Hier stellen wir ein Screening-Verfahren für membrangebundene Pyrophosphatase (aus Thermotoga maritima) Inhibitoren auf Basis der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattenformat vor.
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Methodenartikel
Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases) sind dimere Enzyme, die in Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistischen Parasiten vorkommen. Diese Proteine spalten Pyrophosphat in zwei Orthophosphatmoleküle, die mit Proton und/oder Natriumionen gekoppelt sind, die über die Membran pumpen. Da bei Tieren und Menschen keine homologen Proteine vorkommen, sind mPPases gute Kandidaten bei der Gestaltung potenzieller Wirkstoffziele. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zum Abschirmen für mPPase-Inhibitoren unter Verwendung der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattensystem vor. Wir verwenden mPPase aus dem thermophilen Bakterium Thermotoga maritima (TmPPase) als Modellenzym. Dieses Protokoll ist einfach und kostengünstig und führt zu einem konsistenten und robusten Ergebnis. Es dauert nur etwa eine Stunde, um das Aktivitätstestprotokoll vom Beginn des Assays bis zur Absorptionsmessung abzuschließen. Da die in diesem Test erzeugte blaue Farbe über einen längeren Zeitraum stabil ist, können nachfolgende Assays unmittelbar nach der vorherigen Charge durchgeführt werden, und die Absorption kann später für alle Chargen auf einmal gemessen werden. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass es manuell durchgeführt wird und somit anstrengend sein kann und gute Fähigkeiten der Pipetten und Zeiterfassung erfordern. Darüber hinaus enthält die in diesem Test verwendete Arsenit-Citrat-Lösung Natriumarsenit, das giftig ist und mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden sollte.
Einleitung
Ungefähr 25% der gesamten zellulären Proteine sind Membranproteine und etwa 60% von ihnen sind Arzneimittelziele1,2. Eines der potentiellen Wirkstoffziele3, membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases), sind dimerische Enzyme, die Proton und/oder Natriumion durch Hydrolyse von Pyrophosphat in zwei Orthophosphatepumpen 4. mPPases können in verschiedenen Organismen gefunden werden5 wie Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistische Parasiten, mit Ausnahme von Menschen und Tieren4. Bei protistischen Parasiten, z.B. ....
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Protokoll
1. Proteinzubereitung
HINWEIS: Der Ausdruck und die Reinigung von TmPPase wurde an anderer Stelle beschrieben13.
- Bereiten Sie 10 ml der Reaktivierungspufferlösung vor,die 20 mM 2-(N-Morpholino)Ethansulfonsäure (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) Glycerin, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,05% Dodecylmaltosid (DDM) enthält.
- Bereiten Sie 10 ml des Reaktionsgemisches mit 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl und 67 mM M NaCl vor.
HINWEIS: Mg2+ ist erforderlich, um das Pyrophosphat als Substrat von mPPase zu chelatieren, K+ ist erforderlich, um die Enzymaktivi....
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Ergebnisse
In diesem Protokoll wurden acht Verbindungen (1-8) zusammen mit IDP, einem häufigen Inhibitor von Pyrophosphatasen, als positiv zu kontrollieren getestet (Abbildung 2A). Jede Verbindung wurde in drei verschiedenen Konzentrationen (1 M, 5 m und 20 m) in DreifacherDikate getestet. Der Ablauf des Screenings ist in Abbildung 1dargestellt, beginnend mit der Proben- und Reagenzvorbereitung bis zur Absorptionsmessung bei 860 nm.
Am Ende dies.......
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Diskussion
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zum einfachen Screening von Inhibitoren auf membrangebundene Pyrophosphatase aus T. maritima in einem 96-Well-Plattenformat auf Basis von Vidilaseris et al.14. Dieses Protokoll ist kostengünstig und basiert auf 12-Phosphomolybdadsäure, die aus Orthophosphat und Molybdat unter sauren Bedingungen gebildet und auf Phosphomolybdän-Arten mit einer deutlichen blauen Farbe12reduziert wird. Diese Methode wird gegenüber an.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der Jane and Aatos Erkko Foundation und der BBSRC (BB/M021610) an Adrian Goldman, die Akademie Finnlands (Nr. 308105) an Keni Vidilaseris,(Nr. 310297) an Henri Xhaard und (Nr. 265481) an Jari Yli-Kauhaluoma und die Forschungsfonds der Universität Helsinki an Gustav Boije af Gennäs. Die Autoren danken Bernadette Gehl für ihre technische Hilfe während des Projekts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Selbstklebende Dichtungsfolie | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbinsäure | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck 1167431000 | ||
| 8-Well-PCR-Röhrchenstreifen 0,2 ml ohne Verschlüsse (120) | Nippon-Genetik | FG-028 | |
| Dodecylmaltosid (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Eisessigsäure | Merck | 1000631011 | |
| Salzsäure | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphat Natrium Salz | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidylcholin aus Sojalecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Platten | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Petrischale aus Polystyrol (Größe 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Kaliumchlorid | Merck | 104936 | |
| Prism 6 Software | GraphPad | ||
| QBT2 Heizblock | Grant Instruments | ||
| Natriummetaarsenit | Fisher Chemical | ||
| Natriumphosphat zweibasisch (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Natriumpyrophosphat zweibasisch | Fluka | 71501-100G | |
| Trinatriumcitrat-Dihydrat | Fluka | 71404-1KG |
Referenzen
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
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Nachdrucke und Genehmigungen
