Summary

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Published: March 23, 2020
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Summary

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Abstract

El desarrollo del sistema nervioso vertebrado requiere una coordinación precisa de comportamientos e interacciones celulares complejos. El uso de técnicas de imagen in vivo de alta resolución puede proporcionar una ventana clara a estos procesos en el organismo vivo. Por ejemplo, las células divisorias y su progenie se pueden seguir en tiempo real a medida que se forma el sistema nervioso. En los últimos años, los avances técnicos en técnicas multicolor han ampliado los tipos de preguntas que se pueden investigar. El enfoque brainbow multicolor se puede utilizar no sólo para distinguir entre celdas similares, sino también para codificar por colores varios clones diferentes de celdas relacionadas que cada uno deriva de una celda progenitora. Esto permite un análisis de linaje multiplex de muchos clones diferentes y sus comportamientos simultáneamente durante el desarrollo. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor es en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo. Esto es particularmente útil para seguir las interacciones celulares entre células similares, que son difíciles de etiquetar diferencialmente utilizando colores tradicionales impulsados por el promotor. Nuestro enfoque se puede utilizar para rastrear las relaciones de linaje entre varios clones diferentes simultáneamente. Los grandes conjuntos de datos generados con esta técnica proporcionan información rica que se puede comparar cuantitativamente a través de manipulaciones genéticas o farmacológicas. En última instancia, los resultados generados pueden ayudar a responder preguntas sistemáticas sobre cómo se desarrolla el sistema nervioso.

Introduction

En las primeras fases del desarrollo, las piscinas de células progenitoras especializadas se dividen repetidamente en zonas proliferativas, produciendo diversos arreglos de células hijas. Las células nacidas durante este período de desarrollo se diferenciarán y viajarán para formar los órganos nacientes. En el sistema nervioso, los progenitores como la glia radial dan lugar a neuronas inmaduras en zonas ventriculares. A medida que las neuronas se alejan de los ventrículos y maduran, el tejido en expansión eventualmente forma las estructuras altamente complejas del cerebro1,2,3,4,5,6. La coordinación entre la división de los progenitores y la diferenciación y migración de las neuronas determinará el tamaño, la forma y, por tanto, la función del cerebro, afectando directamente al comportamiento7,8,9,10. Si bien el control estricto sobre estos procesos es claramente crucial para el desarrollo normal del cerebro, los mecanismos globales que regulan estas dinámicas no se entienden bien. Aquí describimos una herramienta para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a una resolución celular, permitiendo a los investigadores visualizar las células progenitoras y las neuronas in vivo en el cerebro de pez cebra en desarrollo con Brainbow y realizar un seguimiento de su comportamiento a lo largo del tiempo a través de la microscopía confocal de lapso de tiempo11. El enfoque también se puede adaptar para visualizar otras partes del embrión en desarrollo.

Para observar y distinguir entre las células en el cerebro de pez cebra en desarrollo, hemos adaptado la técnica de etiquetado celular Brainbow11. Brainbow utiliza la expresión combinatoria determinada aleatoriamente de tres proteínas fluorescentes distintas (FP) para etiquetar una población de células. Mientras que la expresión predeterminada para la expresión de Brainbow es el FP rojo dTomato, la recombinación por la enzima Cre recombinase da como resultado la expresión de mCerulean (proteína fluorescente cian, CFP) o proteína fluorescente amarilla (YFP)12,13. La cantidad combinada de cada FP expresada en una celda le da un matiz único, lo que permite una clara distinción visual de las celdas vecinas. Además, cuando una célula progenitora se divide, cada célula hija heredará el color de su célula madre, produciendo clones codificados por colores y permitiendo a los investigadores rastrear el linaje celular11,14. Aunque originalmente se utiliza bañó para analizar circuitos neuronales en ratones12,Brainbow se ha expresado desde entonces en una amplia variedad de organismos modelo, incluyendo el pez cebra15.

Nuestra técnica se basa en métodos anteriores de etiquetado y imagen multicolor para crear imágenes directamente de varios clones codificados por colores a lo largo del tiempo en peces cebra vivos. Debido a su transparencia óptica como embriones, los peces cebra son muy adecuados para los experimentos de imagen16,y estudios anteriores han utilizado Brainbow en el pez cebra para estudiar una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacidad de imagen directa en el organismo vivo, junto con su rápido desarrollo ex utero, hacen del pez cebra un modelo valioso de desarrollo de vertebrados. A diferencia del cerebro de los mamíferos, toda la zona proliferativa del cerebro trasero del pez cebra está fácilmente disponible para la toma de imágenes sin interrupción de su entorno endógeno6. Esto permite que los experimentos se lleven a cabo en el organismo vivo, en lugar de en preparaciones de tejido sin vitro o fijos. A diferencia de los experimentos de imágenes fijas, los estudios in vivo permiten un diseño longitudinal, produciendo horas de datos que se pueden analizar en busca de patrones, aumentando así la probabilidad de observar eventos relativamente raros. Dependiendo de la velocidad y la duración de los eventos de interés, los investigadores pueden optar por realizar experimentos cortos (1-2 h) o largos (hasta 16 h) de imágenes de lapso de tiempo. Mediante el uso del promotor de choque térmico de pez cebra 70 (hsp70, hsp), la expresión de Brainbow se puede controlar temporalmente28,29. Además, la expresión de mosaico inducida por este promotor es muy adecuada para etiquetar y rastrear muchos clones11.

La capacidad de identificar visualmente múltiples clones dentro del cerebro vivo es una ventaja de este método. Importantes estudios previos que investigaron el papel de los clones dentro del desarrollo del sistema nervioso utilizaron vectores retrovirales para etiquetar una sola célula progenitora y su progenie usando una sola FP u otra proteína fácilmente visualizada. Dicho etiquetado permite a los investigadores observar un solo clon a lo largo del tiempo, ya sea in vitro o in vivo2,,30,31,32,33,34,35,36,37,38. A diferencia de los métodos para rastrear el comportamiento de las células dentro de un clon, los distintos colores de Brainbow permiten a los investigadores observar la dinámica entre los clones. Además, al usar Brainbow para etiquetar muchos clones dentro del cerebro, se recopilan datos adicionales sobre el comportamiento clonal en relación con las técnicas que etiquetan un solo clon11. Es importante destacar que los enfoques descritos aquí se pueden ampliar para generar comparaciones de desarrollo entre peces que han sufrido diferentes manipulaciones genéticas o farmacológicas18. En general, estas ventajas hacen que las imágenes confocales in vivo de barcoiris expresen el tamaño de los peces cebra sean ideales para investigadores que exploran el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, en particular aquellos interesados en el papel de los clones.

Protocol

Los procedimientos relacionados con sujetos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Lewis & Clark College. 1. Microinyección de embriones de pez cebra Establecer el tipo salvaje, pez cebra adulto en tanques de apareamiento segregados por sexo la tarde antes de realizar microinyecciones39,40. Prepare la solución de ADN en la mañana de las microinyecciones…

Representative Results

En esta sección se ilustran ejemplos de resultados que se pueden obtener utilizando el enfoque de imágenes de lapso de tiempo multicolor in vivo que se describe aquí. Mostramos que Brainbow clona de células codificadas por colores en la zona ventricular proliferativa del cerebro trasero de pez cebra en desarrollo14 (Figura 1). Normalmente, cuando las celdas etiquetadas con Brainbow se organizaban a lo largo de una fibra radial determina…

Discussion

Este protocolo describe un método para visualizar clones de células progenitoras y neuronas en el cerebro trasero de pez cebra en desarrollo y seguirlos in vivo utilizando Brainbow y la microscopía confocal de lapso de tiempo11. La principal ventaja de este protocolo en comparación con los estudios in vitro o ex vivo es la capacidad de observar directamente la zona proliferativa del cerebro vertebrado en su entorno natural a lo largo del tiempo. Esta técnica se basa en estudios anteriores que…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet y Z. Tobias por sus contribuciones técnicas e intelectuales. Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (Premio 1553764) y el M.J. Murdock Charitable Trust.

Materials

1.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

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Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

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