Summary
Wir entwickelten einen einfachen Flow-Zytometrie-Assay zur Bewertung der Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen, der nur einen Tropfen peripheren Bluts von Krebspatienten erfordert.
Abstract
Immun-Checkpoint-Inhibitoren, einschließlich PD-1-blockierender Antikörper, haben die Behandlungsergebnisse bei verschiedenen Krebsarten deutlich verbessert. Die pharmakologische Wirksamkeit dieser Immuntherapien ist langanhaltend und erstreckt sich aufgrund anhaltender Blutkonzentrationen sogar über das Absetzen ihrer Injektionen hinaus. Hier haben wir einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay entwickelt, um den T-Zellbindungsstatus der PD-1-blockierenden Antikörper Nivolumab und Pembrolizumab zu bewerten. Wie ein Glukosetest erfordert dieser Test nur einen einzigen Tropfen peripheren Blutes. Die Visualisierung der Antikörperbindung an T-Zellen ist zuverlässiger als die Messung von Antikörper-Blutkonzentrationen. Darüber hinaus können wir bei Bedarf möglicherweise viele ausgeprägte immunbezogene Marker auf T-Zellen analysieren, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist dies eine einfache und minimalinvasive Strategie, um die pharmakologische Wirkung von PD-1-blockierenden Antikörpern bei Krebspatienten zu analysieren.
Introduction
PD-1-blockierende Antikörper sind zur Standardwahl für die Behandlung verschiedener Krebsarten geworden, einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)1,2,3,4. Sie zeigen eine bemerkenswerte therapeutische Wirkung bei einer Untergruppe von Krebspatienten, die nicht auf herkömmliche zytotoxische Chemotherapien angetreten haben. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs), die PD-1-blockierende Antikörper enthalten, können jedoch ein einzigartiges und ausgeprägtes Spektrum unerwünschter Ereignisse verursachen, die als immunbedingte unerwünschte Ereignisse (irAEs) bezeichnet werden5. Obwohl irAEs fast alle Gewebe beeinflussen können, Werden sie am häufigsten im Magen-Darm-Trakt beobachtet. Im Allgemeinen treten die meisten IrAEs innerhalb von 1 bis 2 Monaten nach der Initiierung von ICI auf. In einigen Fällen können sie jedoch später als 1 Jahr nach Beginn der Behandlung oder sogar nach Beendigung der Behandlung auftreten6,7. Sie verursachen auch verschiedene Symptome, die schwierig sein können, von anderen Pathologien zu unterscheiden. Daher kann es schwierig sein, irAEs umgehend zu diagnostizieren und angemessen zu behandeln. irAEs können alle Gewebe beeinflussen, und ihr Beginn wird stark durch zirkulierende Immunzellen beeinflusst, insbesondere T-Zellen, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist eine einfache und minimalinvasive Methode zur Überwachung von Antikörper-gezielten T-Zellen im klinischen Umfeld wichtig.
Hier haben wir eine einfache Methode entwickelt, um die Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen mit einem Tropfen peripheren Vollbluts von Krebspatienten zu bewerten, die Nivolumab oder Pembrolizumab erhielten. Mit diesem Ansatz konnten wir jedes der folgenden Elemente überwachen: 1) die Dauer der Antikörperbindung an T-Zellen, 2) die Belegung von T-Zell-PD-1-Molekülen durch therapeutische Antikörper und 3) den Aktivierungsstatus und die immunologischen Merkmale von T-Zellen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine Modifikation einer zuvor gemeldeten Technik8. Die benötigte Blutmenge ist fast die gleiche wie für einen Glukosetest, und der Ansatz erfordert keine mononukleäre Zellanreicherung oder Ko-Kultivierung mit PD-1-blockierenden Antikörpern. Wir haben bestätigt, dass diese Methode auch mit gefrorenen Proben durchgeführt werden kann, einschließlich peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) und Zellen aus Pleuraerguss, Perikardkernerguss, Bronchoalveolader Spülflüssigkeit und Zerebrospinalflüssigkeit, was darauf hindeutet, dass diese Strategie im Rahmen einer multizentrischen Studie nützlich sein könnte. Diese Methode kann die frühdiagnose von irAEs erleichtern und auch dazu beitragen, die geeigneten immunsuppressiven Behandlungen zu bestimmen, um ihre Symptome zu kontrollieren und die optimalen Zeiten zu identifizieren, um nachfolgende Therapien nach PD-1-Hemmern zu initiieren.
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Protocol
Die Probenahme wurde während routinemäßiger klinischer Verfahren durchgeführt. Alle menschlichen Proben wurden nach sachkundigen Zustimmung der Probanden gemäß der Erklärung von Helsinki und mit Zustimmung des Ethik-Review-Gremiums der Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 und 752) eingeholt.
1. Vollblutprobenvorbereitung und Färbung
- Sammeln Sie Blutproben in Blutentnahmeröhrchen, die Ethylendiamintetra-Essigsäure (EDTA) enthalten.
HINWEIS: Die Blutentnahme kann entweder mit einer normalen Nadel oder einer Blutlanze durchgeführt werden. - Übertragen Sie 20 l Vollblutproben auf 5 ml rund-bodenige Polystyrol-Flow-Zytometrie-Röhren.
HINWEIS: Um die unspezifische Bindung von Zellen an Röhrchen zu reduzieren, werden 1 ml 2% fetales Rinderserum (FBS) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) in Dier hinzugefügt und 10 s vor der Anwendung in Proben gewirbelt. - Fügen Sie 20 l von 2% FBS in PBS hinzu.
- Fügen Sie 10 L des humanspezifischen FcR-Blockierreagenzhinzuers hinzu. Gut mischen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 500 L roter Blutkörperchen-Lysepuffer hinzu. Gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 4 ml 2% FBS in PBS hinzu und drehen Sie Zellen bei 400 x g (1.500 U/min) für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie Überstand durch Aspiration.
- Wiederholen Sie den in Schritt 1.6 beschriebenen Wasch- und Aspirationsprozess.
- Die Zellen in 100 l von 2% FBS in PBS wieder aufhängen und in zwei Röhren mit je 50 l teilen.
- Hinzufügen von Oberflächenmarker-Antikörpern (Tabelle 1). Gut mischen und 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten.
HINWEIS: Bei der Profilierung des T-Zellen-Immunstatus kann die Anzahl der Marker basierend auf der Qualität der Durchflusszytometriemaschine erhöht werden. - Proben 2x waschen, wie in Schritt 1.6 beschrieben.
- Resuspend Zellen in 200 l von 2% FBS in PBS.
2. Zytometrische Durchflussanalyse
- Rohre in das Durchflusszytometer einstecken und Zellen erfassen, im Grunde nach dem empfohlenen Protokoll9.
- Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse als Lymphozytentor auf (Abbildung 1A) und exportieren Sie Flussdaten als .fcs-Dateien für die Analyse.
- Öffnen Sie Dateien in der Analysesoftware. Visualisieren Sie die Zellen auf einer Vorwärtsstreuung (FSC) (A) vs. Seitenstreuung (SSC) (A) Plot und Gate Lymphozyten (Abbildung 1A).
- Nach auswahl einzelner Zellen mit FSC (H) vs. FSC (W) und SSC (H) vs. SSC (W) (Abbildung 1B) und Anzeige auf einem CD3 vs. CD8 oder CD3 vs. CD4 Plot, Gate die CD8 T Zellen und CD4 T Zellen, bzw. (Abbildung 1C).
- Nachdem Sie die gated cells ausgewählt und auf einem PD-1 vs. humanem IgG4-Plot angezeigt haben, identifizieren Sie PD-1-blockierende Antikörper-gebundene CD8- und CD4-T-Zellen basierend auf der Isotypkontrolle (Abbildung 1D).
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Representative Results
Die Gating-Strategie- und Durchflusszytometrie-Analyse (Abbildung 1) kann PD-1-blockierende Antikörperbindung an T-Zellen erkennen, die aus einem Tropfen peripheren Blut von NSCLC-Patienten gewonnen werden. Bevor PD-1-blockierender Antikörper verabreicht wird, sind keine humanen IgG4-positiven CD8- oder CD4-T-Zellen vorhanden, und die PD-1-Expression kann durch einen PD-1-detektierenden Antikörper (EH12.1) bestätigt werden (Abbildung 2A). Nach Verabreichung von Nivolumab oder Pembrolizumab kann IgG4 (Nivolumab, Pembrolizumab) auf T-Zellen mit Anti-IgG4-Antikörpern (HP6025) nachgewiesen werden, während der PD-1-detektierende Antikörper EH12.1 keine PD-1 an T-Zellen erkennt, da therapeutische PD-1-Antikörper DIE EH12.1-Bindung stören. Das bedeutet, dass wir indirekt die therapeutische Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern auf der Grundlage der fehlenden Bindung von PD-1-detektierenden Antikörpern messen. Repräsentative Daten zeigen die unterschiedlichen Bindungszustände von PD-1-blockierendem Antikörper (Abbildung 2A). Nivolumab- und Pembrolizumab-Bindung und Belegung von PD-1 auf T-Zellen nehmen im Laufe der Zeitab 10, und es besteht eine partielle Bindung (PB), die im doppelpositiven Bereich dargestellt wird, und schließlich vollständiger Verlust der Bindung (LB) (Abbildung 2B).
Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie zur Bewertung der PD-1-blockierenden Antikörperbindung an T-Zellen aus einem Tropfen peripheren Blut. (A) FSC (A) vs. SSC (A) Plot und Gating von Lymphozyten. (B) Doublets werden ausgeschlossen, indem Tore um die Hauptzellpopulation auf den Parzellen FSC (H) vs. FSC (W) und SSC (H) vs. SSC (W) gezogen werden. (C) CD3 vs. CD8 Plot (upper) und CD3 vs. CD4 Plot (unten) und Gating von CD8 T-Zellen bzw. CD4 T-Zellen. (D) PD-1 vs. humanes IgG4-Plot und Nachweis der Bindung von Nivolumab (einem PD-1-blockierenden Antikörper) an CD8- und CD4 T-Zellen. Orange Punkte und schwarze Punkte weisen auf Anti-IgG4-Antikörper bzw. Isotyp-Kontrollfärbung hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Strömungszytometrieanalyse, die die Änderung des Bindungsstatus von PD-1-blockierenden Antikörpern angibt. (A) Die Färbung von PD-1 und humanem IgG4 in CD8-T-Zellen aus ICI-vorbehandeltem Patientenblut wurde mittels Durchflusszytometrie (links) bewertet. Zehn Mikroliter vorbehandeltes Blut wurden 15 min lang mit serieller Verdünnung von Nivolumab behandelt, und die Schritte 1.4 bis 1.10 des Protokolls wurden abgeschlossen. Die vollständige Bindung (CB) (rot), die Teilbindung (PB) (blau) und der Verlust der Bindung (LB) (grün) werden durch die angegebenen Tore definiert. (B) Der Status der PD-1-blockierenden Antikörperbindung an CD8-T-Zellen wurde zu den Nachbeobachtungszeitpunkten, wie angegeben, bei NSCLC-Patienten analysiert, die Nivolumab und Pembrolizumab absetzten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Pe | BV421 | PE-Cy7 | APC-Cy7 | BV510 | |
| Verbindliche Bewertung | IgG4 | CD3 | PD-1 | CD4 | CD8 |
| Isotype-Steuerung | Isotype-Steuerung | CD3 | Isotype-Steuerung | CD4 | CD8 |
Tabelle 1: Antikörper, die in der zytometrischen Durchflussanalyse verwendet werden.
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Discussion
In diesem Artikel berichten wir über eine Methode, die ein Durchflusszytometer verwendet, um PD-1-blockierende Antikörper zu erkennen, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Bluts fetten Blutes abgeleitet wurden, das wir ursprünglich für den Nivolumab-Nachweis10entwickelt haben. Obwohl diese Technik sehr einfach und einfach durchzuführen ist, sollten zwei wichtige Punkte beachtet werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Zum Nachweis von PD-1-Molekülen sollte ein geeigneter Antikörper verwendet werden, der mit Nivolumab und Pembrolizumab konkurriert. Dieses Problem wurde in einer früheren Studie11bewertet. Die andere ist, dass RBC-Lyse gründlich vor der Oberflächenfärbung durchgeführt werden sollte. Solange für jeden Assay eine Isotypkontrolle zur Bestimmung des Gatter-Positivclusters eingerichtet wird, ist die Frequenz nicht betroffen. Mit diesem Protokoll kann es jedoch zu einer Verringerung der T-Zellzahl im Lymphozytentor und der Intensität jedes Oberflächenmarkers kommen, wenn die RBC-Lyse unzureichend ist. Darüber hinaus muss der RBC-Lyseschritt vor der Oberflächenfärbung durchgeführt werden, da sonst der Anti-IgG4-Antikörper (HP6025) nicht richtig funktioniert.
Die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Population von T-Zellen, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind, spezifische T-Zellklone enthält, die für therapeutische Wirkungen und IrAEs verantwortlich sind; die Häufigkeiten dieser spezifischen Klone unter der antikörpergebundenen Population sind jedoch recht gering. Daher müssen wir das spezifische Ziel noch mit bestimmten Markern, z. B. CD3912, anreichern. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Fluoreszenzintensität von IgG4 in einigen Fällen nicht hoch ist, was die Bestimmung des Bindungsstatus (d. h. PB und LB) erschwert.
Andere Studien haben therapeutische PD-1-Antikörper im Blut überwacht, um die Pharmakokinetik zu bewerten. Die Messung der Plasmakonzentration von Nivolumab oder Pembrolizumab ist wichtig, um zu bestimmen, wie die Restmenge dieser Antikörper im Blut mit der Zeit korreliert. Wir haben jedoch bereits berichtet, dass die Konzentration von Nivolumab nicht vollständig mit der Restbindung an T-Zellen10korreliert. Im Vergleich zur Messung der Plasmaantikörperkonzentration13ist unsere Methode möglicherweise besser geeignet, um die Restbindung von Anti-PD-1-Antikörpern an T-Zellen zu bewerten. Die ursprüngliche Methode zur Überwachung der Nivolumabbindung an T-Zellen im Blut erforderte eine Inkubation mit Fluoreszenz-markiertem Nivolumab8. Wir vereinfachten diesen Ansatz und konnten die Testzeit und die für die Analyse benötigte Blutmenge erheblich reduzieren.
Gefrorene Zellen können auch mit diesem Test analysiert werden, was darauf hindeutet, dass diese Methode eine gute Passform für multizentrische Studien ist. Die Nützlichkeit dieses Ansatzes wird durch die Kombination des Überwachungsbindungsstatus mit anderen immunologischen Markern, wie Ki-67, von T-Zellen, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind,10weiter verbessert. Zukünftige Studien sollten unsere Methode in Verbindung mit einzelliger RNA-Sequenzierung und T-Zell-Rezeptorsequenzierung verwenden, um zu versuchen, die spezifischen Teilmengen von T-Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind und für irAEs verantwortlich sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an S.K. von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) und der Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 und 19cm0106310) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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