Summary

Overvågning af PD-1-Blokerende antistoffer bundet til T-celler afledt af en dråbe perifert blod

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Vi udviklede en simpel flow cytometri analyse til evaluering af bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler, der kræver kun en dråbe perifert blod fra kræftpatienter.

Abstract

Immune checkpoint hæmmere, herunder PD-1-blokerende antistoffer, har væsentligt forbedret behandlingsresultater i forskellige typer af kræft. Den farmakologiske virkning af disse immunterapier er langvarig og strækker sig selv ud over seponering af injektionerne på grund af vedvarende blodkoncentrationer. Her udviklede vi en simpel flow cytometri analyse til at evaluere T celle bindende status af PD-1-blokerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Ligesom en glukosetest, denne analyse kræver blot en enkelt dråbe perifert blod. Visualisere antistofbinding på T-celler er mere pålidelig end måling af antistofblodkoncentrationer. Desuden, hvis det er nødvendigt, kan vi potentielt analysere mange karakteristiske immun-relaterede markører på T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Således, Dette er en enkel og minimalt invasiv strategi for at analysere den farmakologiske virkning af PD-1-blokerende antistoffer hos kræftpatienter.

Introduction

PD-1-blokerende antistoffer er blevet standard valg til behandling af forskellige typer af kræft, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)1,2,3,4. De viser en bemærkelsesværdig terapeutisk effekt i en delmængde af kræftpatienter, der ikke har reageret på konventionelle cytotoksiske kemoterapier. Immun checkpoint hæmmere (ICI’ er), som omfatter PD-1-blokerende antistoffer, kan dog forårsage et unikt og særskilt spektrum af bivirkninger, såkaldte immunrelaterede bivirkninger (IrAEs)5. Selv irAEs kan påvirke næsten alle væv, de er mest almindeligt observeret i mave-tarmkanalen, endokrine kirtler, hud, og lever, og de kan forårsage kløe, udslæt, kvalme, diarré, og skjoldbruskkirtel lidelser6,7. Generelt forekommer de fleste irA’er inden for 1 til 2 måneder efter indledningen af ICI’er. I nogle tilfælde kan de dog forekomme senere end 1 år efter behandlingens begyndelse eller endda efter behandlingsophør6,7. De forårsager også forskellige symptomer, der kan være svære at diskriminere fra andre patologier. Det kan således være en udfordring hurtigt at diagnosticere iraEs og behandle dem korrekt. irAEs kan påvirke alle væv, og deres debut er stærkt påvirket af cirkulerende immunceller, især T-celler bundet til PD-1-blokerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimalt invasiv metode til at overvåge antistof-målrettede T-celler vigtigt i kliniske indstillinger.

Her udviklede vi en enkel metode til at vurdere bindingen af PD-1-blokerende antistoffer mod T-celler ved hjælp af en dråbe perifert fuldblod fra kræftpatienter, der fik nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi var i stand til at overvåge hver af følgende: 1) varigheden af antistof binding til T-celler, 2) belægningen af T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringstatus og immunologiske træk af T-celler. Denne metode er en ændring af en tidligere rapporteret teknik8. Mængden af blod, der kræves, er næsten den samme som den, der er nødvendig for en glukosetest, og tilgangen kræver ikke mononuklear celleberigelse eller co-turing med PD-1-blokerende antistoffer. Vi bekræftede, at denne metode også kan udføres ved hjælp af frosne prøver, herunder perifere blod mononukleare celler (PBPC’er) og celler fra pleural effusion, perikardieeffusion, bronchoalveolar lavage væske, og cerebrospinalvæske, tyder på, at denne strategi kan være nyttig i forbindelse med en multicenter undersøgelse. Denne metode kan lette tidlig diagnosticering af iraEs, og også bidrage til at bestemme de relevante immunsuppressive behandlinger til at kontrollere deres symptomer og til at identificere de optimale tidspunkter for at indlede efterfølgende behandlinger efter PD-1-hæmmere.

Protocol

Prøveudtagningen blev udført under rutinemæssige kliniske procedurer. Alle humane prøver blev indhentet efter informeret samtykke blev leveret af forsøgspersonerne, i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki og med godkendelse af den etiske gennemgang bestyrelse Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752). 1. Fuldblodsprøve Forberedelse og farvning Opsamles fuldblodsprøver i blodopsamlingsrør, der indeholder ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA).<…

Representative Results

Gating strategi og flow cytometri analyse (Figur 1) kan detektere PD-1-blokering antistof binding til T-celler opnået fra en dråbe NSCLC patient perifert blod. Før PD-1-blokerende antistof administreres, er der ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler til stede, og PD-1-udtryk kan bekræftes af et PD-1-detekterende antistof (EH12.1) (Figur 2A). Efter nivolumab eller pembrolizumab administration, IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) kan p…

Discussion

I denne artikel rapporterer vi en metode ved hjælp af et flow cytometer til at opdage PD-1-blokerende antistoffer bundet til T-celler stammer fra en dråbe perifert blod, som vi oprindeligt udviklet til nivolumab detektion10. Selv om denne teknik er meget enkel og nem at udføre, to vigtige punkter skal bemærkes for at opnå nøjagtige resultater. Den ene er, at for at opdage PD-1 molekyler, et passende antistof, der konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab bør anvendes. Dette problem blev ev…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud til S.K. fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) og Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 og 19cm0106310).

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) Thermo Fisher Scientific 00-4300-54 50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody BioLegend 300518 Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody BioLegend 301048 Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline nacalai tesque 14249-95 500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes STEMCELL Technologies 352058 5 mL
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901 2 mL
FLOWJO BD
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12676029 500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control abcam ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc abcam ab99825 Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 BD 558117 Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) BD 561272 Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557646

References

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

Play Video

Cite This Article
Naito, Y., Osa, A., Masuhiro, K., Hirai, T., Koyama, S., Kumanogoh, A. Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (156), e60608, doi:10.3791/60608 (2020).

View Video