Summary
פיתחנו זרימה פשוטה cy, לנסות הערכה להערכת האיגוד של PD-1-חסימת נוגדנים לתאי T, המחייב רק טיפה של דם היקפי מחולי סרטן.
Abstract
מעכבי המחסום החיסונית, כולל PD-1 – חסימת נוגדנים, יש שיפור משמעותי בתוצאות הטיפול בסוגים שונים של סרטן. היעילות הפרמקולוגית של טיפולים אלה מתמשך לאורך זמן, הרחבת אפילו מעבר הפסקת הזריקות שלהם, בשל ריכוזי דם מתמשך. כאן פיתחנו מערכת פשוטה cy, מנסה להעריך את הסטטוס של כריכת התא T של PD-1 – חסימת נוגדנים nivolumab ו-פרומוליזואב. כמו בדיקת גלוקוז, הצורך הזה דורש רק טיפה אחת של דם היקפי. ויזואליזציה כריכת נוגדנים על תאי T הוא אמין יותר מאשר מדידת ריכוזי דם נוגדנים. בנוסף, במידת הצורך, אנו יכולים לנתח סמנים ייחודיים הקשורים החיסונית בתאי T מאוגד PD-1 – חסימת נוגדנים. Thus, זוהי אסטרטגיה פשוטה ופולשנית כדי לנתח את ההשפעה הפרמקולוגית של PD-1 – חסימת נוגדנים בחולי סרטן.
Introduction
PD-1 – חסימת נוגדנים הפכו את הבחירה הסטנדרטית לטיפול בסוגים שונים של סרטן, כולל סרטן ריאות תא קטן (nsclc)1,2,3,4. הם מראים השפעה טיפולית יוצאת דופן בקבוצת משנה של חולי סרטן אשר לא הגיבו כימותרפיות קונבנציונאלי ציטוטוקסיים. עם זאת, מעכבי המחסום החיסונית (ICIs), הכוללים PD-1 – חסימת נוגדנים, יכול לגרום לספקטרום ייחודי וברור של אירועים לוואי, כינה החיסונית הקשורות אירועים לוואי (irAEs)5. למרות iraes יכול להשפיע על כמעט כל הרקמות, הם נצפו בדרך כלל במערכת העיכול, בלוטות אנדוקריניות, העור, והכבד, והם יכולים לגרום הפרודדוקטוס, פריחה, בחילות, שלשול, והפרעות בלוטת התריס6,7. באופן כללי, רוב irAEs מופיעים בתוך 1 עד 2 חודשים לאחר החניכה של ICIs. עם זאת, במקרים מסוימים, הם יכולים להתרחש מאוחר יותר מ 1 שנה לאחר תחילת הטיפול או אפילו לאחר הפסקת הטיפול6,7. הם גם לגרום לתסמינים שונים שעשויים להיות קשה להפלות של פתווגיות אחרות. לפיכך, זה יכול להיות מאתגר כדי לאבחן במהירות irAEs ולהתייחס אליהם כראוי. irAEs יכול להשפיע על כל הרקמות, התפרצות שלהם מושפע מאוד על ידי במחזור תאים חיסוניים, במיוחד תאי T המאוגדים PD-1 – חסימת נוגדנים. לכן, שיטה פשוטה מינימלית פולשנית כדי לפקח על נוגדנים ממוקדות תאים T חשוב בהגדרות קליניות.
כאן, פיתחנו שיטה פשוטה כדי להעריך את הכריכה של PD-1 – חסימת נוגדנים לתאי T באמצעות טיפת דם היקפי מחולי סרטן שקיבלו nivolumab או פמרופזזואב. באמצעות גישה זו, היינו מסוגלים לנטר כל אחת מהפעולות הבאות: 1) המשך של כריכת נוגדנים לתאי T, 2) התפוסת של מולקולות תא T-1 של התא על ידי נוגדנים טיפולית, ו 3) מצב ההפעלה ותכונות אימונולוגיים של תאי T. שיטה זו היא שינוי של טכניקה שדווחה בעבר8. כמות הדם הדרושה היא כמעט זהה לזה הדרוש לבדיקת גלוקוז, והגישה אינה דורשת העשרה תאים מוננובית או שיתוף פעולה עם PD-1 – חסימת נוגדנים. אנו מאשרים כי שיטה זו יכולה להתבצע גם באמצעות דגימות קפואות, כולל דם היקפיים תאים מונוליתים (PBMCs) ותאים מתוך היתוך, הפחתת קרום הלב, נוזל השטיפה ברונכמכתשי, ונוזל מוחי שדרתי, הרומז כי אסטרטגיה זו עשויה להיות שימושית בהקשר של מחקר להיכנס למחקר. שיטה זו עשויה להקל על האבחנה המוקדמת של irAEs, וגם לעזור לקבוע את הטיפולים החיסוני המתאים כדי לשלוט על הסימפטומים שלהם לזהות את הזמנים האופטימליים ליזום טיפולים הבאים לאחר PD-1 מעכבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הדגימה בוצעה במהלך הליכים קליניים שגרתיים. כל הדגימות האנושיות הושגו לאחר הסכמה מושכלת נמסר על ידי הנושאים, בהתאם להצהרת הלסינקי ובאישור של הוועדה המוסרית הביקורת של בית הספר לרפואה בוגרת, אוניברסיטת אוסקה, יפן (15383 ו-752).
1. הכנה לדגימת דם מלאה וצביעת
- לאסוף דגימות דם שלם לתוך צינורות איסוף דם המכיל אתילן diamine טטרה חומצה אצטית (EDTA).
הערה: ניתן לבצע את איסוף הדם באמצעות מחט רגילה או מחלת דם. - העברה 20 μL של דגימות דם שלמות כדי 5 מ ל הקלקר עגול-התחתון הזרימה הצינורות cy, לנסות.
הערה: כדי להקטין את הכריכה הלא ספציפית של תאים לצינורות, 1 מ ל של 2% סרום של שור עוברי (FBS) ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) מתווסף לצינורות, והורטתו עבור 10 s לפני היישום כדי דגימות. - הוסף 20 μL של 2% FBS ב-PBS.
- הוסף 10 μL של מגיב מיוחד לחסימת FcR של האדם. מערבבים היטב ומשלבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 500 μL של מאגר פירוק של תא דם אדום. מערבבים היטב ומשלבים בטמפרטורה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 4 מ ל של 2% FBS ב PBS ו ספין למטה תאים ב 400 x g (1,500 rpm) עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט על ידי השאיפה.
- חזור על תהליך השטיפה והשאיפה המתואר בשלב 1.6.
- השהה מחדש תאים ב-100 μL של 2% FBS ב-PBS וחילוק לשתי שפופרות של 50 μL כל אחד.
- הוסף נוגדנים לסמן פני השטח (טבלה 1). מערבבים היטב ומשלבים את הטמפרטורה 20 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה.
הערה: בשעת יצירת פרופיל למצב החיסוני של תא T, ניתן להגדיל את מספר הסמנים בהתאם לאיכות המחשב של הזרימה cy, try. - לשטוף דגימות 2x כפי שמתואר בשלב 1.6.
- השהה תאים מחדש ב-200 μL של 2% FBS ב-PBS.
2. ניתוח ציטומטלי זרימה
- הכנס צינורות לתוך cytometer לרכוש תאים, בעצם לאחר הפרוטוקול המומלץ9.
- רשום 10,000 אירועים כשער לימפוציטים (איור 1א) וייצא נתוני זרימה כקבצי fcs לצורך ניתוח.
- פתח קבצים בתוכנת הניתוח. המחש את התאים הנמצאים על מגרש פיזור קדמי (FSC) (A) לעומת לימפוציטים של שער (a) (A) (A) (a) (a) (איור 1א).
- לאחר בחירת תאים בודדים באמצעות FSC (H) לעומת FSC (W) ו-אס. אס. לעומת הבנק הקיסרי (W) (איור 1B) ומציג אותם על CD3 VS. CD8 או CD3 vs. CD4 העלילה, לשער את התאים הCD8 T ותאים CD4 t, בהתאמה (איור 1ג).
- לאחר בחירת התאים מגודרת והצגתם על מחלקה PD-1 לעומת האדם IgG4 העלילה, לזהות PD-1 – חסימת נוגדן-CD8 bound ו CD4 T מבוסס על בקרת isotype (איור 1ד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
את האסטרטגיה והזרימה cy, לנסות הניתוח (איור 1) יכול לזהות PD-1 – חסימת כריכת נוגדנים לתאי T שהתקבלו טיפה של החולה NSCLC דם היקפי. לפני PD-1-חסימת נוגדן מנוהל, אין אדם IgG4-חיוביות CD8 או CD4 T התאים נמצאים, ו-PD-1ביטוייכול להיות מאושר על ידי pd-1-זיהוי נוגדן (eh 12.1) (איור 2א). לאחר nivolumab או הממשל, IgG4 (nivolumab) ניתן לזהות על תאי T על ידי anti-IgG4 נוגדן (HP6025) בעוד PD-1-זיהוי נוגדן EH 12.1 אינו מזהה כל PD-1 על התאים T כי הרפואי PD-1 נוגדנים להפריע EH 12.1 כריכה. משמעות הדבר היא כי אנו מודדים בעקיפין את הכריכה הטיפולית של PD-1-חסימת נוגדן המבוסס על חוסר קשירה של PD-1-זיהוי נוגדן. נתונים מייצגים להראות את המצבים איגוד שונים של PD-1-חסימת נוגדן (איור 2א). Nivolumab וכריכת האכלוס והתפוסה של PD-1 על התאים T להקטין על פני זמן10, ויש כריכה חלקית (PB), אשר מוצג באזור כפול חיובי, ולבסוף אובדן מוחלט של כריכה (LB) (איור 2B).
איור 1: הנציגה באסטרטגיה להערכת PD-1 – חסימת כריכת נוגדנים לתאי T מטיפת דם היקפי. (א) fsc (א) לעומת העלילה (א) מול מדינת לימפוציטים. (ב) doublets אינם נכללים על ידי ציור שערים סביב אוכלוסיית התאים העיקריים על מגרשים של Fsc (h) לעומת Fsc (w) ו-אס. אס. לעומת המרכז המרכזי (w). (ג) CD3 VS. CD8 העלילה (העליון) ו CD3 VS. CD4 העלילה (התחתון) ו-המשך של תאים t CD8 ותאים CD4 t, בהתאמה. (ד) PD-1 לעומת IgG4 האדם העלילה וזיהוי של הכריכה של nivolumab (משטרה -1 – חסימת נוגדן) כדי CD8 וCD4 תאי T. נקודות כתומות ונקודות שחורות מציינות נוגדן anti-IgG4 ו כתמים בקרת isotype, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכוח הנציג הניתוח cy, המציין את השינוי בסטטוס המחייב של PD-1 – חסימת נוגדנים. (A) כתמים של PD-1 ו IgG4 האנושית בתאי CD8 T מ-ICI-pretreated דם החולה הוערך על ידי cy try זרימה (משמאל). עשרה מיקרוליטרים של דם מראש טופלו בדילול סדרתי של nivolumab עבור 15 דקות, וצעדים 1.4 כדי 1.10 של הפרוטוקול הושלמו. כריכה מלאה (CB) (אדום), כריכה חלקית (PB) (כחול) ואובדן של איגוד (LB) (ירוק) מוגדרות על-ידי השערים המצוינים. (ב) מעמדם של PD-1 – חסימת כריכת נוגדנים לתאי CD8 T נותחו בנקודות המשך המשך טיפול, כפי שצוין, בחולים NSCLC אשר הפסיקו nivolumab ו-פנוווליזואב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| PE | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| הערכת כריכה | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| פקד איזוtype | פקד איזוtype | CD3 | פקד איזוtype | CD4 | CD8 |
שולחן 1: נוגדנים המשמשים בניתוח הזרימה ציטוטומטלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה באמצעות cytometer זרם כדי לזהות PD-1-חסימת נוגדנים מאוגד תאים T נגזר טיפת דם היקפי, אשר פיתחנו במקור עבור nivolumab זיהוי10. למרות שטכניקה זו פשוטה מאוד וקלה לביצוע, יש לציין שתי נקודות חשובות כדי לקבל תוצאות מדויקות. אחד הוא כי כדי לזהות PD-1 מולקולות, הנוגדן המתאים המתחרה עם nivolumab ו-פרוביזואב יש להשתמש. בעיה זו הוערכו במחקר הקודם11. השני הוא הליזה RBC יש לבצע ביסודיות לפני כתמים פני השטח. כל עוד פקד isotype מבוסס על כל אחד מהתפקודים כדי לקבוע את השער של האשכול IgG4-חיוביים, התדר אינו מושפע. עם זאת, באמצעות פרוטוקול זה, כאשר הליזה RBC אינה מספיקה, ייתכן שיהיו הנחות הן של ספירת תאי T בשער הימפוציטים והן של העוצמה של כל סמן פני השטח. בנוסף, יש לבצע את השלב לפירוק RBC לפני כתמים של פני השטח, אחרת הנוגדן anti-IgG4 (HP6025) אינו פועל כראוי.
המגבלה של שיטה זו היא כי האוכלוסייה של תאי T המאוגדים PD-1-חסימת נוגדנים כוללים מסוימים שיבוטים תא T אחראי על ההשפעות הטיפוליות ו-irAEs; עם זאת, התדרים של אלה שיבוטים ספציפיים בין האוכלוסיה מאוגד נוגדנים הם די נמוך. לכן, אנחנו עדיין צריכים להעשיר את היעד הספציפי באמצעות סמנים מסוימים, למשל CD3912. מגבלה נוספת היא כי האינטנסיביות הפלואורסצנטית של IgG4 הוא לא גבוה במקרים מסוימים, מה שמקשה על קביעת מצב האיגוד (כלומר, PB ו-LB).
מחקרים אחרים משגיחים על נוגדנים ממשטרת PD-1 בדם כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה. מדידת ריכוז פלזמה של nivolumab או פמרוביזזואב חיוני כדי לקבוע כיצד שיורית כמות של נוגדנים אלה בדם התואם עם הזמן. עם זאת, אנו דיווחו בעבר כי הריכוז של nivolumab אינו מתאם לחלוטין עם שיורית מחייב תאים T10. בהשוואה למדידה של נוגדן פלזמה ריכוז13, השיטה שלנו עשויה להיות מתאימה יותר להערכת הכריכה השיורית של נוגדנים אנטי-PD-1 לתאי T. השיטה המקורית של ניטור nivolumab הכריכה לתאי T בתוך הדגירה הנדרשת בדם עם התוויתnivolumab שכותרתו-פלואורסצנטית. אנו מפשט גישה זו והצלחנו לצמצם באופן משמעותי את זמן הטיפול ואת כמות הדם הדרושה לניתוח.
תאים קפואים יכולים גם להיות מנותח באמצעות שיטה זו, המעיד על כך ששיטה זו מתאימה באופן מתאים למחקרים מתוך מגוון. השימושיות של גישה זו תהיה משופרת עוד יותר על ידי שילוב מצב איגוד ניטור עם סמנים אימונולוגיים אחרים, כגון קי-67, של תאי T המאוגדים PD-1 – חסימת נוגדנים10. מחקרים עתידיים צריך להשתמש בשיטה שלנו בשילוב עם תאים בודדים RNA ברצף וברצף קולטן תא T כדי לנסות לזהות ולאפיין את קבוצות המשנה הספציפיות של תאי T המאוגדים PD-1 – חסימת נוגדנים ואחראים irAEs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים S.K. מן החברה היפן לקידום המדע KAKENHI (JP17K16045) ואת הסוכנות היפן למחקר ופיתוח רפואי (JP18cm0106335 ו-19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
