Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

Published: March 23, 2020 doi: 10.3791/60593
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Lewis & Clark College

Summary

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

Abstract

يتطلب تطوير الجهاز العصبي الفقاري تنسيقًا دقيقًا للسلوكيات والتفاعلات الخلوية المعقدة. يمكن أن يوفر استخدام الدقة العالية في تقنيات التصوير الحي نافذة واضحة على هذه العمليات في الكائن الحي. على سبيل المثال، يمكن اتباع تقسيم الخلايا وذريتها في الوقت الحقيقي مع تشكل الجهاز العصبي. في السنوات الأخيرة، أدت التطورات التقنية في التقنيات متعددة الألوان إلى توسيع أنواع الأسئلة التي يمكن التحقيق فيها. يمكن استخدام نهج Brainbow متعدد الألوان ليس فقط للتمييز بين الخلايا الشبيهة ، ولكن أيضًا لرمز اللون متعدد المستنسخين المختلفين للخلايا ذات الصلة التي تستمد كل منها من خلية ذرية واحدة. وهذا يسمح لتحليل النسب متعددة من العديد من المستنسخين مختلفة وسلوكياتهم في وقت واحد أثناء التنمية. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى على مدى الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية. هذا مفيد بشكل خاص لمتابعة التفاعلات الخلوية بين الخلايا مثل، والتي يصعب تسمية بشكل تفاضلي باستخدام الألوان التقليدية التي يحركها المروج. يمكن استخدام نهجنا لتتبع علاقات النسب بين استنساخ مختلفة متعددة في وقت واحد. توفر مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية معلومات غنية يمكن مقارنتها كمًا عبر التلاعب الجيني أو الدوائي. في نهاية المطاف يمكن أن تساعد النتائج التي تم إنشاؤها في الإجابة على أسئلة منهجية حول كيفية تطور الجهاز العصبي.

Introduction

في المراحل المبكرة من التنمية، تنقسم برك الخلايا السلف المتخصصة بشكل متكرر في مناطق تكاثرية، وتنتج صفائف متنوعة من خلايا الابنة. الخلايا التي ولدت خلال هذه الفترة التنموية ثم التفريق والسفر لتشكيل الأعضاء الوليدة. في الجهاز العصبي، السلفمثل غليا شعاعي تؤدي إلى خلايا عصبية غير ناضجة في مناطق البطين. كما تهاجر الخلايا العصبية بعيدا عن البطينين وناضجة, الأنسجة توسيع يشكل في نهاية المطاف هياكل معقدة للغاية من الدماغ1,,2,,3,,4,,5,,6. التنسيق بين تقسيم السلف والتمايز وهجرة الخلايا العصبية سيحدد الحجم النهائي والشكل ، وبالتالي وظيفة الدماغ ، مما يؤثر بشكل مباشر على السلوك7،8،9،10. وفي حين أن الرقابة الصارمة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لتطور الدماغ الطبيعي، فإن الآليات العالمية التي تنظم هذه الديناميات ليست مفهومة جيداً. هنا نحن نصف أداة لدراسة تطور الجهاز العصبي في قرار الخلوية، مما يسمح للباحثين لتصور الخلايا السلف والخلايا العصبية في الجسم الحي في الدماغ حمار وحشي النامية مع Brainbow وتتبع سلوكهم مع مرور الوقت عن طريق المجهر confocal الفاصل الزمني11. ويمكن أيضا تكييف هذا النهج لتصور أجزاء أخرى من الجنين النامي.

لمراقبة والتمييز بين الخلايا في الدماغ الحمار الوحشي النامية، قمنا بتكييف تقنية تسمية خلايا بقوس قزح11. يستخدم Brainbow التعبير الجمعي المحدد عشوائيًا لثلاثة بروتينات فلورية متميزة (FPs) لتسمية مجموعة من الخلايا. في حين أن التعبير الافتراضي للتعبير Brainbow هو dTomato FP الأحمر ، إعادة التركيب بواسطة الإنزيم Cre recombinase النتائج في التعبير عن mCerulean (بروتين الفلورسنت السماوي ، CFP) أو البروتين الفلوري الأصفر (YFP)12،13. كمية مجتمعة من كل FP أعرب في خلية يعطيها هوى فريدة من نوعها، مما يسمح تمييز بصري واضح من الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك، عندما يقسم خلية السلف، كل خلية ابنة سوف ترث اللون من الخلية الأم، وإنتاج استنساخ مرمزة بالألوان والسماح للباحثين لتتبع نسب الخلية11،14. في حين تستخدم أصلا لتحليل الدوائر العصبية في الفئران12, وقد تم منذ Brainbow وأعرب في مجموعة واسعة من الكائنات الحية نموذج, بما في ذلك حمار وحشي15.

بنيت تقنيتنا على طرق التصوير والتصوير السابقة متعددة الألوان لتصوير العديد من النسخ المرمزة بالألوان بشكل مباشر بمرور الوقت في سمك الحمار الوحشي الحي. نظرا لشفافيتها البصرية كأجنة، والحمار الوحشي هي مناسبة تماما لتجارب التصوير16،وقد استخدمت الدراسات السابقة Brainbow في حمار وحشي لدراسة مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الجهاز العصبي11،,15،,17،,18،19،,20،,21،,22،,23،,24،,25،, , 26،27. القدرة على الصورة مباشرة في الكائن الحي، جنبا إلى جنب مع تطورها الرحمي السابق السريع، وجعل حمار وحشي نموذجا قيما للتنمية الفقارية. على النقيض من الدماغ الثدييات، والمنطقة التكاثرية بأكملها من hindbrain حمار وحشي هو متاح بسهولة للتصوير دون تعطيل لبيئتها الذاتية6. وهذا يسمح بإجراء التجارب في الكائن الحي، بدلا من في المختبر أو المستحضرات الأنسجة الثابتة. على النقيض من تجارب التصوير الثابتة ، في دراسات الجسم الحي تسمح بتصميم طولي ، وإنتاج ساعات من البيانات التي يمكن تحليلها للأنماط ، وبالتالي زيادة احتمال ملاحظة الأحداث النادرة نسبيًا. اعتمادا على سرعة وطول الأحداث ذات الاهتمام، قد يختار الباحثون لأداء قصيرة (1-2 ساعة) أو طويلة (تصل إلى ~ 16 ح) تجارب التصوير الفاصل الزمني. باستخدام مروج الصدمات الحرارية الحمار الوحشي 70 (hsp70، hsp)، يمكن التحكم في التعبير Brainbow مؤقتا28،29. بالإضافة إلى ذلك، التعبير الفسيفساء الناجمة عن هذا المروج هو مناسبة تماما لوضع العلامات وتتبع العديد من استنساخ11.

القدرة على التعرف بصريا استنساخ متعددة داخل الدماغ الحي هو ميزة من هذه الطريقة. الدراسات السابقة الهامة التي بحثت في دور استنساخ داخل تطوير الجهاز العصبي تستخدم ناقلات الفيروسات الرجعية لتسمية خلية ذرية واحدة وذريتها باستخدام FP واحد أو غيرها من البروتين تصور بسهولة. مثل هذه العلامات يسمح للباحثين لمراقبة استنساخ واحد مع مرور الوقت، إما في المختبر أو في الجسم الحي22،30، 31،,31,32،,33،34،,35،,36،,37،,38., على النقيض من أساليب لتتبع سلوك الخلايا داخل استنساخ واحد ، والألوان المتميزة من Brainbow تسمح للباحثين لمراقبة ديناميات بين استنساخ. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام Brainbow لتسمية العديد من المستنسخين داخل الدماغ، يتم جمع بيانات إضافية عن السلوك البرسيم نسبة إلى التقنيات التي تسمية استنساخ واحد11. والأهم من ذلك، يمكن توسيع النهج الموصوفة هنا لتوليد مقارنات تنموية بين الأسماك التي خضعت لتلاعبات جينية أو دوائية مختلفة18. وعموما، هذه المزايا تجعل الفاصل الزمني في التصوير البؤري في الجسم الحي من Brainbow التعبير عن سمك الحمار الوحشي مثالية للباحثين استكشاف تطوير الجهاز العصبي الفقارية، ولا سيما المهتمين في دور استنساخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرفق بالحيوان (IACUC) في كلية لويس وكلارك على الإجراءات المتعلقة بالمواد الحيوانية.

1. الحقن الدقيق لأجنة حمار وحشي

  1. إعداد نوع البرية، والحمار الوحشي الكبار في خزانات التزاوج الجنس المنفصلة بعد الظهر قبل إجراء الحقن المجهري39،40.
  2. إعداد حل الحمض النووي في الصباح من الحقن المجهرية. تمييع hsp:Zebrabow11 الحمض النووي البلازميد إلى تركيز ~ 10 نانوغرام / μL في 0.1 mM KCl، جنبا إلى جنب مع 2.5٪ فينول الأحمر و 3.75U الأنزيم Recombinase Cre.
  3. إجراء الحقن المجهري ة لمحلول الحمض النووي في أجنة حمار وحشي من خلية واحدة في غضون 45 دقيقة من الإخصاب39،41. حقن ما يقرب من 4.2 nL من هذا المحلول في كل جنين، أي ما يعادل ~ 42 pg من الحمض النووي البلازميد.
    ملاحظة: يمكن حذف خطوة الحقن المجهري إذا تم تزاوج خط حمار وحشي متحول وراثيا، Brainbow- يعبر عن خط بدلا من ذلك، مثل Tg (ubi:Zebrabow)15 و Tg (neurod:Zebrabow)18. يمكن أن يكون إجراء الحقن المجهري مفيدًا لأنه يسمح للباحثين بترقيم رقم النسخة وكثافة وضع العلامات. وعلاوة على ذلك، يمكن حقن بناء الحمض النووي الثاني الذي العلامات أو التلاعب منتج جيني معين جنبا إلى جنب مع Brainbow إذا رغبت في ذلك (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الحمراء البعيدة التي تكمل Brainbow18).
  4. الحفاظ على الأجنة عن طريق الحقن في أطباق بيتري من متوسط E339 في حاضنة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. صدمة الحرارة للحث على التعبير Brainbow

ملاحظة: إذا كان الحمض النووي البلازميد حقن أو transgene أعرب لا تستخدم hsp70 المروج لدفع التعبير، يمكن تخطي خطوة صدمة الحرارة، وينبغي نقل الأجنة صحية على الفور إلى الفينيلثيووريا (PTU) في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf).

  1. في 24 hpf، قتل الأجنة الميتة والمشوهة من مجموعة من الأجنة حقن. ثم، نقل الأجنة السليمة إلى أنبوب 50 مل، مع ما يصل إلى 20 جنين/ أنبوب.
  2. ملء الأنابيب مع 10 مل من E3. وضع غطاء على رأس كل أنبوب ولكن لا تغلق بإحكام.
  3. ضع رف الأنبوب الذي يحتوي على أنابيب 50 مل تستقيم في حمام مائي 37 درجة مئوية. تأكد من أن مستوى المياه في الحمام أعلى من مستوى E3 في الأنابيب وتركها لمدة 80 إلى 90 دقيقة.
  4. إزالة رف أنبوب مع الأجنة من حمام الماء والعودة إلى حاضنة 28 درجة مئوية تستقيم. السماح ما يصل إلى 1 ساعة لE3 لتبرد والأجنة لإعادة تكييف تدريجيا إلى درجة الحرارة. ثم، نقل الأجنة إلى أطباق بيتري من 0.2 mM PTU في E3 دافئة في الحاضنة لمنع تصبغ الأجنة.
    تنبيه: وحدة حرارية بريطانية هي مادة كيميائية سامة يجب التعامل معها بعناية والتخلص منها بشكل مناسب. ويقترح ارتداء قفازات.

3. فحص الأجنة للتعبير Brainbow

  1. في 2 إلى 4 ساعة بعد الصدمة الحرارية، فحص الأجنة تحت المجهر تشريح الفلورسال القياسية للتعبير عن CFP أو YFP، مما يشير إلى إعادة تركيبة قوس قزح ناجحة (من التعبير الافتراضي من dTomato).
    ملاحظة: إذا كانت هناك خيارات متعددة لتصفية الفلورسينس متاحة، فإن فحص CFP هو الطريقة الأكثر فعالية لتحديد الأسماك المؤمّرة بشكل جيد. إذا لم تتوفر فلاتر CFP و YFP ، فيمكن أيضًا تصور YFP بشكل خافت تحت فلاتر البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بسبب التداخل في ملفاتها الشخصية الطيفية.
  2. حدد الأجنة مع تعبير FP قوي في جميع أنحاء ونقل إلى طبق منفصل مع PTU. صورة الأجنة في يوم واحد بعد الإخصاب (dpf; 28 hpf أو في وقت لاحق) أو الحفاظ على الأجنة في وحدة حرارية بريطانية وصورة في 2 أو 3 dpf.

4. تركيب الأجنة في التصوير في فيفو

  1. قبل يوم التجربة، قم بإعداد غرفة التصوير وأداة التلاعب بالأجنة.
    1. قم بإعداد غرفة التصوير عن طريق لصق حلقة بلاستيكية بعناية إلى وسط طبق بيتري 60 مم.
    2. اختياريا، وإعداد المتلاعبين الأجنة حسب الطلب لنقل الأجنة داخل الطبق وتوجيه الأجنة أثناء تركيب. بناء المتلاعب عن طريق supergluing طول صغير من خط الصيد النايلون (~ 1/2 في، ~ 6 رطل) إلى نهاية عصا مسحة القطن الخشبية التي تم قطعها إلى ~ 4 في الطول.
  2. إذا لزم الأمر (أي التصوير في 2 dpf أو قبل ذلك) ، قبل تركيب الأجنة dechorionate باستخدام المحاقن تحت المجهر تشريح.
  3. تُسْكِنْ أجنة سمك الحمار الوحشي.
    1. ملء طبق بتري 60 ملم في منتصف الطريق مع E3 وإضافة 5-6 قطرات من 4 ملغ / مل MS-222 Tricaine-S إلى تركيز النهائي من ~ 0.2 mM. دوامة لخلط.
      تنبيه: وينبغي التعامل مع الترايكاين بعناية والتخلص منها بشكل مناسب.
    2. نقل الأجنة من وحدة حرارية بريطانية إلى محلول الترايكين، وضمان نقل أقل وحدة حرارية بريطانية قدر الإمكان. في حين أن ردود الفعل الأسماك ينبغي أن تتوقف بعد 1-2 دقيقة, ترك الأجنة في الترايكين لمدة تصل إلى 10 دقيقة لضمان إجراء عمليات تصوير دقيقة لتجارب التصوير الفاصل الزمني.
    3. تأكد من أن الأجنة هي بُسْنِيبشكل صحيح. تقييم منعكس الانفعال من خلال لمس ذيول الجنين بلطف مع المتلاعب الجنين. إذا لوحظت حركة منعكسة، أضف قطرة إضافية من الترايكين إلى الطبق بعيدًا عن الأجنة قدر الإمكان وتدور لتختلط. مراقبة معدل ضربات قلب الجنين تحت نطاق تشريح. إذا كان بطيئا بشكل غير طبيعي، إضافة قطرات إضافية من E3 إلى الطبق للحد من تركيز الترايكين.
  4. جبل الأجنة التي تُسجّب في أغاروز.
    1. نقل الأسماك إلى مركز حلقة بلاستيكية داخل غرفة التصوير وإزالة أكبر قدر ممكن من فائض E3 باستخدام ماصة نقل ذات رؤوس غرامة.
    2. باستخدام ماصة نقل نظيفة، وتغطي الأسماك مع 1.0٪ agarose منخفضة الذائبة (LMA) في E3 المخزنة في 42 درجة مئوية وملء حلقة بلاستيكية كاملة مع طبقة رقيقة من agarose. استخدام ماصة نقل لسحب بلطف الأجنة حتى في طرف ماصة والعودة إلى agarose دون إدخال فقاعات الهواء.
    3. قبل أن يصلب الاغاروز، استخدم سريعًا متلاعبًا بالجنين لتوجيه الأسماك بشكل مناسب. إذا كان التصوير بمجهر منتصب، ضع الأجنة على مقربة من السطح العلوي للأغاروز قدر الإمكان. وضع الأجنة موازية لالجزء السفلي من غرفة التصوير مع الذيل على التوالي.
      ملاحظة: بالنسبة لتصوير الدماغ الخلفي، يمكن وضع الأجنة في عرض الظهر أو الترهل. وينبغي الحرص على ضمان أن رؤوس الأجنة لا تغرق في حين أن agarose لا يزال السائل. قد تكون الاتجاهات الأخرى مناسبة لاستهداف الأنسجة النامية الأخرى للتصوير. لمجاهر مقلوبة، سيتم تركيب بشكل مختلف، وعادة وضع الأسماك بالقرب من الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج القاع.
  5. انتظر حتى تصلب agarose ، ثم ملء غرفة التصوير مع E3. إضافة أكبر قدر ممكن E3 لحساب التبخر على مدى التصوير.

5. الوقت الفاصل بين التصوير من تطوير الحمار الوحشي Hindbrain

  1. ضع غرفة التصوير على المجهر البؤري استعداداً للتصوير.
    1. ضع غرفة التصوير مع السمك وE3 على المجهر البؤري.
    2. حدد هدفًا ذو فتحة عددية عالية ومسافة عمل طويلة، مثل هدف غمر الماء 20x (1.0 NA).
    3. ابحث عن منطقة ذات علامات كثيفة ومشرقة مناسبة لنوع الخلية (الخلايا) ذات الأهمية.
      ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام مرحلة/جهاز يتم التحكم في درجة حرارته على المجهر لتنظيم درجة الحرارة والرطوبة خلال جلسات التصوير الطويلة. وهذا يمكن أن يقلل من التبخر.
  2. إعداد معلمات الاستحواذ لتصوير Brainbow.
    1. صورة كل قناة FP بالتسلسل. إذا كان استخدام برنامج تجاري (على سبيل المثال، برنامج Zen)، يتم ذلك من خلال إعداد ثلاثة "مسارات". استخدام ليزر الأرجون لإثارة CFP في 458 نانومتر وYFP في 514 نانومتر. استخدام ليزر DPSS 561 نانومتر لإثارة dTomato. جمع الانبعاثات بين 463-509 نانومتر لCFP، 519-555 نانومتر لYFP، و 566-691 نانومتر لdTomato.
    2. للعرض على الشاشة، رمز CFP كما الأزرق، YFP كما الأصفر، وdTomato كما الأحمر.
      ملاحظة: تختلف هذه الإعدادات اعتمادًا على خطوط الليزر والميزات الأخرى المتوفرة على المجهر المحوري. لزيادة سرعة التصوير، يمكن تصوير قنوات CFP وdTomato في وقت واحد دون نزيف ملموس من خلال. إذا كان يتم أيضًا صورة FP منفصل، مثل FP أحمر بعيد، يمكن صورة هذا بشكل تسلسلي أو متزامن مع YFP.
    3. قم بإعداد معلمات التصوير العامة لالتقاط صور 16 بت بدقة لا تقل عن 1024 × 1024 ومتوسط مرتين. ضبط التكبير اعتمادا على المنطقة ونوع الخلية من الفائدة (أي لتصوير الدماغ الخلفي مع هدف 20x سوف تتراوح التكبير من 1.0-2.5). تعظيم مجال الرؤية للسماح لنمو الأسماك مع مرور الوقت.
    4. عرض مسار واحد في وقت واحد (وإيقاف تشغيل الليزر الأخرى لمنع التبييض الضوئي)، وتحسين إعدادات الاستحواذ لكل FP على حدة (على سبيل المثال، قوة الليزر، وحجم الثقب، وكسب أنبوب مضاعف ضوئي، الخ).
    5. حدد نطاق Z-stack إلى الصورة.
      ملاحظة: لجلسات التصوير الطويلة (>2 ح)، تأخذ في الاعتبار أن الأسماك سوف تستمر في النمو طوال فترة التصوير، وبالتالي فإن كل من حقل XY ومجموعة Z-المكدس يجب أن تأخذ في الاعتبار هذا مع مساحة إضافية. إذا كان تصوير الدماغ الخلفي، وتشمل مساحة في الميدان للأنسجة لنقل rostrally خلال فترة التصوير. كما يلزم إدراج حيز للنمو في البعد Z. تضمين في الصورة ما يقرب من 10-20 ميكرومتر فوق المنطقة ذات الاهتمام، ما إذا كانت الأسماك موقعة للعرض المترهل أو الظهري.
  3. إعداد معلمات للتصوير الفاصل الزمني.
    1. حدد فاصلًا زمنيًا. يتراوح طول الفاصل الزمني بين 10-30 دقيقة لتتبع الأحداث الميطية والمبرمجة في الدماغ الخلفي النامي. يختلف طول الفاصل الزمني اعتمادًا على سرعة الأحداث ذات الأهمية والوقت الإجمالي المستغرق لالتقاط مكدس Z واحد.
    2. حدد طول جلسة التصوير. جلسات التصوير الفاصل الزمني تحدث عادة بين عشية وضحاها ويمكن أن تستمر على الأقل 16 ساعة.
  4. تشغيل التجربة.
    ملاحظة:     يمكن قتل السمك مباشرة بعد التصوير أو تشريحها بعناية من agarose باستخدام المحاقن وإعادتها إلى E3 للتعافي. ثم يمكن صورة الأسماك المستردة مرة أخرى في وقت لاحق، على الرغم من أن موقف الخلية وعمقها سوف تتحول خلال هذه الفترة بسبب النمو العام.

6. إدارة الملفات الفاصل الزمني

  1. استيراد ملف الصورة إلى برنامج التحليل.
    1. إذا كنت تستخدم برنامج Zen، احفظ الملف بتنسيق .czi بمجرد اكتمال الحصول على الصورة. تأكد من حفظ البيانات الخام في شكل متوافق مع فيجي42 و / أو غيرها من البرامج.
    2. الاستيراد إلى البرمجيات فيجي باستخدام BioFormats المستورد.
      ملاحظة: ستكون ملفات الفاصل الزمني كبيرة ويمكن أن تتطلب كميات كبيرة من الوقت والذاكرة لفتحللتحليل. وبالتالي، فمن المفيد أن تكون استراتيجية في كيفية حفظها وفتحها. يمكن أن يكون من المفيد حفظ إصدار أقل جودة التي يمكن فتحها بسهولة أكبر للبحث عن الأحداث ذات الاهتمام بالعين.
  2. إذا كنت تستخدم فيجي، قم بإنشاء مجموعات فرعية أصغر وأكثر قابلية للإدارة من ملفات الفاصل الزمني. إنشاء مجموعات فرعية إما بالوقت (على سبيل المثال، عرض مكدس Z الكامل عند النقطة الزمنية الأولى) أو حسب العمق (على سبيل المثال، عرض أول 50 مقطعًا من Z في كل نقطة زمنية) بالنقر فوق الصورة| أكوام| أدوات| جعل substack.

7. تحليل اللون الكلوني الكمي من صور بقوس قزح

  1. قياس متوسط قيم كثافة الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) لخلايا الاهتمام في فيجي.
    ملاحظة:     هذه التعليمات خاصة بتحليل الصور في فيجي. ومع ذلك، قد يفضل الباحثون الحصول على قيم كثافة RGB المتوسط في برنامج برنامج بديل.
    1. تأكد من اقتصاص الملف بشكل صحيح بحيث لا توجد مساحة سوداء حول حواف الصورة. سوف الفضاء الأسود بشكل مصطنع خفض قياسات الحد الأدنى كثافة اللازمة للتحليل. إذا كان الملف بحاجة إلى اقتصاص، فحدد زر تحديد المستطيل ورسم منطقة ذات أهمية (ROI) حول حقل العرض، باستثناء كافة المساحة السوداء. انقر على صورة| المحاصيل.
    2. قم بتعيين أداة القياس لأخذ قياسات القيمة الرمادية اللئيمة والدنيا والقصوى. انقر فوق تحليل| تعيين القياسات. تأكد من تحديد خانات الاختيار لقيمة الحد الأقصى والرمادي والقيمة الرمادية المتوسطة.
    3. عرض ملفات البيانات الخام أو مجموعات فرعية Z-أكوام في فيجي، والعثور على خلايا ذات أهمية لتحليل الألوان clonal. في الدماغ الخلفي ، يمكن التعرف على المستنسخين المفترضين بصريًا من خلال هوىهم المشترك بالإضافة إلى اتجاههم الشعاعي. لا تحدد الخلايا التي هي على اتصال وثيق مع، وبالتالي من الصعب حل من، الخلايا المجاورة من لون آخر. قد يكون من الصعب تحديد هوى.
    4. العثور على مركز Z-الطائرة من الخلية ذات الفائدة باستخدام شريط Z-التمرير. انقر بزر الاختيار البيضاوي وحدد زر التحديد البيضاوي. ستكون أدوات التحديد الأخرى مناسبة لأنواع الخلايا المختلفة. رسم عائد الاستثمار بيضاوي الشكل حول المركزية ~ 2/3 من الجسم الخليوي.
    5. باستخدام شريط التمرير C،حدد القناة الحمراء (dTomato). خذ متوسط قياس الكثافة لهذه القناة عن طريق تحديد تحليل| قياس. كرر مع نفس العائد على الاستثمار والمستوى البؤري للقنوات الخضراء (YFP) والأزرق (CFP) وحفظ جميع قيم الكثافة المتوسطة.
    6. انقر في أي مكان على الصورة لإزالة عائد الاستثمار بيضاوي الشكل في خلية الاهتمام.
    7. لقياس مستويات الخلفية للتطبيع، استخدم شريط التمرير C وحدد القناة الحمراء (dTomato). خذ الحد الأدنى لقياس الكثافة للحقل بأكمله في هذه القناة عن طريق تحديد تحليل| قياس. كرر مع نفس المستوى البؤري للقنوات الخضراء (YFP) والأزرق (CFP) وحفظ جميع قيم الحد الأدنى للكثافة.
  2. حساب أوزان قناة RGB النسبية لخلايا الاهتمام.
    ملاحظة:     يمكن إجراء حساب أوزان قناة RGB النسبية من قيم الكثافة هذه في مجموعة متنوعة من البرامج، مثل Microsoft Excel أو R43.
    1. تطبيع متوسط قياس كثافة العائد على الاستثمار الخلية لكل قناة عن طريق طرح الحد الأدنى من كثافة من الحقل بأكمله في تلك القناة والمستوى البؤري.
    2. اجمع قيم كثافة RGB العادية من كل قناة للعثور على إجمالي كثافة RGB العادية للخلية.
    3. احسب وزن القناة النسبي لكل قناة عن طريق تقسيم قيمة الكثافة الوسطى العادية لتلك القناة على إجمالي كثافة RGB العادية.
  3. عرض الأوزان قناة RGB النسبية كمؤامرات ternary باستخدام حزمة Ternary لR43،44. المؤامرات ternary مفيدة لتصور تجميع ألوان مماثلة في مساحة RGB 3D.
  4. احسب معامل انتشار الألوان لتحديد الفرق بين ألوان الخلية.
    1. حساب المسافة الإقليدية بين اللونين في مساحة RGB 3D باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 1
      حيث R و G و B هي أوزان قناة RGB النسبية المحسوبة في 7.2.
    2. لسهولة الفهم، تطبيع مسافة اللون عن طريق تقسيم ها2 ، المسافة القصوى الممكنة بين الألوان ، للحصول على معامل انتشار اللون بين 0 و 1 ، حيث يشير 0 بالضبط نفس اللون و 1 يشير إلى ألوان مختلفة تمامًا (على سبيل المثال ، نقي الأحمر والأزرق النقي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح هذا القسم أمثلة للنتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام نهج التصوير الفاصل الزمني في الجسم الحي الموضح هنا. نظهر أن استنساخ Brainbow المرمزة بلون الخلايا في منطقة البطين التكاثري من الوحش الوحشي النامية14 (الشكل 1).

عادة، عندما تم ترتيب الخلايا المسماة بقوس قزح على طول ألياف شعاعية معينة، فإنها تشترك في نفس اللون(الشكل 1D)،والتي يمكن قياسها كأوزان قناة RGB النسبية(الشكل 1E). وهذا يشير إلى أن هذه المجموعات الشعاعية كانت استنساخ الخلايا المنقسمة وأنه يمكن استخدام لونها المماثل لتحديدها على أنها مرتبطة بشكل كلوني ، كما لوحظ في الدراسات السابقة في سمك الحمار الوحشي والفأر والفرخ14،15. عندما تكون كثافة تسمية Brainbow متناثرة نسبيًا ، يمكن استخدام ترميز الألوان هذا لتصور وتتبع العديد من المستنسخات الشعاعية المتميزة بوضوح داخل المناطق التكاثرية من الدماغ الفقاري الحي.

أظهر تحليل اللون الكمي أن خلايا الابنة عبرت عن نفس لون خلية الأم (السلف)(الشكل 1F)، ولكن يمكن تمييز المجموعات الشعاعية المجاورة من الخلايا عن بعضها البعض11 (الشكل 1E). وهذا يعني أنه يمكن اتباع العديد من المستنسخين من الخلايا ذات الصلة في وقت واحد على مدى ساعات في الجسم الحي(الشكل 2)، مما يسمح لتحليل النسب متعددة ومقارنة. القياس الكمي للتعبير اللون في استنساخ في 2 dpf ثم مرة أخرى في 3 dpf(الشكل 2A-B)أظهرت أن التعبير Brainbow كما ظلت ثابتة نسبيا من 2-3 أيام في الجسم الحي11. وبالتالي يمكن تحديد الخلايا الفردية وتتبعها في الوقت الحقيقي لفترات طويلة نسبيا من الزمن أثناء التنمية.

كشف التصوير الفاصل الزمني عن العديد من الخلايا التي تخضع للهجرة النووية البينية وتقسيم الخلايا خلال الفترة من 1-2 dpf(الشكل 2C-F)11، مما يسمح بدراسة دورة الخلية. باستخدام الفاصل الزمني من 30 دقيقة، ونحن لم التقاط دائما الرقم mitotic أثناء انقسام الخلية. هذا عرض خطأ محتمل يصل إلى 30 دقيقة إلى الوقت المحدد لتقسيم الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا بعض المستنسخين التي تبدو تحتوي على خليتين ذريتين (على سبيل المثال ، الشكل 2F). ضمن هذه القيود، يمكن قياس طول دورة الخلية. من خلال تتبع السلف الفردية المسماة Brainbow مع مرور الوقت قمنا بحساب دورة خلية متوسط هاوية 8.4 ± 1.5 ساعة ، مقارنة بالقياسات السابقة في سمك الحمار الوحشي1،45،46. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام تقنية التصوير Brainbow الفاصل الزمني، كنا أيضا قادرين على مراقبة الخلايا الفردية التي تمر التغيرات المورفولوجية النمطية المرتبطة بموت الخلايا المبرمج(الشكل 3)11،مثل غشاء الببوب وتفتيت الخلايا47،48.

Figure 1
الشكل 1: Brainbow المسمى مجموعات clonally ذات الصلة من الخلايا المنقسمة في الدماغ الخلفي حمار وحشي النامية. (أ)التخطيطي من hsp: Zebrabow (Brainbow) الحمض النووي أعرب بشكل عابر لاستنساخ رمز اللون. (ب)في الحي صور خفيفة المنقولة من تطوير حمار وحشي في 1 و 2 dpf؛ تشير الأسهم إلى منطقة الدماغ الخلفي العامة المستهدفة للتصوير. ويتضح الشفافية من الأجنة من خلال ميكرومتر وضعت تحت كل سمكة. الجدول الزمني التجريبي الذي يظهر الحقن في مرحلة الخلية الواحدة، والصدمة الحرارية (HS) في 24 hpf، والتصوير من 1-3 dpf. (C)عرض دورسال من 29 hpf حمار وحشي hindbrain المسمى مع Brainbow. وأظهرت القناة الخفيفة المرسلة مورفولوجيا الدماغ الخلفي والبطين المتراكب ة مع أقصى قدر من الكثافة إسقاط استنساخ Brainbow التسمية تمثل 165 ميكرومتر. روسترال فوق. (D)في التعبير في الجسم الحي بقوس قزح في الدماغ الخلفي، كما هو موضح في إسقاطات الكثافة القصوى التي تمثل 41 ميكرومتر في 51 hpf hpf hpf hpf الوحشية(D1)،و 81 ميكرومتر في 63.5 hpf حمار وحشي(D2). في كلا اللوحتين، دورسال فوق وrostral إلى اليسار. (E)تم قياس لون الخلايا في D1 و D2 كأوزان قناة نسبية في المؤامرات ternary المقابلة (n = 54 خلية E1؛ 461 خلية E2). (F)ظل لون الخلية ثابتًا نسبيًا في خلايا الابنة بعد انقسام الخلية. سلسلة من النقاط الزمنية التي تظهر في الأحداث الميطية في الدماغ الخلفي من 29 hpf Brainbow المسمى حمار وحشي أكثر من 1 ساعة(F1،أقصى كثافة التوقعات، عمق 30 ميكرون). لون الأم وابنتها الخلايا، وأشار إلى ذلك من قبل مربعات سوداء في F1،ويمثل كأوزان قناة النسبية في مؤامرة ternary في F2. يعرض inset تكبير نفس المؤامرة لإظهار ألوان الخلية المجمعة بإحكام (M هو الأم; D1 و D2 هي بنات في 30 دقيقة / مربعات ، و 60 دقيقة / مثلثات). أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر (C) و20 ميكرومتر (دال1)و16 ميكرومتر (دال2)و5 ميكرومتر (F1). في C و D و F ، يتم ترميز dTomato باللون الأحمر ، ويتم ترميز YFP باللون الأخضر ، ويتم ترميز CFP باللون الأزرق. صور أعيد طبعها بإذن من بروكواي وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الفاصل الزمني في التصوير الحي جنبا إلى جنب مع Brainbow لون الترميز المميز استنساخ المجاورة متعددة من الخلايا التي تمر الهجرة النووية بين الحركية والانقسام. (أ)مجموعات شعاعية مرمزة بالألوان تحمل علامة خلفية لسمكة واحدة تعبر عن بقوس قزح عند 2 ديسيف (55 hpf؛ أ1)و 3 dpf (71 hpf; أ2)؛ إسقاطات الحد الأقصى للكثافة التي تمثل 62 ميكرومتر و47 ميكرومتر على التوالي. يتم تحديد ثلاث مجموعات شعاعية مرمزة بالألوان مع رؤوس الأسهم في كل نقطة زمنية. (ب)تم قياس لون جميع الخلايا المسماة بقوس قزح في A1 و A2 كأوزان قناة نسبية في المؤامرات ternary المقابلة في B1 و B2 (n = 106 خلية، 119 خلية). (C)الحمار الوحشي في 35 hpf المسمى مع Brainbow (أقصى كثافة الإسقاط تبين 24 ميكرون)؛ inset المشار لها مع مربع أبيض متقطع هو أول نقطة زمنية معروضة في D.(D)سلسلة من النقاط الزمنية التي اتخذت في 30 دقيقة فترات في hindbrain من C. يتم عرض فترة من > 9.5 ساعة. وخضعت الخلايا المسماة لهجرة نووية بين الحركية؛ تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى خلية على السطح apical. ويعتبر تجميع سوما الخلية على السطح apical والزيادة المقابلة في عدد استنساخ (على سبيل المثال، الخلية الحمراء في 5.5 ساعة ثم 8 ح) حدثا mitotic. (E)عرض Dorsolateral من الحمار الوحشي hindbrain في 30.5 hpf المسمى Brainbow، حيث يظهر خط أبيض متقطع ومنقط الحدود التقريبية للرأس، ومربع متقطع أبيض يشير إلى inset هو مبين في نقطة الوقت الأول من F.(F)سلسلة من النقاط الزمنية التي اتخذت في 30 دقيقة فترات في الخلفية من E. على مدى فترة 1.5 ساعة، يمكن ملاحظة خليتين زرقاوتين أشار إليهما رؤوس الأسهم البيضاء تتحركان إلى السطح apical وتخضعان للتقان، مما يشير إلى استنساخ يحتوي على خليتين ذريتين. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (A) و25 ميكرومتر (C) و20 ميكرومتر (F). في A-D، دورسال هو أعلى وrostral إلى اليسار. في E و F، روسترال إلى اليسار. في جميع الصور ، يتم ترميز dTomato باللون الأحمر ، ويتم ترميز YFP باللون الأخضر ، ويتم ترميز CFP باللون الأزرق. صور أعيد طبعها بإذن من بروكواي وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يظهر تصوير Brainbow الفاصل زمنيًا الخلايا في منطقة البطين تخضع لوفاة الخلايا في الجسم الحي. (أ)الحمار الوحشي في 31 hpf المسمى مع Brainbow (أقصى كثافة الإسقاط تمثل 36 ميكرومتر). يشير المربع الأبيض المتقطع إلى مجموعة مُدرجة تظهر في نقطة التوقيت الأولى في B.(B)سلسلة من النقاط الزمنية التي تظهر الدماغ الخلفي في A عند فترات 30 دقيقة. يظهر رأس السهم الأبيض في اللوحة الأولى خلية خزامى خضعت لموت الخلايا المبرمج كما هو موضح في اللوحات اللاحقة ، ويشار إليها بتجزئة الخلية تليها إزالة تدريجية للأجسام المبرمجة. الخلايا المجاورة وصفت ظهرت صحية في جميع أنحاء. دورسال فوق وروسترال إلى اليسار. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (B). في جميع الصور ، يتم ترميز dTomato باللون الأحمر ، ويتم ترميز YFP باللون الأخضر ، ويتم ترميز CFP باللون الأزرق. صور أعيد طبعها بإذن من بروكواي وآخرون11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور استنساخ الخلايا السلف والخلايا العصبية في الدماغ الخلفي الحمار الوحشي النامية ومتابعتها في الجسم الحي باستخدام Brainbow والوقت الفاصل المجهر11. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع في المختبر أو الدراسات الحمراء السابقة هي القدرة على مراقبة مباشرة المنطقة التكاثرية للدماغ الفقارية في وسطها الطبيعي مع مرور الوقت. وتستند هذه التقنية إلى دراسات سابقة وصفت استنساخاً واحداً باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية. في المقابل، واستخدام hsp: Zebrabow بناء رموز اللون العديد من استنساخ في وقت واحد، مما يسمح تتبع النسب متعددة والتركيز على ديناميات بين استنساخ11. يمكن تعديل هذا البروتوكول للتركيز على التطوير في أنظمة أخرى أو أنواع الخلايا. على سبيل المثال، يمكن التعبير عن بنيات Brainbow المختلفة في أجنة سمك الحمار الوحشي. استخدام المروج hsp70 حمار وحشي في hsp: Zebrabow سيؤدي إلى وضع العلامات على الفسيفساء من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التالية صدمة الحرارة، بما في ذلك السلف العصبيوالخلايا العصبية11،ويعطي الباحثين السيطرة الزمنية على التعبير الجيني29. تجدر الإشارة إلى أن استخدام مروج الصدمات الحرارية يُلصق باستمرار المستنسخين المرمزة بالألوان ، في حين أن المروجين الآخرين قد لا يحددون نسب الخلايا بوضوح بهذه الطريقة. عندما لا تكون الهوية الكلونية عامل ًا مهمًا، يمكن استخدام البنى التي تستخدم مروجين آخرين لتسمية أنواع خلايا معينة. على سبيل المثال، يمكن استخدام المروّج العصبي لتسمية الخلايا العصبية غير الناضجة18،49. بالإضافة إلى ذلك، بدلا من إجراء الحقن المجهرية، قد يختار الباحثون استخدام رينبو حمار وحشي المعدلة وراثيا، بما في ذلك خطوط مثل Tg (ubi:Zebrabow)15 و Tg (neurod:Zebrabow)18. في هذه الحالة، يعبر إلى خطوط تعبر عن Recombinase Cre، مثل Tg (hsp:Crea134)15،تنتج الأجنة غير المحقونة التي يتم جمعها وصيانتها بطريقة مماثلة. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير الأسماك بين 1-3 dpf، من أجل أن تتزامن مع الفترة الرئيسية من تكوين الأعصابالتنموية 50،يمكن الحفاظ على سمك الحمار الوحشي لفترة أطول اعتمادا على مرحلة النمو من الفائدة. ومع ذلك، قد تكون الصدمة الحرارية للحث على التعبير Brainbow قبل 24 hpf أكثر ضررا على الأجنة51. اعتمادا على العمر والأنسجة ذات الأهمية، واستراتيجيات مختلفة تصاعد سيكون من المناسب أن يكون الأنسجة المستهدفة الموجهة بشكل صحيح.

هناك عدد من الخطوات التي قد تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها، خاصة إذا تم إجراء تعديلات على البروتوكول. يمكن تعديل تركيز الحمض النووي وحجم البولوس المحقن والكمية الإجمالية للحمض النووي المسلم لكل جنين إذا كان تعبير Brainbow خافتًا أو متفرقًا أو إذا كانت الأجنة لا تبدو صحية. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم تعديل طول وتوقيت خطوة الصدمة الحرارية إذا لم يتم تحقيق التعبير المطلوب. تختلف معلمات الاستحواذ المستخدمة في التصوير وفقًا لخطوط الليزر والفلاتر المتاحة بالإضافة إلى سطوع التعبير والتركيب ونوع التحليل المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، يجب تعديل معلمات الفاصل الزمني اعتماداً على سرعة الأحداث ذات الفائدة والوقت اللازم للحصول على مكدس Z واحد. واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هو التركيب المناسب للأسماك في agarose: إذا كانت زاوية السمك غير مناسبة أو إذا كانت الأسماك مغطاة بالكثير من الأغروز ، فإن التصوير الأمثل لن يكون ممكنًا. قد يستغرق تحسين هذه التقنية بعض الممارسة. بالإضافة إلى ذلك ، غالباً ما يكون من المفيد تركيب أسماك متعددة قبل التصوير حيث قد يكون من الصعب التأكد مما إذا كان التركيب مناسبًا قبل عرض تعبير FP على المجهر البؤري نفسه. وثمة خطوة حاسمة إضافية هي فحص واختيار الأسماك المحددة التي سيتم صورها. إذا كان إجراء الحقن المجهرية، والسطوع، وكثافة وضع العلامات، ورقم نسخة قوس قزح يمكن أن تختلف جميعها بشكل كبير بين الأسماك. قد يكون من الصعب تحليل الصور التي يتم التقاطها في الأسماك ذات العلامات الخافتة أو وضع العلامات الكثيفة بشكل مفرط أو عدد النسخ المنخفض مما يؤدي إلى عدد قليل من الألوان.

مع هذا البروتوكول ، تمكنا من صورة حمار وحشي حي بشكل مستمر يصل إلى 16 ساعة11. يمكن أن تكون محدودة هذا الطول الزمني من قبل E3 تبخر من غرفة التصوير، ونمو الأسماك من الطائرة من التصوير، والموت أو حركة الأسماك، أو قيود المستخدم على وقت المجهر البؤري. يمكن تقليل التبخر باستخدام ملحق يتم التحكم في درجة حرارته على مرحلة المجهر. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات البيانات 5D التي تم إنشاؤها باستخدام هذا النهج تميل إلى أن تكون ملفات كبيرة تتطلب مساحة كبيرة للقرص الصلب (على سبيل المثال ، ما يصل إلى 100 غيغابايت لفاصل زمني واحد بين عشية وضحاها) وقوة حوسبة كافية للتحليل.

هذا البروتوكول يرشد الباحثين لتصور استنساخ المرمزة بالألوان داخل مجموعة من السلف العصبي والخلايا العصبية ابنة في الدماغ حمار وحشي النامية وتتبع دينامياتها مع مرور الوقت. أحد التوسعات الممكنة هو الجمع بين التصوير بقوس قزح الفاصل الزمني مع علامات FP الحمراء البعيدة لتقييم أدوار جينات محددة في التنمية18. وبهذه الطريقة، يمكن تصور المستنسخين الذين يعبرون عن الجينات المتلاعب بها بلون متميز، وتتبعهم مع مرور الوقت، ومقارنتها بالمستنسخين المجاورين المسمى بقوس قزح وغير المتلاعب بهم. في الصور المتعددة الألوان على جهاز الحي يمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة الهامة الميكانيكية حول كيفية تشكل الجهاز العصبي ووظائفه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر ي. أ. بان، ج. لايفت وز. توبياس على المساهمات التقنية والفكرية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1553764) وصندوق M.J. Murdock الخيري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip) Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 157، المجهر، علم الأعصاب، التنمية، Brainbow، حمار وحشي، تتبع النسب، في التصوير الحي، الدماغ، الدماغ الخلفي، انقسام الخلايا
تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cook, Z. T., Brockway, N. L.,… More

Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter