Summary
We ontwikkelden een eenvoudige flow cytometrie test voor de evaluatie van de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen, waarbij slechts een druppel perifeer bloed van kankerpatiënten.
Abstract
Immuun checkpoint remmers, waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, hebben aanzienlijk verbeterd behandeling resultaten in verschillende vormen van kanker. De farmacologische werkzaamheid van deze immunotherapieën is langdurig en strekt zich zelfs uit tot na de stopzetting van hun injecties, als gevolg van aanhoudende bloedconcentraties. Hier ontwikkelden we een eenvoudige flow cytometrie test om de T-cel binding status van de PD-1-blokkerende antilichamen nivolumab en pembrolizumab te evalueren. Net als een glucosetest, vereist deze test slechts een druppel perifeer bloed. Het visualiseren van antilichaambinding op T-cellen is betrouwbaarder dan het meten van de concentraties van antilichamen. Bovendien, indien nodig, kunnen we potentieel analyseren veel onderscheidende immuun-gerelateerde markers op T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Dit is dus een eenvoudige en minimaal invasieve strategie om het farmacologische effect van PD-1-blokkerende antilichamen bij kankerpatiënten te analyseren.
Introduction
PD-1-blokkerende antilichamen zijn de standaardkeuze geworden voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder niet-kleincellige longkanker (NSCLC)1,2,3,4. Ze vertonen een opmerkelijk therapeutisch effect bij een subgroep van kankerpatiënten die niet hebben gereageerd op conventionele cytotoxische chemotherapieën. Immuuncontroleremmers (II's), waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, kunnen echter een uniek en duidelijk spectrum van bijwerkingen veroorzaken, zogenaamde immuungerelateerde bijwerkingen (irA's)5. Hoewel irAE's bijna alle weefsels kunnen beïnvloeden, worden ze meestal waargenomen in het maag-darmkanaal, endocriene klieren, huid en lever, en ze kunnen preutse, huiduitslag, misselijkheid, diarree en schildklieraandoeningenveroorzaken 6,7. In het algemeen verschijnen de meeste ira's binnen 1 tot 2 maanden na de opening van is-i's. In sommige gevallen kunnen ze echter later dan 1 jaar na het begin van de behandeling of zelfs na stopzetting van de behandeling6,7. Ze veroorzaken ook verschillende symptomen die moeilijk te discrimineren kunnen zijn van andere pathologieën. Het kan dus een uitdaging zijn om irAE's snel te diagnosticeren en op de juiste manier te behandelen. irAE's kunnen invloed hebben op alle weefsels, en hun begin wordt sterk beïnvloed door circulerende immuuncellen, met name T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Daarom is een eenvoudige en minimaal invasieve methode om antilichaamgerichte T-cellen te controleren belangrijk in klinische omgevingen.
Hier ontwikkelden we een eenvoudige methode om de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen te beoordelen met behulp van een druppel perifeer volbloed van kankerpatiënten die nivolumab of pembrolizumab kregen. Met behulp van deze aanpak konden we elk van de volgende monitoren: 1) de duur van antilichaambinding aan T-cellen, 2) de bezetting van T-cel PD-1 moleculen door therapeutische antilichamen, en 3) de activeringsstatus en immunologische kenmerken van T-cellen. Deze methode is een wijziging van een eerder gerapporteerde techniek8. De benodigde hoeveelheid bloed is bijna gelijk aan die nodig is voor een glucosetest, en de aanpak vereist geen mononucleaire celverrijking of co-culturing met PD-1-blokkerende antilichamen. We hebben bevestigd dat deze methode ook kan worden uitgevoerd met behulp van bevroren monsters, waaronder perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en cellen uit pleurale effusie, pericardiale effusie, bronchoalveolar lavage vloeistof, en hersenvocht, wat suggereert dat deze strategie nuttig kan zijn in de context van een multicenter studie. Deze methode kan de vroege diagnose van irAE's vergemakkelijken en ook helpen bij het bepalen van de juiste immunosuppressieve behandelingen om hun symptomen onder controle te houden en de optimale tijden te identificeren om latere therapieën na PD-1-remmers te starten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De bemonstering werd uitgevoerd tijdens routineklinische procedures. Alle menselijke monsters werden verkregen nadat geïnformeerde toestemming werd verstrekt door de proefpersonen, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en met de goedkeuring van de ethische toetsingscommissie van de Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 en 752).
1. Volkoren monster voorbereiding en kleuring
- Verzamel bloedmonsters in bloedafnamebuizen met ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA).
OPMERKING: Bloedafname kan worden uitgevoerd met behulp van een gewone naald of een bloedlancet. - Breng 20 μL volbloedmonsters over naar 5 mL round-bottom polystyreenstroomcytometriebuizen.
OPMERKING: Om de niet-specifieke binding van cellen aan buizen te verminderen, wordt 1 mL van 2% foetaal runderserum (FBS) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toegevoegd in buizen en gedurende 10 s vortexed voordat ze op monsters worden aangebracht. - Voeg 20 μL van 2% FBS toe aan PBS.
- Voeg 10 μL menselijk-specifieke FcR-blokkeringsreatoeër toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 500 μL rode bloedcellysebuffer toe. Meng goed en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 mL van 2% FBS toe in PBS en draai cellen bij 400 x g (1.500 tpm) voor 5 min bij 4 °C. Verwijder supernatant door aspiratie.
- Herhaal het was- en aspiratieproces beschreven in stap 1.6.
- Cellen opnieuw opschorten in 100 μL van 2% FBS in PBS en verdelen in twee buizen van elk 50 μL.
- Voeg antilichamen van oppervlaktemarkeringtoe(tabel 1 )toe . Meng goed en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
OPMERKING: Bij het profileren van de T-cel immuunstatus, kan het aantal markers worden verhoogd op basis van de stroom cytometrie machine kwaliteit. - Was monsters 2x zoals beschreven in stap 1.6.
- Cellen opnieuw opschorten in 200 μL van 2% FBS in PBS.
2. Flow Cytometrische Analyse
- Steek buizen in de flow cytometer en verwerven cellen, in principe volgens het aanbevolen protocol9.
- Noteer 10.000 gebeurtenissen als de lymfocytenpoort (figuur 1A) en exportstroomgegevens als .fcs-bestanden voor analyse.
- Open bestanden in de analysesoftware. Visualiseer de cellen op een voorwaartse verstrooiing (FSC) (A) versus zijverstrooiing (SSC) (A) plot en poortlymfocyten(figuur 1A).
- Nadat u afzonderlijke cellen hebt geselecteerd met FSC (H) vs. FSC (W) en SSC (H) vs. SSC (W)(figuur 1B) en deze hebt weergegeven op een CD3 vs. CD8 of CD3 vs. CD4-plot, wordt de CD8 T-cellen en CD4 T-cellen(figuur 1C)gepoort.
- Nadat u de gated cells hebt geselecteerd en ze hebt weergegeven op een PD-1 vs. menselijke IgG4-plot, identificeert u PD-1-blokkerende antilichaamgebonden CD8- en CD4 T-cellen op basis van isotypebesturing(figuur 1D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gating strategie en flow cytometrie analyse (Figuur 1) kan detecteren PD-1-blokkerenantilichaam binding aan T-cellen verkregen uit een daling van NSCLC patiënt perifere bloed. Voordat PD-1-blokkerende antilichaam wordt toegediend, zijn er geen menselijke IgG4-positieve CD8- of CD4 T-cellen aanwezig en kan PD-1-expressie worden bevestigd door een PD-1-detectieantilichaam (EH12.1) (figuur 2A). Na nivolumab of pembrolizumab toediening kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) op T-cellen worden gedetecteerd door anti-IgG4-antilichaam (HP6025) terwijl de PD-1-detectie van antilichaam EH12.1 geen PD-1 op T-cellen herkent omdat therapeutische PD-1-antilichamen EH12.1-binding verstoren. Dit betekent dat we indirect de therapeutische binding van PD-1-blokkerende antilichaam meten op basis van het gebrek aan binding van PD-1-detecterende antilichaam. Representatieve gegevens tonen de verschillende bindende statussen van PD-1-blokkerende antilichaam(figuur 2A). Nivolumab en pembrolizumab binding en bezetting van PD-1 op T-cellen afnemen in de loop van de tijd10, en er is gedeeltelijke binding (PB), die wordt weergegeven in het dubbel-positieve gebied, en ten slotte volledig verlies van binding (LB) (figuur 2B).
Figuur 1: Representatieve gating strategie om PD-1-blokkerenantilichaam binding aan T-cellen te evalueren van een druppel perifeer bloed. (A) FSC (A) vs. SSC (A) plot en gating van lymfocyten. (B) Doublets zijn uitgesloten door het tekenen van poorten rond de belangrijkste celpopulatie op percelen FSC (H) vs. FSC (W) en SSC (H) vs. SSC (W). (C) CD3 vs. CD8 plot (bovenste) en CD3 vs. CD4 plot (lager) en gating van CD8 T cellen en CD4 T cellen, respectievelijk. (D) PD-1 vs. menselijke IgG4 plot en detectie van de binding van nivolumab (een PD-1-blokkerenantilichaam) aan CD8 en CD4 T cellen. Oranje stippen en zwarte stippen geven respectievelijk anti-IgG4-antilichaam en isotypecontrole kleuring aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve stroomcytometrieanalyse die de verandering in de bindende status van PD-1-blokkerende antilichamen aangeeft. (A) Kleuring van PD-1 en menselijke IgG4 in CD8 T cellen uit ICI-voorbehandelde patiënt bloed werd geëvalueerd door flow cytometrie (links). Tien microliter voorbehandeld bloed werd behandeld met seriële verdunning van nivolumab gedurende 15 min, en de stappen 1.4 tot 1.10 van het protocol werden voltooid. Volledige binding (CB) (rood), gedeeltelijke binding (PB) (blauw) en verlies van binding (LB) (groen) worden gedefinieerd door de aangegeven poorten. (B) De status van PD-1-blokkerende antilichaambinding aan CD8 T-cellen werd geanalyseerd op de follow-up tijdspunten, zoals aangegeven, bij NSCLC-patiënten die gestopt nivolumab en pembrolizumab. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Bindende evaluatie | IgG4 IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Isotype-besturingselement | Isotype-besturingselement | CD3 | Isotype-besturingselement | CD4 | CD8 |
Tabel 1: Antilichamen die worden gebruikt bij stroomcytometrische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel rapporteren we een methode met behulp van een flow cytometer om PD-1-blokkerende antilichamen te detecteren die gebonden zijn aan T-cellen afkomstig van een druppel perifeer bloed, die we oorspronkelijk ontwikkelden voor nivolumabdetectie10. Hoewel deze techniek is zeer eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, twee belangrijke punten moeten worden opgemerkt om nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Een daarvan is dat om PD-1 moleculen te detecteren, een geschikt antilichaam dat concurreert met nivolumab en pembrolizumab moet worden gebruikt. Dit probleem werd geëvalueerd in een eerdere studie11. De andere is dat RBC lyse grondig moet worden uitgevoerd voordat de oppervlakte vlekken. Zolang voor elke test een isotype-controle wordt ingesteld om de poort van het IgG4-positieve cluster te bepalen, wordt de frequentie niet beïnvloed. Echter, met dit protocol, wanneer RBC lyse onvoldoende is, kunnen er verminderingen van zowel de T-cel telling in de lymfocyten poort en van de intensiteit van elke oppervlaktemarker. Bovendien moet de RBC lysis stap worden uitgevoerd voor oppervlaktekleuring, anders functioneert het anti-IgG4-antilichaam (HP6025) niet goed.
De beperking van deze methode is dat de populatie van T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen specifieke T-celklonen bevatten die verantwoordelijk zijn voor therapeutische effecten en irAEs; echter, de frequenties van deze specifieke klonen onder de antilichaam-gebonden bevolking zijn vrij laag. Daarom moeten we nog steeds de specifieke doelstelling verrijken met behulp van bepaalde markeringen, bijvoorbeeld CD3912. Een andere beperking is dat de fluorescentieintensiteit van IgG4 in sommige gevallen niet hoog is, waardoor het moeilijk is om de bindende status (pb en LB) vast te stellen.
Andere studies hebben gestoofd therapeutische PD-1 antilichamen in het bloed om farmacokinetiek te evalueren. Het meten van de plasmaconcentratie van nivolumab of pembrolizumab is essentieel om te bepalen hoe de resthoeveelheid van deze antilichamen in het bloed correleert met de tijd. We meldden echter eerder dat de concentratie van nivolumab niet volledig correleert met restbinding aan T-cellen10. In vergelijking met de meting van plasmaantilichaamconcentratie13kan onze methode beter geschikt zijn voor de beoordeling van de resterende binding van anti-PD-1-antilichamen tegen T-cellen. De oorspronkelijke methode voor het monitoren van nivolumab binding aan T-cellen in het bloed vereiste incubatie met fluorescentie-gelabelde nivolumab8. We hebben deze aanpak vereenvoudigd en zijn erin geslaagd de testtijd en de hoeveelheid bloed die nodig is voor analyse aanzienlijk te verminderen.
Bevroren cellen kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van deze test, wat suggereert dat deze methode is een goede pasvorm voor multicenter studies. Het nut van deze aanpak zal verder worden versterkt door het combineren van de bindende status van toezicht met andere immunologische markers, zoals Ki-67, van T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen10. Toekomstige studies moeten onze methode gebruiken in combinatie met eencellige RNA-sequencing en T-celreceptorsequencing om te proberen de specifieke subsets van T-cellen te identificeren en te karakteriseren die gebonden zijn aan PD-1-blokkerende antilichamen en verantwoordelijk zijn voor irAE's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan S.K. van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) en het Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 en 19cm0106310).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
- Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
- Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
- Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
- Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
- Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
- Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
- Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
- Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).
