित्रा 2F)को शामिल करने के लिए दिखाई देने वाले कुछ क्लोन देखे। इन बाधाओं के भीतर, कोशिका चक्र की लंबाई को मापा जा सकता है। समय के साथ व्यक्तिगत इंद्रधनुष लेबल वाले जनकों को ट्रैक करके हमने 8.4 ± 1.5 घंटे के औसत सेल चक्र की गणना की, जो जेब्राफिश1,,45,,46में पिछले मापों के बराबर है। इसके अलावा, ब्रैनबोटाइम-लैप्स इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके, हम एपोप्टोसिस(चित्रा 3)11,जैसे झिल्ली ब्लबिंग और सेल विखंडन47,,48से जुड़े टकसाली रूपात्मक परिवर्तनों से गुजर ने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं का निरीक्षण करने में भी सक्षम थे।

Figure 1
चित्रा 1: ब्रैनसन ने विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन में कोशिकाओं को विभाजित करने के क्लोनली संबंधित समूहों को लेबल किया। (A)एचएसपी की योजनाबद्ध: जेब्राबो (ब्रैनबो) डीएनए क्षणिक रूप से रंग-कोड क्लोन के लिए व्यक्त किया जाता है। (ख)वीवो में 1 और 2 डीपीएफ पर जेब्राफिश विकसित करने की प्रकाश छवियां प्रेषित; तीर इमेजिंग के लिए लक्षित सामान्य हिंदब्रेन क्षेत्र का संकेत देते हैं। भ्रूण की पारदर्शिता प्रत्येक मछली के नीचे रखे एक माइक्रोमीटर द्वारा प्रदर्शित की जाती है। प्रायोगिक टाइमलाइन में एक-सेल चरण में इंजेक्शन दिखा, 24 एचपीएफ पर हीट शॉक (एचएस) और 1-3 डीपीएफ से इमेजिंग। (ग)29 एचपीएफ जेब्राफिश हिंदब्रेन का पृष्ठीय दृश्य जो बोरेन के साथ लेबल किया गया है । प्रेषित प्रकाश चैनल ने 165 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करने वाले इंद्रधनुष-लेबल वाले क्लोन की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के साथ हिंदब्रेन और वेंट्रिकल की आकृति विज्ञान को दिखाया। रोस्ट्रल ऊपर है । (घ)हिंदब्रेन में वीवो बोइंद्रधनुष अभिव्यक्ति में, अधिकतम तीव्रता अनुमानों में दिखाया गया है जो विरल लेबल 51 एचपीएफ जेब्राफिश(डी1)में 41 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है, और 63.5 एचपीएफ जेब्राफिश(डी2)में 81 माइक्रोन है। दोनों पैनलों में, पृष्ठीय ऊपर है और रोस्ट्रल बाईं ओर है। (ई)डी1 और डी2 में कोशिकाओं के रंग को इसी टर्नरी भूखंडों (एन = 54 कोशिकाओं ई1;461 कोशिकाओं ई2)में सापेक्ष चैनल वजन के रूप में निर्धारित किया गया था। (एफ)सेल डिवीजन के बाद बेटी कोशिकाओं में सेल रंग अपेक्षाकृत स्थिर रहा। 29 एचपीएफ बोरेन-लेबल जेब्राफिश पर 1 एच(एफ1,अधिकतम तीव्रता अनुमानों, 30 माइक्रोन गहराई) के हिंदब्रेन में वीवो माइटोटिक घटनाओं में दिखा समय बिंदुओं की श्रृंखला। एफ1में काले बक्से द्वारा इंगित मां और बेटी कोशिकाओं का रंग, एफ2में टर्नरी प्लॉट में सापेक्ष चैनल वजन के रूप में दर्शाया गया है। इनसेट कसकर संकुल सेल रंग दिखाने के लिए एक ही साजिश का एक ज़ूम दिखाता है (एम मां है; डी1 और डी2 30 min/चौकों पर बेटियां हैं, और ६० मिन/त्रिकोण) । स्केल बार = 30 माइक्रोन (सी), 20 माइक्रोन (डी1),16 माइक्रोन (डी2),और 5 माइक्रोन (एफ1)। सी, डी और एफ में, dTomato लाल के रूप में कोडित है, YFP हरे रंग के रूप में कोडित है, और CFP नीले रंग के रूप में कोडित है । छवियां बिज्जू एट अल11से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बोरेन रंग-कोडिंग के साथ संयुक्त वीवो इमेजिंग में समय-चूक अंतरकाइनेटिक परमाणु प्रवास और विभाजन के दौर से गुजर ने वाली कोशिकाओं के कई पड़ोसी क्लोन प्रतिष्ठित हैं। (A)2 डीपीएफ (55 एचपीएफ) पर ब्रैनसन व्यक्त करने वाली एक मछली के हिंदब्रेन में लेबल किए गए रंग-कोडित रेडियल क्लस्टर; एक1)और 3 डीपीएफ (71 एचपीएफ; एक2); अधिकतम तीव्रता अनुमान क्रमशः 62 माइक्रोन और 47 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक समय बिंदु पर तीन रंग-कोडित रेडियल समूहों की पहचान की जाती है। (ख)ए1 और ए2 में सभी इंद्रधनुष लेबल वाली कोशिकाओं का रंग बी 1 और बी2 (एन = 106 कोशिकाओं, 119 कोशिकाओं) में इसी टर्नरी भूखंडों में सापेक्ष चैनल वजन के रूप में निर्धारित किया गया था।2 (C)ब्रैनबोरेन (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण 24 माइक्रोन दिखा) के साथ लेबल 35 एचपीएफ पर जेब्राफिश हिंदब्रेन; धराशायी सफेद बॉक्स के साथ इंगित इनसेट पहली बार डी(डी)सी से हिंदब्रेन में 30 मिन अंतराल पर लिए गए समय बिंदुओं की श्रृंखला में प्रदर्शित बिंदु है । 9.5 घंटे की अवधि दिखाई गई है। लेबल कोशिकाओं को अंतरकाइनेटिक परमाणु प्रवास से गुजरना पड़ा; सफेद तीर सिर एपिकल सतह पर एक कोशिका का संकेत देते हैं। एपिकल सतह पर कोशिका सोमा की गोलाई और क्लोन संख्या (उदाहरण के लिए, 5.5 घंटे में लाल कोशिका और फिर 8 घंटे) में इसी वृद्धि को एक माइटोटिक घटना माना जाता था। (ई)ब्रैनइंद्रधनुष के साथ लेबल किए गए 30.5 एचपीएफ पर जेब्राफिश हिंदब्रेन का डोरसोलेटरल दृश्य, जहां सफेद धराशायी और बिंदीदार रेखा सिर की अनुमानित सीमा दिखाती है, और सफेद धराशायी बॉक्स ई से हिंदब्रेन में 30 मिन अंतराल पर ली गई एफ(एफ)श्रृंखला के पहली बार बिंदु में दिखाए गए इनसेट को इंगित करता है। 1.5 घंटे की अवधि में, सफेद अरोहेड्स द्वारा इंगित दो नीली कोशिकाओं को एपिकल सतह पर जाते हुए और माइटोसिस से गुजरते हुए देखा जा सकता है, जिसमें दो जनक कोशिकाओं वाले क्लोन का सुझाव दिया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन (ए), 25 माइक्रोन (सी), और 20 माइक्रोन (एफ)। ए-डी में पृष्ठीय ऊपर है और रोस्ट्रल बाईं ओर है । ई और एफ में, रोस्ट्रल बाईं ओर है। सभी छवियों में, dTomato लाल के रूप में कोडित है, YFP हरे रंग के रूप में कोडित है, और CFP नीले रंग के रूप में कोडित है । छवियां बिज्जू एट अल11से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: समय चूक Bइंद्रधनुष इमेजिंग वेंट्रिकुलर क्षेत्र में कोशिकाओं को दिखाता है वीवो में सेल मौत से गुजरना । (A)ब्रैनबोरेन (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण 36 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व) के साथ लेबल 31 एचपीएफ पर जेब्राफिश हिंदब्रेन। सफेद धराशायी बॉक्स बी(बी)समय अंक की श्रृंखला में पहली बार बिंदु में दिखाया इनसेट इंगित करता है 30 मिन अंतराल पर ए में हिंदब्रेन दिखा । पहले पैनल में सफेद तीर एक लैवेंडर सेल दिखाता है जिसे बाद के पैनलों में दिखाया गया है, जो कोशिका विखंडन द्वारा इंगित किया गया है जिसके बाद अपोप्टिक निकायों की क्रमिक निकासी होती है। पड़ोसी लेबल कोशिकाओं भर में स्वस्थ दिखाई दिया । पृष्ठीय ऊपर है और रोस्ट्रल बाईं ओर है । स्केल बार = 20 माइक्रोन (बी)। सभी छवियों में, dTomato लाल के रूप में कोडित है, YFP हरे रंग के रूप में कोडित है, और CFP नीले रंग के रूप में कोडित है । छवियां बिज्जू एट अल11से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के क्लोन की कल्पना करने की एक विधि का वर्णन करता है और बोइंद्रधनुष और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11का उपयोग करके वीवो में उनका अनुसरण करता है। इन विट्रो या पूर्व वीवो अध्ययनों की तुलना में इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ समय के साथ अपने प्राकृतिक परिवेश में कशेरुकी मस्तिष्क के प्रसार क्षेत्र का सीधे निरीक्षण करने की क्षमता है। यह तकनीक पिछले अध्ययनों पर बनाता है जो रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग करके एक क्लोन लेबल करते हैं। इसके विपरीत, एचएसपी:जेब्राबो का उपयोग रंग-कोड कई क्लोन का निर्माण एक साथ करता है, जिससे मल्टीप्लेक्स वंश ट्रेसिंग और क्लोन11के बीच गतिशीलता पर ध्यान केंद्रित होता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रणालियों या सेल प्रकारों में विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जेब्राफिश भ्रूण में विभिन्न इंद्रधनुष निर्माण व्यक्त किए जा सकते हैं। एचएसपीमें जेब्राफिश hsp70 प्रमोटर का उपयोग: जेब्राबो के परिणामस्वरूप तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स11सहित गर्मी सदमे के बाद विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों की पच्चीकारी लेबलिंग होगी, और शोधकर्ताओं को जीन अभिव्यक्ति29पर अस्थायी नियंत्रण देता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हीट शॉक प्रमोटर का उपयोग लगातार रंग-कोडित क्लोन लेबल करता है, जबकि अन्य प्रमोटर इस तरीके से सेल वंश को स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं कर सकते हैं। जब क्लोनल पहचान ब्याज का कारक नहीं है, तो अन्य प्रमोटरों का उपयोग करने वाले निर्माणों का उपयोग विशिष्ट सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, न्यूरोडी प्रमोटर का उपयोग अपरिपक्व न्यूरॉन्स18,,49लेबल करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोइंजेक्शन प्रदर्शन करने के बजाय, शोधकर्ता ट्रांसजेनिक ब्रूरेन जेब्राफिश का उपयोग करने का चयन कर सकते हैं, जिसमें टीजी (यूबीआई: जेब्राबो)15 और टीजी (न्यूरोडी: जेब्राबो)18जैसी लाइनें शामिल हैं। इस मामले में, टीजी (एचएसपी: क्रेa134))15जैसे क्रे रिकॉम्बिनेज़ को व्यक्त करने वाली लाइनों को पार करता है, अइंजेक्शन भ्रूण का उत्पादन करता है जिसे समान तरीके से एकत्र और बनाए रखा जाता है। हालांकि यह प्रोटोकॉल 1-3 डीपीएफ के बीच मछली की छवि बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, ताकि विकासात्मक न्यूरोजेनेसिस50की प्रमुख अवधि के साथ मेल करने के लिए, जेब्राफिश को ब्याज के विकास के चरण के आधार पर लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है। हालांकि, 24 एचपीएफ से पहले ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए गर्मी का झटका भ्रूण51के लिए अधिक हानिकारक हो सकता है। उम्र और ब्याज के ऊतकों के आधार पर, विभिन्न बढ़ती रणनीतियों को लक्षित ऊतक सही ढंग से उन्मुख करने के लिए उपयुक्त होगा।

ऐसे कई कदम हैं जिन्हें समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, विशेष रूप से यदि प्रोटोकॉल में संशोधन किए जाते हैं। डीएनए की एकाग्रता, बोलस आकार इंजेक्शन, और भ्रूण प्रति दिया डीएनए की कुल राशि सभी अगर Bइंद्रधनुष अभिव्यक्ति मंद या विरल है या अगर भ्रूण स्वस्थ दिखाई नहीं देते समायोजित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि वांछित अभिव्यक्ति प्राप्त नहीं होती है तो हीट शॉक स्टेप की लंबाई और समय को संशोधित किया जा सकता है। इमेजिंग में उपयोग किए जाने वाले अधिग्रहण पैरामीटर लेजर लाइनों और उपलब्ध फिल्टरके साथ-साथ अभिव्यक्ति की चमक, बढ़ते और वांछित विश्लेषण के प्रकार के आधार पर भिन्न होंगे। इसके अतिरिक्त, समय-चूक मापदंडों को ब्याज की घटनाओं की गति के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए और एक जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए समय की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक अगारोज में मछली का उचित बढ़ते है: यदि मछली का कोण अनुचित है या यदि मछली बहुत अधिक agarose द्वारा कवर किया जाता है, इष्टतम इमेजिंग संभव नहीं होगा । इस तकनीक को अनुकूलित करने से कुछ अभ्यास हो सकता है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग से पहले कई मछलियों को माउंट करना अक्सर उपयोगी होता है क्योंकि यह पता लगाना मुश्किल हो सकता है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर एफपी अभिव्यक्ति देखने से पहले बढ़ते हुए उपयुक्त है या नहीं। एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम विशिष्ट मछली की स्क्रीनिंग और चयन को इमेज्ड किया जाना है। यदि माइक्रोइंजेक्शन, चमक, लेबलिंग घनत्व, और बोरेन कॉपी संख्या प्रदर्शन कर रहे हैं तो सभी मछली के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। मंद लेबलिंग, अत्यधिक घने लेबलिंग, या एक कम प्रतिलिपि संख्या के साथ मछली में लिया छवियों का विश्लेषण करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम लगातार 16 घंटे11तक जेब्राफिश रहने वाले छवि करने में सक्षम है । समय की यह लंबाई इमेजिंग चैंबर से E3 वाष्पीकरण, इमेजिंग के विमान से मछली के विकास, मछली की मृत्यु या मछली के आंदोलन, या confocal माइक्रोस्कोप समय पर उपयोगकर्ता मजबूरी से सीमित किया जा सकता है । माइक्रोस्कोप चरण पर तापमान नियंत्रित सहायक के उपयोग से वाष्पीकरण को कम किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न 5D डेटासेट बड़ी फाइलें होती हैं जिन्हें महत्वपूर्ण हार्ड ड्राइव स्पेस (उदाहरण के लिए, एक रात के समय-चूक के लिए ~ 100 जीबी तक) और विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त कंप्यूटिंग शक्ति की आवश्यकता होती है।

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को विकासशील जेब्राफिश मस्तिष्क में तंत्रिका जनक और बेटी न्यूरॉन्स की आबादी के भीतर रंग-कोडित क्लोन की कल्पना करने और समय के साथ उनकी गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए मार्गदर्शन करता है। एक संभावित विस्तार विकास18में विशिष्ट जीन की भूमिकाओं का आकलन करने के लिए दूर-लाल एफपी टैगिंग के साथ ब्रूरेन टाइम-लैप्स इमेजिंग का संयोजन है। इस तरह, हेरफेर जीन व्यक्त क्लोन एक अलग रंग में कल्पना की जा सकती है, समय के साथ ट्रैक, और Bइंद्रधनुष लेबल, गैर हेरफेर पड़ोसी क्लोन की तुलना में । वीवो मल्टीकलर इमेजिंग में तंत्रिका तंत्र कैसे रूपों और कार्यों के बारे में महत्वपूर्ण यंत्रवादी सवालों को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी और बौद्धिक योगदान के लिए वाई ए पैन, जे Livet और जेड Tobias का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (अवार्ड 1553764) और एमजे मुर्डॉक चैरिटेबल ट्रस्ट ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip) Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Tags

विकासजीव विज्ञान अंक 157 माइक्रोस्कोपी तंत्रिका विज्ञान विकास इंद्रधनुष जेब्राफिश वंश ट्रेसिंग वीवो इमेजिंग मस्तिष्क हिंदब्रेन सेल डिवीजन में
ब्रूरेन और टाइम-लैप्स कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके ज़ेब्राफिश में विकासशील मस्तिष्क की कल्पना करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cook, Z. T., Brockway, N. L.,… More

Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter