In vivo imaging er et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke cellulære mekanismer underliggende nervesystemet utvikling. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler i sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet.
Utvikling av virveldyrnervesystemet krever en presis koordinering av kompleks cellulær atferd og interaksjoner. Bruken av høyoppløselige in vivo bildeteknikker kan gi et klart vindu inn i disse prosessene i den levende organismen. For eksempel kan deling av celler og deres avkom følges i sanntid som nervesystemet dannes. I de senere årene har tekniske fremskritt i flerfarget teknikker utvidet hvilke typer spørsmål som kan undersøkes. Den flerfargede Brainbow-tilnærmingen kan brukes til ikke bare å skille mellom like celler, men også til fargekode flere forskjellige kloner av relaterte celler som hver kommer fra en stamcelle. Dette gir mulighet for en multipleks avstamning analyse av mange forskjellige kloner og deres atferd samtidig under utviklingen. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler over sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet. Dette er spesielt nyttig for å følge cellulære interaksjoner mellom som celler, som er vanskelig å merke differensialt ved hjelp av tradisjonelle promotordrevne farger. Vår tilnærming kan brukes til å spore avstamningrelasjoner mellom flere forskjellige kloner samtidig. De store datasettene som genereres ved hjelp av denne teknikken, gir rik informasjon som kan sammenlignes kvantitativt på tvers av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner. Til syvende og sist kan resultatene som genereres bidra til å svare på systematiske spørsmål om hvordan nervesystemet utvikler seg.
I de tidlige fasene av utviklingen deler bassenger av spesialiserte stamceller gjentatte ganger i proliferative soner, og produserer ulike arrayer av datterceller. Cellene som er født i denne utviklingsperioden vil da differensiere og reise for å danne de gryende organene. I nervesystemet gir stamfarer som radial glia opphav til umodne nevroner i ventrikulære soner. Som nevroner migrere bort fra ventrikler og modne, danner det ekspanderende vevet til slutt de svært komplekse strukturene i hjernen1,2,3,4,5,6. Koordineringen mellom deling av stamfarer og differensiering og migrasjon av nevroner vil bestemme den endelige størrelsen, formen og dermed funksjonen til hjernen, direkte påvirker atferd7,,8,9,10. Selv om tett kontroll over disse prosessene er klart avgjørende for normal hjerneutvikling, er de globale mekanismene som regulerer disse dynamikkene ikke godt forstått. Her beskriver vi et verktøy for å studere utvikling av nervesystemet ved en cellulær oppløsning, slik at forskere kan visualisere stamceller og nevroner in vivo i den utviklende sebrafiskhjernen med Brainbow og spore deres oppførsel over tid via tid-bortfall konfokal mikroskopi11. Tilnærmingen kan også tilpasses for å visualisere andre deler av det utviklende embryoet.
For å observere og skille mellom celler i den utviklende sebrafiskhjernen, har vi tilpasset Brainbow cellemerkingsteknikk11. Brainbow benytter det tilfeldig bestemte, kombinatoriske uttrykket av tre forskjellige fluorescerende proteiner (FPs) for å merke en populasjon av celler. Mens standarduttrykket for Brainbow-uttrykk er det røde FP dTomato, resulterer rekombinasjon av enzymet Cre rekombinase i uttrykk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den kombinerte mengden av hver FP uttrykt i en celle gir den en unik nyanse, slik at klart visuelt skille fra nærliggende celler. I tillegg, når en stamcelle deler seg, vil hver dattercelle arve fargen fra sin morcelle, produsere fargekodede kloner og tillate forskere å spore celleavstamning11,14. Mens den opprinnelig ble brukt til å analysere nevronale kretser i mus12,har Brainbow siden blitt uttrykt i et bredt spekter av modellorganismer, inkludert sebrafisk15.
Vår teknikk bygger på tidligere flerfarget merking og bildemetoder for å direkte bilde flere fargekodede kloner over tid i levende sebrafisk. På grunn av deres optiske gjennomsiktighet som embryoer, er sebrafisk godt egnet til bildeeksperimenter16, og tidligere studier har benyttet Brainbow i sebrafisk for å studere en rekke vev, inkludert nervesystemet11,,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til å direkte bilde inn i den levende organismen, sammen med deres raske ex utero utvikling, gjør sebrafisk til en verdifull modell for virveldyrutvikling. I motsetning til den pattedyrhjernen er hele proliferativ sone av sebrafisk hindbrain lett tilgjengelig for avbildning uten avbrudd i sitt endogene miljø6. Dette gjør det mulig å gjennomføre eksperimenter i den levende organismen, i stedet for in vitro eller faste vevspreparater. I motsetning til faste bildeeksperimenter tillater in vivo-studier en langsgående design, som produserer timer med data som kan analyseres for mønstre, og dermed øke sannsynligheten for å observere relativt sjeldne hendelser. Avhengig av hastigheten og lengden på hendelsene av interesse, forskere kan velge å utføre korte (1-2 t) eller lange (opp til ~ 16 h) time-lapse bildeforsøk. Ved å bruke sebrafisk varme sjokk promotoren 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttrykk kan være tempolysk kontrollert28,29. I tillegg er mosaikkuttrykket indusert av denne arrangøren godt egnet for merking og sporing av mange kloner11.
Evnen til visuelt å identifisere flere kloner i den levende hjernen er en fordel med denne metoden. Viktige tidligere studier som undersøkte klonenes rolle i utviklingen av nervesystemet, benyttet retrovirale vektorer til å merke en enkelt stamcelle og dens avkom ved hjelp av en enkelt FP eller annet lett visualisert protein. Slik merking gjør det mulig for forskere å observere en enkelt klone over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I motsetning til metoder for å spore oppførselen til celler i en klone, de distinkte fargene i Brainbow tillate forskere å observere dynamikk blant kloner. I tillegg, ved å bruke Brainbow til å merke mange kloner i hjernen, samles ytterligere data om klonal atferd i forhold til teknikker som merker en enkelt klone11. Viktigere, tilnærmingene beskrevet her kan utvides til å generere utviklingssammenligninger mellom fisk som har gjennomgått forskjellige genetiske eller farmakologiske manipulasjoner18. Samlet sett gjør disse fordelene time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrykkende sebrafisk ideell for forskere som utforsker utviklingen av virveldyrnervesystemet, spesielt de som er interessert i kloners rolle.
Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere kloner av stamceller og nevroner i den utviklende sebrafisk hindbrain og følge dem in vivo ved hjelp av Brainbow og time-lapse confocal mikroskopi11. Den store fordelen med denne protokollen i forhold til in vitro eller ex vivo studier er evnen til å direkte observere den proliferative sonen av virveldyr hjernen i sitt naturlige miljø over tid. Denne teknikken bygger på tidligere studier som merket en enkelt klone ved hjelp av retroviral…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Award 1553764) og M.J. Murdock Charitable Trust.
1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
Epifluorescence dissection scope | |||
Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
Phenol red | Sigma | P0290 | |
Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |