Summary

Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase Thermotoga maritima Membrane-Bound

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Ici nous présentons une méthode de criblage pour la pyrophosphatase membran-liée (de Thermotoga maritima) inhibiteurs basés sur la réaction bleue de molybdène dans un format 96 de plaque de puits.

Abstract

Les pyrophosphatases membranaires (mPPases) sont des enzymes dimériques qui se produisent dans les bactéries, les archées, les plantes et les parasites protistes. Ces protéines censent le pyrophosphate en deux molécules d’orthophosphate, qui est couplée avec le proton et/ou le pompage d’ion de sodium à travers la membrane. Comme aucune protéine homologue ne se produit chez les animaux et les humains, les mPPases sont de bons candidats dans la conception de cibles médicamenteuses potentielles. Ici nous présentons un protocole détaillé pour examiner les inhibiteurs de mPPase utilisant la réaction bleue de molybdène dans un système de plaque de puits 96. Nous utilisons le mPPase de la bactérie thermophile Thermotoga maritima (TmPPase) comme enzyme modèle. Ce protocole est simple et peu coûteux, produisant un résultat cohérent et robuste. Il ne faut qu’environ une heure pour compléter le protocole d’etoile d’activité depuis le début de l’assiduité jusqu’à la mesure de l’absorption. Étant donné que la couleur bleue produite dans cet analyse est stable pendant une longue période de temps, l’analyse ultérieure peut être effectuée immédiatement après le lot précédent, et l’absorption peut être mesurée plus tard pour tous les lots à la fois. L’inconvénient de ce protocole est qu’il est fait manuellement et peut donc être épuisant ainsi que nécessitent de bonnes compétences de pipetage et de temps. De plus, la solution de citrate d’arsenit utilisée dans cet assay contient de l’arsénite de sodium, qui est toxique et doit être manipulée avec les précautions nécessaires.

Introduction

Environ 25 % des protéines cellulaires totales sont des protéines membranaires et environ 60 % d’entre elles sont des cibles médicamenteuses1,2. L’une des cibles médicamenteuses potentielles3, pyrophosphatases membranaires (mPPases), sont des enzymes dimériques qui pompent le proton et/ou l’ion de sodium à travers la membrane par hydrolyse de pyrophosphate en deux orthophosphates4. mPPases peut être trouvé dans divers organismes5 tels que les bactéries, archées, plantes, et les parasites protistes, à l’exception des humains et des animaux4. Chez les parasites protistes, par exemple Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii et Trypanosoma brucei, mPPases sont essentiels pour la virulence parasite6 et KO de cette expression dans les parasites conduire à l’échec dans le maintien du pH intracellulaire lors de l’exposition au pH de base externe7. En raison de leur importance et du manque de protéines homologues présentes chez les vertébrés, les mPPases peuvent être considérés comme des cibles médicamenteuses potentielles pour les maladies protistales3.

Le dépistage in vitro des inhibiteurs du mPPase dans ce travail est basé sur un système de modèle TmPPase. TmPPase est un pompage d’ion de sodium et de potassium ion dépendant mPPase de T. maritima et a son activité optimale à 71 c8. Les avantages de cette enzyme sont par exemple sa facilité de production et de purification, une bonne stabilité thermique et une activité spécifique élevée. TmPPase montre à la fois une forte similitude en plus de la conservation complète de la position ainsi que l’identité de tous les résidus catalytiques à la mPPases protiste3,9 et à la structure résolue de Vigna radiata10 mPPase. Les structures disponibles de TmPPase dans différentes conformations sont également utiles pour l’expérience de conception de médicaments basée sur la structure (comme le dépistage virtuel et la conception de novo).

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage des inhibiteurs de TmPPase dans un format de plaque de puits 96 (figure 1). Le protocole est basé sur la méthode colorimétrique de la réaction bleu molybdène, qui a d’abord été développé par Fiske et Subbarow11. Cette méthode implique la formation d’acide phosphomolybdique 12-phosphomolybd à partir d’orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides, qui est ensuite réduite pour donner des espèces caractéristiques de phosphomolybdène de couleur bleue12.

Protocol

1. Préparation des protéines REMARQUE: L’expression et la purification de TmPPase a été décrite ailleurs13. Préparer 10 ml de la solution tampon de réactivation contenant 20 mM 2-( N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), et 0.05% dodecyl maltoside (DDM). Préparer 10 ml du mélange de réaction contenant 200 mM Tris-Cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl, et 67 mM NaCl.<br…

Representative Results

Dans ce protocole, huit composés (1 à 8) ont été testés (figure 2A) avec IDP, un inhibiteur commun des pyrophosphatases, comme un contrôle positif. Chaque composé a été testé à trois concentrations différentes (1 M, 5 M et 20 M) en triple. Le flux de travail de la présélection est représenté à la figure 1, à partir de la préparation de l’échantillon et du réactif jusqu’à la mesure de l’absorption à 860 nm. À la…

Discussion

Ici, nous rapportons un protocole détaillé pour le criblage simple des inhibiteurs pour la pyrophosphatase membranaire-liée de T. maritima dans un format 96 de plaque de puits basé sur Vidilaseris et autres14. Ce protocole est peu coûteux et basé sur l’acide 12-phosphomolybd, qui est formé à partir d’orthophosphate et de molybdate dans des conditions acides et réduit à des espèces de phosphomolybdène avec une couleur bleue distincte12. Cette méthode es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation Jane et Aatos Erkko et du BBSRC (BB/M021610) à Adrian Goldman, l’Académie de Finlande (no 308105) à Keni Vidilaseris, (no 310297) à Henri Xhaard, et (no 265481) à Jari Yli-Kauhaluoma, et les fonds de recherche de l’Université d’Helsinki à Gustav Boije af Genns. Les auteurs remercient Bernadette Gehl pour son aide technique pendant le projet.

Materials

Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

References

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Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

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