Summary
Nous avons développé un essai simple de cytométrie de flux pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules De, exigeant seulement une goutte de sang périphérique des patients cancéreux.
Abstract
Les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, y compris les anticorps de blocage de la DP-1, ont considérablement amélioré les résultats du traitement dans divers types de cancer. L'efficacité pharmacologique de ces immunothérapies est durable, s'étendant même au-delà de l'arrêt de leurs injections, en raison des concentrations persistantes de sang. Ici, nous avons développé un essai de cytométrie de flux simple pour évaluer l'état de liaison des lymphocytes T des anticorps PD-1-bloquant nivolumab et pembrolizumab. Comme un test de glucose, cet essai ne nécessite qu'une seule goutte de sang périphérique. La visualisation de la liaison des anticorps sur les lymphocytes T est plus fiable que la mesure des concentrations sanguines d'anticorps. En outre, si nécessaire, nous pouvons potentiellement analyser de nombreux marqueurs distinctifs liés au système immunitaire sur les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-bloquant. Ainsi, il s'agit d'une stratégie simple et mini-invasive pour analyser l'effet pharmacologique des anticorps de Blocage de PD-1-blocage dans les patients cancéreux.
Introduction
Les anticorps de blocage de PD-1 sont devenus le choix standard pour le traitement de divers types de cancer, y compris le cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC)1,2,3,4. Ils montrent un effet thérapeutique remarquable dans un sous-ensemble de patients cancéreux qui n'ont pas répondu aux chimiothérapies cytotoxiques conventionnelles. Cependant, les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (IIC), qui comprennent les anticorps de blocage de la DP-1, peuvent causer un spectre unique et distinct d'événements indésirables, appelés événements indésirables liés au système immunitaire (IRAE)5. Bien que les irAE peuvent affecter presque tous les tissus, ils sont le plus souvent observés dans le tractus gastro-intestinal, les glandes endocrines, la peau et le foie, et ils peuvent causer le prurit, éruption cutanée, nausées, diarrhée, et troubles thyroïdiens6,7. En général, la plupart des irAE apparaissent dans les 1 à 2 mois suivant le déclenchement des ICI. Cependant, dans certains cas, ils peuvent se produire plus tard que 1 an après le début du traitement ou même après l'arrêt du traitement6,7. Ils causent également divers symptômes qui peuvent être difficiles à distinguer d'autres pathologies. Ainsi, il peut être difficile de diagnostiquer rapidement irAEs et de les traiter de façon appropriée. irAEs peut affecter tous les tissus, et leur arrivée est fortement influencée par la circulation des cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T liés aux anticorps PD-1-blocage. Par conséquent, une méthode simple et mini-invasive pour surveiller les lymphocytes T ciblés par les anticorps est importante dans les milieux cliniques.
Ici, nous avons développé une méthode simple pour évaluer la liaison des anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T utilisant une goutte de sang entier périphérique des patients de cancer qui ont reçu le nivolumab ou le pembrolizumab. En utilisant cette approche, nous avons pu surveiller chacun des éléments suivants : 1) la durée de la liaison des anticorps aux lymphocytes T, 2) l'occupation des molécules De Lymph PD-1 par des anticorps thérapeutiques, et 3) l'état d'activation et les caractéristiques immunologiques des lymphocytes T. Cette méthode est une modification d'une technique précédemment rapportée8. La quantité de sang nécessaire est presque la même que celle nécessaire pour un test de glucose, et l'approche ne nécessite pas d'enrichissement cellulaire mononucléaire ou de co-culture avec des anticorps PD-1-blocage. Nous avons confirmé que cette méthode peut également être effectuée à l'aide d'échantillons congelés, y compris les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et les cellules de l'effusion pleurale, l'effusion péricardique, le liquide de lavage bronchoalveolar, et le liquide céphalo-rachidien, suggérant que cette stratégie puisse être utile dans le contexte d'une étude multicentrique. Cette méthode peut faciliter le diagnostic précoce des irAE, et également aider à déterminer les traitements immunosuppresseurs appropriés pour contrôler leurs symptômes et d'identifier les moments optimaux pour initier des thérapies ultérieures après inhibiteurs de PD-1.
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Protocol
L'échantillonnage a été effectué pendant les procédures cliniques courantes. Tous les échantillons humains ont été obtenus après que le consentement éclairé a été fourni par les sujets, conformément à la Déclaration d'Helsinki et avec l'approbation du comité d'examen éthique de l'École supérieure de médecine de l'Université d'Osaka, au Japon (15383 et 752).
1. Préparation d'échantillons de sang entier et coloration
- Recueillir des échantillons de sang entier dans des tubes de collecte de sang contenant de l'acide tétratique de diaté-acétique (EDTA) contenant de l'acide tétratique de la diamine d'éthylène.
REMARQUE : La collecte de sang peut être effectuée à l'aide d'une aiguille ordinaire ou d'une lancette sanguine. - Transférer 20 l d'échantillons de sang entier dans des tubes de cytométrie à fond rond à fond rond de 5 ml.
REMARQUE : Pour réduire la liaison non spécifique des cellules aux tubes, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) de 2 % dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) est ajouté dans les tubes et vortexé pendant 10 s avant l'application aux échantillons. - Ajouter 20 'L de 2% FBS dans PBS.
- Ajouter 10 L de réactif de blocage FcR spécifique à l'homme. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 500 l de tampon de lyse des globules rouges. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Ajouter 4 ml de 2 % de FBS en PBS et faire tourner les cellules à 400 x g (1 500 tr/min) pendant 5 min à 4 oC. Enlever le supernatant par aspiration.
- Répétez le processus de lavage et d'aspiration décrit à l'étape 1.6.
- Resuspendre les cellules dans 100 'L de 2% FBS en PBS et diviser en deux tubes de 50 'L chacun.
- Ajouter les anticorps marqueurs de surface (tableau 1). Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
REMARQUE : Lors du profilage du statut immunitaire des lymphocytes T, le nombre de marqueurs peut être augmenté en fonction de la qualité de la machine de cytométrie de flux. - Laver les échantillons 2x tel que décrit à l'étape 1.6.
- Resuspendre les cellules dans 200 'L de 2% FBS dans PBS.
2. Analyse cytométrique de flux
- Insérez des tubes dans le cytomètre d'écoulement et acquérez des cellules, suivant essentiellement le protocole recommandé9.
- Enregistrez 10 000 événements comme la porte des lymphocytes (figure 1A) et les données sur les flux d'exportation sous forme de fichiers .fcs aux fins d'analyse.
- Ouvrez les fichiers dans le logiciel d'analyse. Visualisez les cellules sur une diffusion vers l'avant (FSC) (A) vs la dispersion latérale (SSC) (A) parcelle et les lymphocytes porte (Figure 1A).
- Après avoir sélectionné des cellules individuelles à l'aide de FSC (H) vs FSC (W) et SSC (H) vs SSC (W) (Figure 1B) et les afficher sur un CD3 vs CD8 ou CD3 vs CD4 parcelle, porte les cellules T CD8 et CD4 lymphocytes T, respectivement (Figure 1C).
- Après avoir sélectionné les cellules fermées et les avoir exposées sur une parcelle DP-1 vs Humaine IgG4, identifiez les cellules CD8 et CD4 liées par les anticorps PD-1-bloquants en fonction du contrôle de l'isotype (Figure 1D).
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Representative Results
La stratégie de gating et l'analyse de cytométrie de flux (figure 1) peuvent détecter la liaison d'anticorps de PD-1-bloquant aux cellules T obtenues à partir d'une goutte de sang périphérique patient de NSCLC. Avant l'administration de l'anticorps PD-1-bloquant, il n'y a pas de cellules CD8 ou CD4 positives humaines, et l'expression PD-1 peut être confirmée par un anticorps de détection de PD-1 (EH12.1)(figure 2A). Après l'administration du nivolumab ou du pembrolizumab, igG4 (nivolumab, pembrolizumab) peut être détecté sur les lymphocytes T par un anticorps anti-IgG4 (HP6025) alors que l'anticorps de détection de PD-1 EH12.1 ne reconnaît aucun PD-1 sur les lymphocytes T parce que les anticorps thérapeutiques PD-1 perturbent eh12.1. Cela signifie que nous mesurons indirectement la liaison thérapeutique de l'anticorps PD-1-bloquant basé sur l'absence de liaison de l'anticorps de détection de PD-1. Les données représentatives montrent les différents statuts contraignants des anticorps de blocage PD-1(figure 2A). Nivolumab et pembrolizumab liaison et l'occupation de PD-1 sur les lymphocytes T diminuent au fil du temps10, et il ya liaison partielle (PB), qui est montré dans la zone double-positive, et enfin la perte complète de liaison (LB) (Figure 2B).
Figure 1 : Stratégie de gating représentative pour évaluer la liaison des anticorps de blocage PD-1 aux lymphocytes T à partir d'une goutte de sang périphérique. (A) FSC (A) vs SSC (A) parcelle et gating des lymphocytes. (B) Les doublets sont exclus en dessinant des barrières autour de la population de cellules principales sur des parcelles de FSC (H) vs FSC (W) et SSC (H) vs SSC (W). (C) CD3 vs CD8 parcelle (supérieur) et CD3 vs CD4 parcelle (inférieur) et gating des cellules T CD8 et CD4 lymphocytes T, respectivement. (D) PD-1 vs humain IgG4 parcelle et la détection de la liaison du nivolumab (un anticorps PD-1-blocage) aux cellules CD8 et CD4 T. Les points oranges et les points noirs indiquent respectivement la coloration de l'anticorps anti-IgG4 et du contrôle de l'isotype. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse de cytométrie du débit représentatif indiquant le changement de statut contraignant des anticorps de blocage PD-1.1. (A) La coloration de PD-1 et d'IgG4 humain dans les cellules T CD8 du sang patient ICI-prétraité a été évaluée par cytométrie de flux (gauche). Dix microlitres de sang prétraité ont été traités avec la dilution sérielle du nivolumab pendant 15 min, et des étapes 1.4 à 1.10 du protocole ont été accomplies. La liaison complète (CB) (rouge), la liaison partielle (PB) (bleu) et la perte de liaison (LB) (vert) sont définies par les portes indiquées. (B) L'état de l'anticorps PD-1-bloquant se liant aux lymphocytes T CD8 a été analysé aux points de temps de suivi, comme indiqué, chez les patients de NSCLC qui ont discontinué le nivolumab et le pembrolizumab. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Pe | BV421 BV421 (bv421) | PE-Cy7 (en) | APC-Cy7 (en anglais seulement) | BV510 (en anglais seulement) | |
| Évaluation contraignante | IgG4 (en) | CD3 (en) | PD-1 | CD4 (en) | CD8 (en) |
| Contrôle de l'isotype | Contrôle de l'isotype | CD3 (en) | Contrôle de l'isotype | CD4 (en) | CD8 (en) |
Tableau 1 : Anticorps utilisés dans l'analyse cytométrique du débit.
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Discussion
Dans cet article, nous rapportons une méthode utilisant un cytomètre de flux pour détecter les anticorps de PD-1-bloquant lié aux cellules T dérivées d'une goutte de sang périphérique, que nous avons à l'origine développé pour la détection de nivolumab10. Bien que cette technique soit très simple et facile à exécuter, deux points importants doivent être notés afin d'obtenir des résultats précis. La première est que pour détecter les molécules de PD-1, un anticorps approprié qui est en concurrence avec le nivolumab et le pembrolizumab devrait être utilisé. Cette question a été évaluée dans une étude précédente11. L'autre est que la lyse RBC doit être effectuée à fond avant la coloration de surface. Tant qu'un contrôle isotype est établi pour chaque analyse afin de déterminer la porte du cluster positif IgG4, la fréquence n'est pas affectée. Cependant, avec ce protocole, quand la lyse de RBC est insuffisante il peut y avoir des réductions du compte de cellules T dans la porte de lymphocyte et de l'intensité de chaque marqueur de surface. De plus, l'étape de lyse RBC doit être effectuée avant la coloration de surface, sinon l'anticorps anti-IgG4 (HP6025) ne fonctionne pas correctement.
La limitation de cette méthode est que la population de lymphocytes T liés aux anticorps de Blocage PD-1-bloquants comprennent des clones spécifiques de cellules T responsables d'effets thérapeutiques et d'irAEs; cependant, les fréquences de ces clones spécifiques parmi la population liée aux anticorps sont assez faibles. Par conséquent, nous avons encore besoin d'enrichir la cible spécifique en utilisant certains marqueurs, par exemple CD3912. Une autre limite est que l'intensité de fluorescence de l'IgG4 n'est pas élevée dans certains cas, ce qui rend difficile la détermination du statut contraignant (c.-à-d. PB et LB).
D'autres études ont surveillé les anticorps thérapeutiques PD-1 dans le sang pour évaluer la pharmacocinétique. La mesure de la concentration plasmatique de nivolumab ou de pembrolizumab est essentielle pour déterminer comment la quantité résiduelle de ces anticorps dans le sang est en corrélation avec le temps. Cependant, nous avons précédemment rapporté que la concentration de nivolumab ne corrélait pas complètement avec la liaison résiduelle aux cellules T10. Par rapport à la mesure de la concentration d'anticorps plasmatiques13, notre méthode peut être plus appropriée pour évaluer la liaison résiduelle des anticorps anti-PD-1 aux lymphocytes T. La méthode originale de surveillance du nivolumab se liant aux lymphocytes T dans le sang nécessitait une incubation avec du nivolumab étiqueté à la fluorescence8. Nous avons simplifié cette approche et réussi à réduire considérablement le temps d'analyse et la quantité de sang nécessaire à l'analyse.
Les cellules congelées peuvent également être analysées à l'aide de cet analyse, ce qui suggère que cette méthode convient bien aux études multicentriques. L'utilité de cette approche sera encore améliorée en combinant le statut de liaison de surveillance avec d'autres marqueurs immunologiques, tels que Ki-67, des lymphocytes T liés aux anticorps De PD-1-blocage10. Les études futures devraient utiliser notre méthode en conjonction avec le séquençage de l'ARN unicellulaire et le séquençage des récepteurs des lymphocytes T pour tenter d'identifier et de caractériser les sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T qui sont liés aux anticorps de blocage pD-1 et qui sont responsables des irAE.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions à S.K. de la Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) et de l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (JP18cm0106335 et 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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