Summary

Overvåking av PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Vi utviklet en enkel flow cytometri analyse for å evaluere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler, krever bare en dråpe perifert blod fra kreftpasienter.

Abstract

Immunsjekkpunkthemmere, inkludert PD-1-blokkerende antistoffer, har betydelig forbedret behandlingsutfall i ulike typer kreft. Den farmakologiske effekten av disse immunterapiene er langvarig, og strekker seg selv utover seponeringen av injeksjonene, på grunn av vedvarende blodkonsentrasjoner. Her utviklet vi en enkel flyt cytometri analyse for å evaluere T celle binding status for PD-1-blokkerende antistoffer nivolumab og pembrolizumab. Som en glukosetest krever denne analysen bare en enkelt dråpe perifert blod. Visualisere antistoffbinding på T-celler er mer pålitelig enn å måle antistoffblodkonsentrasjoner. I tillegg kan vi potensielt analysere mange karakteristiske immunrelaterte markører på T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Dermed er dette en enkel og minimal invasiv strategi for å analysere den farmakologiske effekten av PD-1-blokkerende antistoffer hos kreftpasienter.

Introduction

PD-1-blokkerende antistoffer har blitt standardvalget for behandling av ulike typer kreft, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC)1,2,3,4. De viser en bemerkelsesverdig terapeutisk effekt hos en undergruppe av kreftpasienter som ikke har respondert på konvensjonelle cytotoksiske kjemoterapier. Imidlertid kan immunkontrollpunkthemmere (ICIer), som inkluderer PD-1-blokkerende antistoffer, forårsake et unikt og tydelig spekter av bivirkninger, kalt immunrelaterte bivirkninger (irAV-er)5. Selv om irAE kan påvirke nesten alle vev, de er oftest observert i mage-tarmkanalen, endokrine kjertler, hud, og lever, og de kan forårsake kløe,, kvalme, diaré, og skjoldbrusk lidelser6,7. Generelt vises de fleste irAE er innen 1 til 2 måneder etter initiering av ICIer. Men i noen tilfeller kan de oppstå senere enn 1 år etter begynnelsen av behandlingen eller til og med etter behandlingsopphør6,7. De forårsaker også ulike symptomer som kan være vanskelige å diskriminere fra andre patologier. Dermed kan det være utfordrende å umiddelbart diagnostisere irAE og behandle dem riktig. irAE kan påvirke alle vev, og deres utbrudd er sterkt påvirket av sirkulerende immunceller, spesielt T-celler bundet til PD-1-blokkerende antistoffer. Derfor er en enkel og minimal invasiv metode for å overvåke antistoffmålrettede T-celler viktig i kliniske innstillinger.

Her utviklet vi en enkel metode for å vurdere bindingen av PD-1-blokkerende antistoffer mot T-celler ved hjelp av en dråpe perifert fullblod fra kreftpasienter som fikk nivolumab eller pembrolizumab. Ved hjelp av denne tilnærmingen var vi i stand til å overvåke hvert av følgende: 1) varigheten av antistoffbinding til T-celler, 2) belegget til T-celle PD-1 molekyler ved terapeutiske antistoffer, og 3) aktiveringsstatus og immunologiske egenskaper i T-celler. Denne metoden er en endring av en tidligere rapportert teknikk8. Mengden blod som kreves er nesten den samme som det som trengs for en glukosetest, og tilnærmingen krever ikke enukleær celleberikelse eller co-culturing med PD-1-blokkerende antistoffer. Vi bekreftet at denne metoden også kan utføres ved hjelp av frosne prøver, inkludert perifert blod mononukleære celler (PBMCs) og celler fra pleural effusjon, perikardial effusjon, bronkoalveoor lavage væske, og cerebrospinalvæske, noe som tyder på at denne strategien kan være nyttig i sammenheng med en multisenterstudie. Denne metoden kan lette tidlig diagnose av irAE, og også bidra til å bestemme de riktige immunsuppressive behandlingene for å kontrollere symptomene og identifisere de optimale tidene for å initiere påfølgende behandlinger etter PD-1-hemmere.

Protocol

Prøvetaking ble utført under rutinemessige kliniske prosedyrer. Alle menneskelige prøver ble innhentet etter informert samtykke ble gitt av fagene, i samsvar med Helsingfors erklæringen og med godkjenning av etisk gjennomgang styret av Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 og 752). 1. Hele blodprøveforberedelser og farging Samle fullblodprøver i blodinnsamlingsrør som inneholder etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA).MERK: Blodoppsamling kan utføres ved…

Representative Results

Gating strategi og flyt cytometri analyse (Figur 1) kan oppdage PD-1-blokkereantistoff binding til T-celler hentet fra en dråpe NSCLC pasient perifert blod. Før PD-1-blokkerende antistoff administreres, finnes ingen humane IgG4-positive CD8- eller CD4 T-celler, og PD-1-uttrykk kan bekreftes av et PD-1-detekterende antistoff (EH12.1) (figur 2A). Etter administrering av nivolumab eller pembrolizumab kan IgG4 (nivolumab, pembrolizumab) påvises p…

Discussion

I denne artikkelen rapporterer vi en metode ved hjelp av et strømningscytometer for å oppdage PD-1-blokkerende antistoffer bundet til T-celler avledet fra en dråpe perifert blod, som vi opprinnelig utviklet for nivolumab deteksjon10. Selv om denne teknikken er veldig enkel og enkel å utføre, bør to viktige punkter noteres for å oppnå nøyaktige resultater. Det ene er at for å oppdage PD-1 molekyler, bør et passende antistoff som konkurrerer med nivolumab og pembrolizumab brukes. Dette pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til S.K. fra Japan Society for The Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) og Japan Agency for Medical Research and Development (JP18cm0106335 og 19cm0106310).

Materials

10X RBC Lysis Buffer (Multi-species) Thermo Fisher Scientific 00-4300-54 50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody BioLegend 300518 Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody BioLegend 301048 Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline nacalai tesque 14249-95 500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes STEMCELL Technologies 352058 5 mL
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901 2 mL
FLOWJO BD
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12676029 500 mL
Mouse IgG1 monoclonal – Isotype control abcam ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc abcam ab99825 Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3 BD 558117 Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) BD 561272 Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557646

References

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

Play Video

Cite This Article
Naito, Y., Osa, A., Masuhiro, K., Hirai, T., Koyama, S., Kumanogoh, A. Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (156), e60608, doi:10.3791/60608 (2020).

View Video