Overvågning af PD-1-Blokerende antistoffer bundet til T-celler afledt af en dråbe perifert blod

Summary

Vi udviklede en simpel flow cytometri analyse til evaluering af bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler, der kræver kun en dråbe perifert blod fra kræftpatienter.

Abstract

Immune checkpoint hæmmere, herunder PD-1-blokerende antistoffer, har væsentligt forbedret behandlingsresultater i forskellige typer af kræft. Den farmakologiske virkning af disse immunterapier er langvarig og strækker sig selv ud over seponering af injektionerne på grund af vedvarende blodkoncentrationer. Her udviklede vi en simpel flow cytometri analyse til at evaluere T celle bindende status af PD-1-blokerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Ligesom en glukosetest, denne analyse kræver blot en enkelt dråbe perifert blod. Visualisere antistofbinding på T-celler er mere pålidelig end måling af antistofblodkoncentrationer. Desuden, hvis det er nødvendigt, kan vi potentielt analysere mange karakteristiske immun-relaterede markører på T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Således, Dette er en enkel og minimalt invasiv strategi for at analysere den farmakologiske virkning af PD-1-blokerende antistoffer hos kræftpatienter.

Introduction

PD-1-blokerende antistoffer er blevet standard valg til behandling af forskellige typer af kræft, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)^1,2,3,4. De viser en bemærkelsesværdig terapeutisk effekt i en delmængde af kræftpatienter, der ikke har reageret på konventionelle cytotoksiske kemoterapier. Immun checkpoint hæmmere (ICI’ er), som omfatter PD-1-blokerende antistoffer, kan dog forårsage et unikt og særskilt spektrum af bivirkninger, såkaldte immunrelaterede bivirkninger (IrAEs)⁵. Selv irAEs kan påvirke næsten alle væv, de er mest almindeligt observeret i mave-tarmkanalen, endokrine kirtler, hud, og lever, og de kan forårsage kløe, udslæt, kvalme, diarré, og skjoldbruskkirtel lidelser^6,7. Generelt forekommer de fleste irA’er inden for 1 til 2 måneder efter indledningen af ICI’er. I nogle tilfælde kan de dog forekomme senere end 1 år efter behandlingens begyndelse eller endda efter behandlingsophør^6,7. De forårsager også forskellige symptomer, der kan være svære at diskriminere fra andre patologier. Det kan således være en udfordring hurtigt at diagnosticere iraEs og behandle dem korrekt. irAEs kan påvirke alle væv, og deres debut er stærkt påvirket af cirkulerende immunceller, især T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimalt invasiv metode til at overvåge antistof-målrettede T-celler vigtigt i kliniske indstillinger.

Her udviklede vi en enkel metode til at vurdere bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler ved hjælp af en dråbe perifert fuldblod fra kræftpatienter, der fik nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi var i stand til at overvåge hver af følgende: 1) varigheden af antistof binding til T-celler, 2) belægningen af T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringstatus og immunologiske træk af T-celler. Denne metode er en ændring af en tidligere rapporteret teknik⁸. Mængden af blod, der kræves, er næsten den samme som den, der er nødvendig for en glukosetest, og tilgangen kræver ikke mononuklear celleberigelse eller co-turing med PD-1-blokerende antistoffer. Vi bekræftede, at denne metode også kan udføres ved hjælp af frosne prøver, herunder perifere blod mononukleare celler (PBPC’er) og celler fra pleural effusion, perikardieeffusion, bronchoalveolar lavage væske, og cerebrospinalvæske, tyder på, at denne strategi kan være nyttig i forbindelse med en multicenter undersøgelse. Denne metode kan lette tidlig diagnosticering af iraEs, og også bidrage til at bestemme de relevante immunsuppressive behandlinger til at kontrollere deres symptomer og til at identificere de optimale tidspunkter for at indlede efterfølgende behandlinger efter PD-1-hæmmere.

Protocol

Prøveudtagningen blev udført under rutinemæssige kliniske procedurer. Alle humane prøver blev indhentet efter informeret samtykke blev leveret af forsøgspersonerne, i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki og med godkendelse af den etiske gennemgang bestyrelse Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752). 1. Fuldblodsprøve Forberedelse og farvning Opsamles fuldblodsprøver i blodopsamlingsrør, der indeholder ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA).<…

Representative Results

Gating strategi og flow cytometri analyse (Figur 1) kan detektere PD-1-blokering antistof binding til T-celler opnået fra en dråbe NSCLC patient perifert blod. Før PD-1-blokerende antistof administreres, er der ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler til stede, og PD-1-udtryk kan bekræftes af et PD-1-detekterende antistof (EH12.1) (Figur 2A). Efter nivolumab eller pembrolizumab administration, IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) kan p…

Discussion

I denne artikel rapporterer vi en metode ved hjælp af et flow cytometer til at opdage PD-1-blokerende antistoffer bundet til T-celler stammer fra en dråbe perifert blod, som vi oprindeligt udviklet til nivolumab detektion¹⁰. Selv om denne teknik er meget enkel og nem at udføre, to vigtige punkter skal bemærkes for at opnå nøjagtige resultater. Den ene er, at for at opdage PD-1 molekyler, et passende antistof, der konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab bør anvendes. Dette problem blev ev…

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646