Summary

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.

Abstract

Membrana bağlı pirofosfatazlar (mPPases) bakterilerde, arkelerde, bitkilerde ve protist parazitlerde oluşan dimerik enzimlerdir. Bu proteinler pirofosfatı iki ortofosfat molekülüne ayırırlar, bu moleküller proton ve/veya sodyum iyonile birleştiğinde membran boyunca pompalanırlar. Hayvanlarda ve insanlarda homolog protein oluşmadığından, mPPP’ler potansiyel ilaç hedeflerinin tasarımında iyi adaylardır. Burada 96 kuyu plaka sisteminde mobibdenmavi reaksiyon kullanan mPPase inhibitörleri için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Termofilik bakteri Thermotoga maritima (TmPPase) mPPase’yi model enzim olarak kullanıyoruz. Bu protokol basit ve ucuzdur ve tutarlı ve sağlam bir sonuç verir. Testin başlangıcından emici ölçüme kadar etkinlik test protokolünü tamamlamak sadece bir saat sürer. Bu çıktıda üretilen mavi renk uzun bir süre için kararlı olduğundan, sonraki tsay(lar) önceki toplu işlemden hemen sonra gerçekleştirilebilir ve emicilik daha sonra tüm gruplar için aynı anda ölçülebilir. Bu protokolün dezavantajı, elle yapılır ve böylece yorucu yanı sıra pipetting ve zaman tutma iyi beceriler gerektirir olabilir. Ayrıca, bu istihda kullanılan arsenit-sitrat çözeltisi sodyum arsenit içerir, toksik ve gerekli önlemler ile ele alınmalıdır.

Introduction

Toplam hücresel proteinlerin yaklaşık %25’i membran proteinleridir ve bunların yaklaşık %60’ı ilaç hedefleri1,2′dir. Potansiyel ilaç hedeflerinden biri3, membrana bağlı pirofosfatlar (mPPases), iki ortofosfat içine pirofosfat hidrolizi ile membran boyunca proton ve / veya sodyum iyon pompa dimerik enzimlervardır 4. mPPases çeşitli organizmalarda bulunabilir5 bakteri gibi, arke, bitkiler, ve protist parazitler, insanlar ve hayvanlar hariç4. Protist parazitlerde, örneğin Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii ve Trypanosoma brucei, mPPases parazit virülans için gerekli 6 ve parazitlerde bu ifadenin nakavt dış temel pH maruz kalma sırasında hücre içi pH bakımında başarısızlığa yol açar7. Omurgalılarda homolog protein ve önemi nedeniyle, mPPases protistal hastalıklar için potansiyel ilaç hedefleri olarak kabul edilebilir3.

Bu çalışmada mPPase inhibitörlerinin in vitro taraması TmPPase model sistemine dayanmaktadır. TmPPase, T. maritima’dan gelen sodyum iyon pompalama ve potasyum iyne bağımlı mPPase olup 71 °C8’deoptimum aktiviteye sahiptir. Bu enzimin faydaları örneğin üretim ve arınma kolaylığı, iyi termal stabilite ve yüksek özgül aktivite vardır. TmPPase pozisyon tam koruma yanı sıra protist mPPases3,9 ve Vigna radiata10 mPPase çözülmüş yapısına tüm katalitik artıkların kimliğini yanı sıra yüksek benzerlik gösterir. Farklı konformasyonlarda TmPPase mevcut yapıları da yapı tabanlı uyuşturucu tasarım deneyi için yararlıdır (sanal tarama ve de novo tasarım olarak).

Burada TmPPase inhibitörlerinin 96 kuyu plaka biçiminde taranması için ayrıntılı bir protokol sunarız (Şekil 1). Protokol ilk Fiske ve Subbarow11tarafından geliştirilen mobibdenum mavi reaksiyon, kolorimetrik yöntemine dayanmaktadır. Bu yöntem, ortofosfat ve molybdate asidik koşullar altında 12 fosfathomolybdic asit oluşumunu içerir, daha sonra karakteristik mavi renkli fosfathomolybdenum türleri vermek için azalır12.

Protocol

1. Protein hazırlama NOT: TmPPase’nin ifadesi ve arınması başka bir yerde13olarak tanımlanmıştır. 20 mM 2-(N-morfolino)etanesulfonik asit (MES) pH 6.5, %3.5 (v/v) gliserol, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve %0.05 dodecyl maltoside (DDM) içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mL’sini hazırlayın. 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl ve 67 mM NaCl içeren reaksiyon karışımının 10 mL’sini hazırlayın.NO…

Representative Results

Bu protokolde, pirofosfatazların ortak inhibitörü olan IDP ile birlikte sekiz bileşik (Şekil2A)pozitif kontrol olarak test edildi. Her bileşik üç farklı konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) trilikat olarak test edildi. Taramanın iş akışı Şekil 1’degösterilmiştir , numune ve reaktif hazırlığından başlayarak 860 nm’de emici ölçüme kadar. Bu protokolün sonunda, Çözelti A + B ve arsenit-sitrat eklendikten s…

Discussion

Burada Vidilaseris ve ark14dayalı bir 96 iyi plaka formatında T. maritima membran bağlı pirofosfatse için inhibitörleri basit tarama için ayrıntılı bir protokol rapor . Bu protokol ucuz dur ve asidik koşullarda ortofosfat ve molybdate oluşan ve farklı bir mavi renk 12 ile fosfathomolybdenum türlerine indirgenmiş12fosfathomolybdic asit, dayanmaktadır. Bu yöntem diğer protokoller üzerinde tercih edilir, daha hassas malakit yeşil test<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı ve BBSRC (BB/M021610) adrian Goldman hibe tarafından desteklenmiştir, Finlandiya Akademisi (No. 308105) Keni Vidilaseris, (No. 310297) Henri Xhaard ve (No. 265481) Jari Yli-Kauhaluoma ve Helsinki Üniversitesi Araştırma Fonları Gustav Boije af Gennäs için. Yazarlar bernadette Gehl’e proje sırasında ki teknik yardımları için teşekkür eder.

Materials

Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).

Play Video

Cite This Article
Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

View Video