Summary

Monitoring PD-1-Blocking Antilichamen gebonden aan T-cellen afgeleid van een druppel perifeer bloed

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

We ontwikkelden een eenvoudige flow cytometrie test voor de evaluatie van de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen, waarbij slechts een druppel perifeer bloed van kankerpatiënten.

Abstract

Immuun checkpoint remmers, waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, hebben aanzienlijk verbeterd behandeling resultaten in verschillende vormen van kanker. De farmacologische werkzaamheid van deze immunotherapieën is langdurig en strekt zich zelfs uit tot na de stopzetting van hun injecties, als gevolg van aanhoudende bloedconcentraties. Hier ontwikkelden we een eenvoudige flow cytometrie test om de T-cel binding status van de PD-1-blokkerende antilichamen nivolumab en pembrolizumab te evalueren. Net als een glucosetest, vereist deze test slechts een druppel perifeer bloed. Het visualiseren van antilichaambinding op T-cellen is betrouwbaarder dan het meten van de concentraties van antilichamen. Bovendien, indien nodig, kunnen we potentieel analyseren veel onderscheidende immuun-gerelateerde markers op T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Dit is dus een eenvoudige en minimaal invasieve strategie om het farmacologische effect van PD-1-blokkerende antilichamen bij kankerpatiënten te analyseren.

Introduction

PD-1-blokkerende antilichamen zijn de standaardkeuze geworden voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder niet-kleincellige longkanker (NSCLC)1,2,3,4. Ze vertonen een opmerkelijk therapeutisch effect bij een subgroep van kankerpatiënten die niet hebben gereageerd op conventionele cytotoxische chemotherapieën. Immuuncontroleremmers (II’s), waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, kunnen echter een uniek en duidelijk spectrum van bijwerkingen veroorzaken, zogenaamde immuungerelateerde bijwerkingen (irA’s)5. Hoewel irAE’s bijna alle weefsels kunnen beïnvloeden, worden ze meestal waargenomen in het maag-darmkanaal, endocriene klieren, huid en lever, en ze kunnen preutse, huiduitslag, misselijkheid, diarree en schildklieraandoeningenveroorzaken 6,7. In het algemeen verschijnen de meeste ira’s binnen 1 tot 2 maanden na de opening van is-i’s. In sommige gevallen kunnen ze echter later dan 1 jaar na het begin van de behandeling of zelfs na stopzetting van de behandeling6,7. Ze veroorzaken ook verschillende symptomen die moeilijk te discrimineren kunnen zijn van andere pathologieën. Het kan dus een uitdaging zijn om irAE’s snel te diagnosticeren en op de juiste manier te behandelen. irAE’s kunnen invloed hebben op alle weefsels, en hun begin wordt sterk beïnvloed door circulerende immuuncellen, met name T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Daarom is een eenvoudige en minimaal invasieve methode om antilichaamgerichte T-cellen te controleren belangrijk in klinische omgevingen.

Hier ontwikkelden we een eenvoudige methode om de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen te beoordelen met behulp van een druppel perifeer volbloed van kankerpatiënten die nivolumab of pembrolizumab kregen. Met behulp van deze aanpak konden we elk van de volgende monitoren: 1) de duur van antilichaambinding aan T-cellen, 2) de bezetting van T-cel PD-1 moleculen door therapeutische antilichamen, en 3) de activeringsstatus en immunologische kenmerken van T-cellen. Deze methode is een wijziging van een eerder gerapporteerde techniek8. De benodigde hoeveelheid bloed is bijna gelijk aan die nodig is voor een glucosetest, en de aanpak vereist geen mononucleaire celverrijking of co-culturing met PD-1-blokkerende antilichamen. We hebben bevestigd dat deze methode ook kan worden uitgevoerd met behulp van bevroren monsters, waaronder perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) en cellen uit pleurale effusie, pericardiale effusie, bronchoalveolar lavage vloeistof, en hersenvocht, wat suggereert dat deze strategie nuttig kan zijn in de context van een multicenter studie. Deze methode kan de vroege diagnose van irAE’s vergemakkelijken en ook helpen bij het bepalen van de juiste immunosuppressieve behandelingen om hun symptomen onder controle te houden en de optimale tijden te identificeren om latere therapieën na PD-1-remmers te starten.

Protocol

De bemonstering werd uitgevoerd tijdens routineklinische procedures. Alle menselijke monsters werden verkregen nadat geïnformeerde toestemming werd verstrekt door de proefpersonen, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en met de goedkeuring van de ethische toetsingscommissie van de Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 en 752). 1. Volkoren monster voorbereiding en kleuring Verzamel bloedmonsters in bloedafnamebuizen met ethyleendiamine tetra-azijnzu…

Representative Results

De gating strategie en flow cytometrie analyse (Figuur 1) kan detecteren PD-1-blokkerenantilichaam binding aan T-cellen verkregen uit een daling van NSCLC patiënt perifere bloed. Voordat PD-1-blokkerende antilichaam wordt toegediend, zijn er geen menselijke IgG4-positieve CD8- of CD4 T-cellen aanwezig en kan PD-1-expressie worden bevestigd door een PD-1-detectieantilichaam (EH12.1) (figuur 2A). Na nivolumab of pembrolizumab toediening kan IgG4 …

Discussion

In dit artikel rapporteren we een methode met behulp van een flow cytometer om PD-1-blokkerende antilichamen te detecteren die gebonden zijn aan T-cellen afkomstig van een druppel perifeer bloed, die we oorspronkelijk ontwikkelden voor nivolumabdetectie10. Hoewel deze techniek is zeer eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, twee belangrijke punten moeten worden opgemerkt om nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Een daarvan is dat om PD-1 moleculen te detecteren, een geschikt antilichaam dat concur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan S.K. van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) en het Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 en 19cm0106310).

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) Thermo Fisher Scientific 00-4300-54 50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody BioLegend 300518 Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody BioLegend 301048 Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline nacalai tesque 14249-95 500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes STEMCELL Technologies 352058 5 mL
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901 2 mL
FLOWJO BD
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12676029 500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control abcam ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc abcam ab99825 Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 BD 558117 Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) BD 561272 Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557646

References

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

Play Video

Cite This Article
Naito, Y., Osa, A., Masuhiro, K., Hirai, T., Koyama, S., Kumanogoh, A. Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (156), e60608, doi:10.3791/60608 (2020).

View Video