Überwachung von PD-1-Blocking-Antikörpern, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Blutsfetts abgeleitet wurden
Summary
Wir entwickelten einen einfachen Flow-Zytometrie-Assay zur Bewertung der Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen, der nur einen Tropfen peripheren Bluts von Krebspatienten erfordert.
Abstract
Immun-Checkpoint-Inhibitoren, einschließlich PD-1-blockierender Antikörper, haben die Behandlungsergebnisse bei verschiedenen Krebsarten deutlich verbessert. Die pharmakologische Wirksamkeit dieser Immuntherapien ist langanhaltend und erstreckt sich aufgrund anhaltender Blutkonzentrationen sogar über das Absetzen ihrer Injektionen hinaus. Hier haben wir einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay entwickelt, um den T-Zellbindungsstatus der PD-1-blockierenden Antikörper Nivolumab und Pembrolizumab zu bewerten. Wie ein Glukosetest erfordert dieser Test nur einen einzigen Tropfen peripheren Blutes. Die Visualisierung der Antikörperbindung an T-Zellen ist zuverlässiger als die Messung von Antikörper-Blutkonzentrationen. Darüber hinaus können wir bei Bedarf möglicherweise viele ausgeprägte immunbezogene Marker auf T-Zellen analysieren, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist dies eine einfache und minimalinvasive Strategie, um die pharmakologische Wirkung von PD-1-blockierenden Antikörpern bei Krebspatienten zu analysieren.
Introduction
PD-1-blockierende Antikörper sind zur Standardwahl für die Behandlung verschiedener Krebsarten geworden, einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)1,2,3,4. Sie zeigen eine bemerkenswerte therapeutische Wirkung bei einer Untergruppe von Krebspatienten, die nicht auf herkömmliche zytotoxische Chemotherapien angetreten haben. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs), die PD-1-blockierende Antikörper enthalten, können jedoch ein einzigartiges und ausgeprägtes Spektrum unerwünschter Ereignisse verursachen, die als immunbedingte unerwünschte Ereignisse (irAEs) bezeichnet werden5. Obwohl irAEs fast alle Gewebe beeinflussen können, Werden sie am häufigsten im Magen-Darm-Trakt beobachtet. Im Allgemeinen treten die meisten IrAEs innerhalb von 1 bis 2 Monaten nach der Initiierung von ICI auf. In einigen Fällen können sie jedoch später als 1 Jahr nach Beginn der Behandlung oder sogar nach Beendigung der Behandlung auftreten6,7. Sie verursachen auch verschiedene Symptome, die schwierig sein können, von anderen Pathologien zu unterscheiden. Daher kann es schwierig sein, irAEs umgehend zu diagnostizieren und angemessen zu behandeln. irAEs können alle Gewebe beeinflussen, und ihr Beginn wird stark durch zirkulierende Immunzellen beeinflusst, insbesondere T-Zellen, die an PD-1-blockierende Antikörper gebunden sind. Daher ist eine einfache und minimalinvasive Methode zur Überwachung von Antikörper-gezielten T-Zellen im klinischen Umfeld wichtig.
Hier haben wir eine einfache Methode entwickelt, um die Bindung von PD-1-blockierenden Antikörpern an T-Zellen mit einem Tropfen peripheren Vollbluts von Krebspatienten zu bewerten, die Nivolumab oder Pembrolizumab erhielten. Mit diesem Ansatz konnten wir jedes der folgenden Elemente überwachen: 1) die Dauer der Antikörperbindung an T-Zellen, 2) die Belegung von T-Zell-PD-1-Molekülen durch therapeutische Antikörper und 3) den Aktivierungsstatus und die immunologischen Merkmale von T-Zellen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine Modifikation einer zuvor gemeldeten Technik8. Die benötigte Blutmenge ist fast die gleiche wie für einen Glukosetest, und der Ansatz erfordert keine mononukleäre Zellanreicherung oder Ko-Kultivierung mit PD-1-blockierenden Antikörpern. Wir haben bestätigt, dass diese Methode auch mit gefrorenen Proben durchgeführt werden kann, einschließlich peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) und Zellen aus Pleuraerguss, Perikardkernerguss, Bronchoalveolader Spülflüssigkeit und Zerebrospinalflüssigkeit, was darauf hindeutet, dass diese Strategie im Rahmen einer multizentrischen Studie nützlich sein könnte. Diese Methode kann die frühdiagnose von irAEs erleichtern und auch dazu beitragen, die geeigneten immunsuppressiven Behandlungen zu bestimmen, um ihre Symptome zu kontrollieren und die optimalen Zeiten zu identifizieren, um nachfolgende Therapien nach PD-1-Hemmern zu initiieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel berichten wir über eine Methode, die ein Durchflusszytometer verwendet, um PD-1-blockierende Antikörper zu erkennen, die an T-Zellen gebunden sind, die aus einem Tropfen peripheren Bluts fetten Blutes abgeleitet wurden, das wir ursprünglich für den Nivolumab-Nachweis10entwickelt haben. Obwohl diese Technik sehr einfach und einfach durchzuführen ist, sollten zwei wichtige Punkte beachtet werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Zum Nachweis von PD-1-Molekülen sollte ein gee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an S.K. von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) und der Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 und 19cm0106310) unterstützt.
Materials
| 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 300518 | Clone RPA-T4 |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD | ||
| Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301048 | Clone RPA-T8 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control | abcam | ab81200 | |
| Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc | abcam | ab99825 | Clone HP6025 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 | BD | 558117 | Clone UCHT1 |
| PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD | 561272 | Clone EH12.1 |
| PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557646 |
References
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