We ontwikkelden een eenvoudige flow cytometrie test voor de evaluatie van de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen, waarbij slechts een druppel perifeer bloed van kankerpatiënten.
Immuun checkpoint remmers, waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, hebben aanzienlijk verbeterd behandeling resultaten in verschillende vormen van kanker. De farmacologische werkzaamheid van deze immunotherapieën is langdurig en strekt zich zelfs uit tot na de stopzetting van hun injecties, als gevolg van aanhoudende bloedconcentraties. Hier ontwikkelden we een eenvoudige flow cytometrie test om de T-cel binding status van de PD-1-blokkerende antilichamen nivolumab en pembrolizumab te evalueren. Net als een glucosetest, vereist deze test slechts een druppel perifeer bloed. Het visualiseren van antilichaambinding op T-cellen is betrouwbaarder dan het meten van de concentraties van antilichamen. Bovendien, indien nodig, kunnen we potentieel analyseren veel onderscheidende immuun-gerelateerde markers op T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Dit is dus een eenvoudige en minimaal invasieve strategie om het farmacologische effect van PD-1-blokkerende antilichamen bij kankerpatiënten te analyseren.
PD-1-blokkerende antilichamen zijn de standaardkeuze geworden voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder niet-kleincellige longkanker (NSCLC)1,2,3,4. Ze vertonen een opmerkelijk therapeutisch effect bij een subgroep van kankerpatiënten die niet hebben gereageerd op conventionele cytotoxische chemotherapieën. Immuuncontroleremmers (II’s), waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, kunnen echter een uniek en duidelijk spectrum van bijwerkingen veroorzaken, zogenaamde immuungerelateerde bijwerkingen (irA’s)5. Hoewel irAE’s bijna alle weefsels kunnen beïnvloeden, worden ze meestal waargenomen in het maag-darmkanaal, endocriene klieren, huid en lever, en ze kunnen preutse, huiduitslag, misselijkheid, diarree en schildklieraandoeningenveroorzaken 6,7. In het algemeen verschijnen de meeste ira’s binnen 1 tot 2 maanden na de opening van is-i’s. In sommige gevallen kunnen ze echter later dan 1 jaar na het begin van de behandeling of zelfs na stopzetting van de behandeling6,7. Ze veroorzaken ook verschillende symptomen die moeilijk te discrimineren kunnen zijn van andere pathologieën. Het kan dus een uitdaging zijn om irAE’s snel te diagnosticeren en op de juiste manier te behandelen. irAE’s kunnen invloed hebben op alle weefsels, en hun begin wordt sterk beïnvloed door circulerende immuuncellen, met name T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Daarom is een eenvoudige en minimaal invasieve methode om antilichaamgerichte T-cellen te controleren belangrijk in klinische omgevingen.
Hier ontwikkelden we een eenvoudige methode om de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen te beoordelen met behulp van een druppel perifeer volbloed van kankerpatiënten die nivolumab of pembrolizumab kregen. Met behulp van deze aanpak konden we elk van de volgende monitoren: 1) de duur van antilichaambinding aan T-cellen, 2) de bezetting van T-cel PD-1 moleculen door therapeutische antilichamen, en 3) de activeringsstatus en immunologische kenmerken van T-cellen. Deze methode is een wijziging van een eerder gerapporteerde techniek8. De benodigde hoeveelheid bloed is bijna gelijk aan die nodig is voor een glucosetest, en de aanpak vereist geen mononucleaire celverrijking of co-culturing met PD-1-blokkerende antilichamen. We hebben bevestigd dat deze methode ook kan worden uitgevoerd met behulp van bevroren monsters, waaronder perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) en cellen uit pleurale effusie, pericardiale effusie, bronchoalveolar lavage vloeistof, en hersenvocht, wat suggereert dat deze strategie nuttig kan zijn in de context van een multicenter studie. Deze methode kan de vroege diagnose van irAE’s vergemakkelijken en ook helpen bij het bepalen van de juiste immunosuppressieve behandelingen om hun symptomen onder controle te houden en de optimale tijden te identificeren om latere therapieën na PD-1-remmers te starten.
In dit artikel rapporteren we een methode met behulp van een flow cytometer om PD-1-blokkerende antilichamen te detecteren die gebonden zijn aan T-cellen afkomstig van een druppel perifeer bloed, die we oorspronkelijk ontwikkelden voor nivolumabdetectie10. Hoewel deze techniek is zeer eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, twee belangrijke punten moeten worden opgemerkt om nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Een daarvan is dat om PD-1 moleculen te detecteren, een geschikt antilichaam dat concur…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan S.K. van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) en het Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 en 19cm0106310).
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
FLOWJO | BD | ||
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control | abcam | ab81200 | |
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |