Overvåking av PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod

Summary

Vi utviklet en enkel flow cytometri analyse for å evaluere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler, krever bare en dråpe perifert blod fra kreftpasienter.

Abstract

Immunsjekkpunkthemmere, inkludert PD-1-blokkerende antistoffer, har betydelig forbedret behandlingsutfall i ulike typer kreft. Den farmakologiske effekten av disse immunterapiene er langvarig, og strekker seg selv utover seponeringen av injeksjonene, på grunn av vedvarende blodkonsentrasjoner. Her utviklet vi en enkel flyt cytometri analyse for å evaluere T celle binding status for PD-1-blokkerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Som en glukosetest krever denne analysen bare en enkelt dråpe perifert blod. Visualisere antistoffbinding på T-celler er mer pålitelig enn å måle antistoffblodkonsentrasjoner. I tillegg kan vi potensielt analysere mange karakteristiske immunrelaterte markører på T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Dermed er dette en enkel og minimal invasiv strategi for å analysere den farmakologiske effekten av PD-1-blokkerende antistoffer hos kreftpasienter.

Introduction

PD-1-blokkerende antistoffer har blitt standardvalget for behandling av ulike typer kreft, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC)^1,2,3,4. De viser en bemerkelsesverdig terapeutisk effekt hos en undergruppe av kreftpasienter som ikke har respondert på konvensjonelle cytotoksiske kjemoterapier. Imidlertid kan immunkontrollpunkthemmere (ICIer), som inkluderer PD-1-blokkerende antistoffer, forårsake et unikt og tydelig spekter av bivirkninger, kalt immunrelaterte bivirkninger (irAV-er)⁵. Selv om irAE kan påvirke nesten alle vev, de er oftest observert i mage-tarmkanalen, endokrine kjertler, hud, og lever, og de kan forårsake kløe,, kvalme, diaré, og skjoldbrusk lidelser^6,7. Generelt vises de fleste irAE er innen 1 til 2 måneder etter initiering av ICIer. Men i noen tilfeller kan de oppstå senere enn 1 år etter begynnelsen av behandlingen eller til og med etter behandlingsopphør^6,7. De forårsaker også ulike symptomer som kan være vanskelige å diskriminere fra andre patologier. Dermed kan det være utfordrende å umiddelbart diagnostisere irAE og behandle dem riktig. irAE kan påvirke alle vev, og deres utbrudd er sterkt påvirket av sirkulerende immunceller, spesielt T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimal invasiv metode for å overvåke antistoffmålrettede T-celler viktig i kliniske innstillinger.

Her utviklet vi en enkel metode for å vurdere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler ved hjelp av en dråpe perifert fullblod fra kreftpasienter som fikk nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjelp av denne tilnærmingen var vi i stand til å overvåke hvert av følgende: 1) varigheten av antistoffbinding til T-celler, 2) belegget til T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringsstatus og immunologiske egenskaper i T-celler. Denne metoden er en endring av en tidligere rapportert teknikk⁸. Mengden blod som kreves er nesten den samme som det som trengs for en glukosetest, og tilnærmingen krever ikke enukleær celleberikelse eller co-culturing med PD-1-blokkerende antistoffer. Vi bekreftet at denne metoden også kan utføres ved hjelp av frosne prøver, inkludert perifert blod mononukleære celler (PBMCs) og celler fra pleural effusjon, perikardial effusjon, bronkoalveoor lavage væske, og cerebrospinalvæske, noe som tyder på at denne strategien kan være nyttig i sammenheng med en multisenterstudie. Denne metoden kan lette tidlig diagnose av irAE, og også bidra til å bestemme de riktige immunsuppressive behandlingene for å kontrollere symptomene og identifisere de optimale tidene for å initiere påfølgende behandlinger etter PD-1-hemmere.

Protocol

Prøvetaking ble utført under rutinemessige kliniske prosedyrer. Alle menneskelige prøver ble innhentet etter informert samtykke ble gitt av fagene, i samsvar med Helsingfors erklæringen og med godkjenning av etisk gjennomgang styret av Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752). 1. Hele blodprøveforberedelser og farging Samle fullblodprøver i blodinnsamlingsrør som inneholder etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA).MERK: Blodoppsamling kan utføres ved…

Representative Results

Gating strategi og flyt cytometri analyse (Figur 1) kan oppdage PD-1-blokkereantistoff binding til T-celler hentet fra en dråpe NSCLC pasient perifert blod. Før PD-1-blokkerende antistoff administreres, finnes ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler, og PD-1-uttrykk kan bekreftes av et PD-1-detekterende antistoff (EH12.1) (figur 2A). Etter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) påvises p…

Discussion

I denne artikkelen rapporterer vi en metode ved hjelp av et strømningscytometer for å oppdage PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod, som vi opprinnelig utviklet for nivolumab deteksjon¹⁰. Selv om denne teknikken er veldig enkel og enkel å utføre, bør to viktige punkter noteres for å oppnå nøyaktige resultater. Det ene er at for å oppdage PD-1 molekyler, bør et passende antistoff som konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab brukes. Dette pr…

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646