Summary

Monitoramento de anticorpos bloqueadores pd-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar a ligação de anticorpos bloqueadores PD-1 às células T, exigindo apenas uma gota de sangue periférico de pacientes com câncer.

Abstract

Os inibidores de checkpoint imunológico, incluindo anticorpos de bloqueio pd-1, melhoraram significativamente os resultados do tratamento em vários tipos de câncer. A eficácia farmacológica dessas imunoterapias é duradoura, estendendo-se até mesmo além da descontinuação de suas injeções, devido às persistentes concentrações sanguíneas. Aqui desenvolvemos um simples ensaio de citometria de fluxo para avaliar o status de ligação de células T dos anticorpos pd-1 de bloqueio nivolumab e pembrolizumabe. Como um teste de glicose, este ensaio requer apenas uma única gota de sangue periférico. Visualizar anticorpos ligados em células T é mais confiável do que medir concentrações sanguíneas de anticorpos. Além disso, se necessário, podemos potencialmente analisar muitos marcadores imunológicos distintos em células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Assim, trata-se de uma estratégia simples e minimamente invasiva para analisar o efeito farmacológico dos anticorpos bloqueadores de PD-1 em pacientes com câncer.

Introduction

Os anticorpos de bloqueio pd-1 tornaram-se a escolha padrão para o tratamento de vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC)1,2,3,4. Eles mostram um notável efeito terapêutico em um subconjunto de pacientes com câncer que não responderam às quimioterapias citotóxicas convencionais. No entanto, os inibidores de ponto de verificação imunológica (ICIs), que incluem anticorpos pd-1-bloqueio, podem causar um espectro único e distinto de eventos adversos, denominados eventos adversos relacionados à imunológica (irAEs)5. Embora os irAEs possam afetar quase todos os tecidos, eles são mais comumente observados no trato gastrointestinal, glândulas endócrinas, pele e fígado, e podem causar distúrbios pruritos, erupção cutânea, náusea, diarreia e tireoide6,7. Em geral, a maioria dos irAEs aparecem dentro de 1 a 2 meses após o início das ICIs. No entanto, em alguns casos, eles podem ocorrer mais de 1 ano após o início do tratamento ou mesmo após a cessação do tratamento6,7. Eles também causam vários sintomas que podem ser difíceis de discriminar outras patologias. Assim, pode ser desafiador diagnosticar prontamente os irAEs e tratá-los adequadamente. os irAEs podem afetar todos os tecidos, e seu início é fortemente influenciado pelas células imunes circulantes, especialmente as células T ligadas a anticorpos bloqueadores PD-1. Portanto, um método simples e minimamente invasivo para monitorar células T direcionadas a anticorpos é importante em ambientes clínicos.

Aqui, desenvolvemos um método simples para avaliar a vinculação de anticorpos pd-1 a células T usando uma gota de sangue inteiro periférico de pacientes com câncer que receberam nivolumab ou pembrolizumabe. Usando essa abordagem, pudemos monitorar cada um dos seguintes: 1) a duração da ligação de anticorpos às células T, 2) a ocupação de moléculas de PD-1 por anticorpos terapêuticos e 3) o status de ativação e características imunológicas das células T. Este método é uma modificação de uma técnica8relatada anteriormente . A quantidade de sangue necessária é quase a mesma necessária para um teste de glicose, e a abordagem não requer enriquecimento mononuclear celular ou co-culturing com anticorpos pd-1-bloqueio. Confirmamos que esse método também pode ser realizado utilizando amostras congeladas, incluindo células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e células de derrame pleural, derrame pericárdico, fluido de lavage broncoaveolar e fluido cerebrorraquidiano, sugerindo que essa estratégia pode ser útil no contexto de um estudo multicêntrico. Esse método pode facilitar o diagnóstico precoce dos irAEs, e também ajudar a determinar os tratamentos imunossupressores adequados para controlar seus sintomas e identificar os horários ideais para iniciar terapias subsequentes após inibidores de PD-1.

Protocol

A amostragem foi realizada durante os procedimentos clínicos de rotina. Todas as amostras humanas foram obtidas após o consentimento informado foi fornecido pelos sujeitos, de acordo com a Declaração de Helsinque e com a aprovação do conselho de revisão ética da Faculdade de Pós-Graduação em Medicina, Universidade de Osaka, Japão (15383 e 752). 1. Preparação e coloração de amostras de sangue inteiro Colete amostras de sangue inteiras em tubos de coleta de sangue conte…

Representative Results

A estratégia de gating e a análise de citometria de fluxo(Figura 1)podem detectar a ligação de anticorpos PD-1 a células T obtidas a partir de uma queda de sangue periférico do paciente NSCLC. Antes que o anticorpo de bloqueio PD-1 seja administrado, nenhuma célula de CD8 ou CD4 Positivo humana está presente, e a expressão PD-1 pode ser confirmada por um anticorpo PD-1 -detecting (EH12.1) (Figura 2A). Após a administração nivolumab o…

Discussion

Neste artigo, relatamos um método usando um címetro de fluxo para detectar anticorpos bloqueadores PD-1 ligados a células T derivadas de uma gota de sangue periférico, que originalmente desenvolvemos para detecção de nivolumab10. Embora essa técnica seja muito simples e fácil de executar, dois pontos importantes devem ser notados para obter resultados precisos. Uma delas é que para detectar moléculas PD-1, deve-se usar um anticorpo apropriado que compete com nivolumab e pembrolizumabe. E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios para S.K. da Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) e pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (JP18cm0106335 e 19cm0106310).

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) Thermo Fisher Scientific 00-4300-54 50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody BioLegend 300518 Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody BioLegend 301048 Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline nacalai tesque 14249-95 500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes STEMCELL Technologies 352058 5 mL
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901 2 mL
FLOWJO BD
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12676029 500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control abcam ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc abcam ab99825 Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 BD 558117 Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) BD 561272 Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557646

References

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Cite This Article
Naito, Y., Osa, A., Masuhiro, K., Hirai, T., Koyama, S., Kumanogoh, A. Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (156), e60608, doi:10.3791/60608 (2020).

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