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Biochemistry

थर्मोटोगा मैरिटिमा झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेज़ (थर्मोटोगा मैरिटिमासे) अवरोधकों के लिए एक स्क्रीनिंग विधि प्रस्तुत करते हैं जो 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में मोलिब्डेनम ब्लू रिएक्शन के आधार पर है।

Abstract

झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेस (एमपीए) डिमेरिक एंजाइम होते हैं जो बैक्टीरिया, आर्चिया, पौधों और प्रोटिस्ट परजीवी में होते हैं। ये प्रोटीन पायरोफॉस्फेट को दो ऑर्थोफोस्फेट अणुओं में छोड़ देते हैं, जो झिल्ली में प्रोटॉन और/या सोडियम आयन पंपिंग के साथ मिलकर होते हैं । चूंकि जानवरों और मनुष्यों में कोई समरूप प्रोटीन नहीं होता है, इसलिए एमपीए संभावित दवा लक्ष्यों के डिजाइन में अच्छे उम्मीदवार हैं। यहां हम 96 अच्छी प्लेट प्रणाली में मोलिब्डेनम ब्लू प्रतिक्रिया का उपयोग करते हुए एमपीपीए अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम थर्मोफिलिक जीवाणु थर्मोटोगा मैरिटिमा (TmPPase) से एक मॉडल एंजाइम के रूप में mPPase का उपयोग करें । यह प्रोटोकॉल सरल और सस्ता है, जो एक सुसंगत और मजबूत परिणाम का उत्पादन करता है। यह केवल एक घंटे के बारे में लेता है गतिविधि परख प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए परख की शुरुआत से अवशोषण माप तक । चूंकि इस परख में उत्पादित नीला रंग लंबे समय तक स्थिर है, इसलिए बाद में परख (एस) पिछले बैच के तुरंत बाद किया जा सकता है, और अवशोषण को बाद में सभी बैचों के लिए एक बार में मापा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की खामी यह है कि यह मैन्युअल रूप से किया जाता है और इस प्रकार थकाऊ हो सकता है और साथ ही पाइपटिंग और समय रखने के अच्छे कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस परख में इस्तेमाल आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान में सोडियम आर्सेनिट होता है, जो विषाक्त होता है और आवश्यक सावधानियों के साथ संभाला जाना चाहिए।

Introduction

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कुल सेलुलर प्रोटीन का लगभग 25% झिल्ली प्रोटीन है और उनमें से लगभग 60% दवा लक्ष्य1,2हैं . संभावित दवालक्ष्य3,झिल्ली से बंधे पायरोफॉस्फेटेस (एमपीएई) के लक्ष्यों में से एक, डिमेरिक एंजाइम हैं जो पायरोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस द्वारा झिल्ली के पार प्रोटॉन पंप और/या सोडियम आयन को दो ऑर्थोफोस्फेट4में डालते हैं। MPPases मनुष्यों औरजानवरोंके अपवाद केसाथ, बैक्टीरिया, आर्चिया, पौधों और प्रोटिस्ट परजीवी जैसे 5 विभिन्न जीवों में पाया जा सकता है। प्रोटिस्ट परजीवी में, उदाहरण के लिए प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम, टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी और ट्राइपानोसोमा ब्रूसी,एमपीपीए परजीवी उग्रता6 और परजीवी में इस अभिव्यक्ति के नॉकआउट के लिए आवश्यक हैं, बाहरी बुनियादी पीएच7के संपर्क में आने पर इंट्रासेलुलर पीएच को बनाए रखने में विफलता का कारण बनते हैं। कशेरुकी में मौजूद उनके महत्व और अाचार प्रोटीन की कमी के कारण, एमपीपीए को प्रोटिस्टल रोगों के लिए संभावित दवा लक्ष्य माना जा सकता है3

इस काम में एमपीपासे अवरोधकों की इन विट्रो स्क्रीनिंग एक TmPPase मॉडल प्रणाली पर आधारित है। TmPPase टी मैरिटिमा से एक सोडियम आयन पंपिंग और पोटेशियम आयन निर्भर mPPase है और 71 डिग्री सेल्सियस8पर अपनी इष्टतम गतिविधि है। इस एंजाइम के लाभ उदाहरण के लिए उत्पादन और शुद्धिकरण, अच्छी थर्मल स्थिरता और उच्च विशिष्ट गतिविधि में इसकी आसानी है। TmPPase स्थिति के पूर्ण संरक्षण के अलावा दोनों उच्च समानता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीस्ट mPPases3,9 और विग्ना रेडिएटा10 mPPase की हल संरचना के लिए सभी उत्प्रेरक अवशेषों की पहचान से पता चलता है । विभिन्न संरचनाओं में TmPPase की उपलब्ध संरचनाएं संरचना-आधारित दवा डिजाइन प्रयोग (आभासी स्क्रीनिंग और डी नोवो डिजाइन के रूप में) के लिए भी उपयोगी हैं।

यहां हम 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप(चित्रा 1)में TmPPase अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। प्रोटोकॉल मोलिब्डेनम ब्लू रिएक्शन की रंगीन विधि पर आधारित है, जिसे पहले फिस्के और सुब्बारो11द्वारा विकसित किया गया था। इस विधि में अम्लीय परिस्थितियों में ऑर्थोहोस्फेट और मोलिबडेट से 12-फॉस्फोमोलिथिक एसिड का गठन शामिल है, जिसे तब विशिष्ट नीले रंग की फॉस्फोमोलिब्डेनम प्रजातियोंको 12देने के लिए कम किया जाता है।

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Protocol

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1. प्रोटीन तैयार करना

नोट: TmPPase की अभिव्यक्ति और शुद्धि कहीं और13वर्णित किया गया है ।

  1. 20 एमएम 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेनेसल्फोनिक एसिड (एमईएस) पीएच 6.5, 3.5% (v/v) ग्लाइरोल, 2 एमएम डिथियोथ्रिटॉल (डीटीटी) और 0.05% डोडेकाइल माल्टोसाइड (डीडीएम) वाले पुनर्सक्रियण बफर समाधान के 10 मीटर तैयार करें।
  2. रिएक्शन मिश्रण के 10 मीटर तैयार करें जिसमें 200 मीटर ट्रिस-सीएल पीएच 8.0, 8.0 एमएम एमजीसीएल2,333 एमएम केसीएल और 67 एमएम एनसीएल शामिल हैं।
    नोट: एमजी2 + को पायरोफॉस्फेट को एमपीपीएई के सब्सट्रेट के रूप में चेलेट करने की आवश्यकता होती है, के+ को एंजाइम गतिविधि को बढ़ाने के लिए आवश्यक है क्योंकि TmPPase एक पोटेशियम निर्भर एमपीपीए है, और टीएमपीपीए द्वारा सोडियम आयन स्थानांतरण के दौरान एंजाइम गतिविधि के लिए एनए+ की आवश्यकता होती है।
  3. एंजाइम रिएक्टिवेशन के लिए 30 एमजी/एमजी लिपोसोम तैयार करें।
    1. 1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 के 10 मीटर के 10 मीटर जोड़ें 1 एमएम डीटीटी के साथ 0.3 ग्राम एल-α-फॉस्फेटिफाइडलकोलिन सोयाबीन से 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 के 10 मीटर के एल के साथ 1 एम एम डीटीटी के साथ।
    2. बर्फ पर लिपोसोम रखो, और 1 मिनट के लिए 1 सेकंड पल्स अंतराल के साथ सोनीकेट, 1 मिनट के लिए रोकें, और दोहराएं जब तक समाधान पारदर्शी पीला न हो जाए।
    3. अलीकोट लिपोसोम्स, तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंजाइम को फिर से सक्रिय करें।
    1. 20% डीडीएम के 22.5 माइक्रोन के साथ लिपोसोम्स समाधान के 40 माइक्रोन मिलाएं।
    2. मिश्रण को 15 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और इसे कमरे के तापमान में ठंडा होने दें।
    3. पुनर्सक्रियण बफर समाधान के 36.5 माइक्रोन जोड़ें, मिश्रण, और 0.13 मिलीग्राम/mL की कुल एकाग्रता बनाने के लिए केंद्रित प्रोटीन (13 मिलीग्राम/mL) के 1 μL जोड़ें।
      नोट: प्रोटीन आमतौर पर शुद्धि के बाद 10 μL aliquots में जमे हुए है और उपयोग से पहले बर्फ पर गल ।
  5. पुनः सक्रिय एंजाइम के 20 μL ले लो और प्रतिक्रिया मिश्रण के १,४८० μL में जोड़ें, तो धीरे मिश्रण ।
    नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए पुनः सक्रिय एंजाइम के अलावा बस से पहले यह प्रयोग किया जाता है प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

2. कंपाउंड तैयारी

  1. यौगिकों की उपलब्धता के आधार पर 50−200 माइक्रोन में 25−100 मीटर के स्टॉक समाधान बनाने के लिए डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) में यौगिकों को भंग करें।
    नोट: यहां इस्तेमाल किए गए सभी यौगिक(चित्रा 2ए)पहले9प्रकाशित किए गए हैं । यदि यौगिक घुलनशीलता कम है, तो स्टॉक एकाग्रता को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  2. पानी में प्रत्येक यौगिक की तीन अलग-अलग सांद्रता तैयार करें।
    नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण में अंतिम सांद्रता क्रमशः घुलनशील और संयम से घुलनशील यौगिकों के लिए 1, 5, और 50 माइक्रोमोलर या 1, 5, और 20 माइक्रोमोलर होगी।
    1. घुलनशील यौगिकों के लिए 2 माइक्रोन, 10 माइक्रोएम और 100 माइक्रोन, या वैकल्पिक रूप से 2 माइक्रोन, 10 माइक्रोन और 40 माइक्रोन देने के लिए माइक्रोट्यूब में 1 मिलील के लिए पानी के साथ स्टॉक समाधान को पतला करें।
    2. उचित मिश्रण के लिए स्टॉक समाधान को कमजोर करने के तुरंत बाद यौगिक समाधान को भंवर करें।
  3. नेफेलोमीटर का उपयोग करके यौगिक एकत्रीकरण की जांच करें।
    नोट: यह तीन सांद्रता (1 μM, 5 μM और 20 μM) में त्रिपाल के रूप में अध्ययन किया गया था और एक ९६ अच्छी तरह से थाली में खाली करने के लिए सामान्यीकृत ।
    1. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में प्रतिक्रिया मिश्रण के 75 माइक्रोन वितरित करें।
    2. प्रत्येक यौगिक के 75 माइक्रोन जोड़ें (खाली के लिए, इसके बजाय 75 माइक्रोन पानी का उपयोग करें) और 5 × ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
    3. माइक्रोप्लेट नेफेलोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 300 वी पर मापें।

3. परख की तैयारी के लिए अभिकर्मक

  1. आर्सेनिट-सिट्रेट सॉल्यूशन तैयार करें।
    1. 5 ग्राम सोडियम आर्सेनिट और 5 ग्राम ट्राइसोडियम साइट्रेट डिहाइड्रेट का वजन करें।
      सावधानी: सोडियम आर्सेनिट विषाक्त है, इस प्रकार उचित सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें और विशेष देखभाल के साथ संभाल। एहतियात के तौर पर, सभी आवश्यक सुरक्षा सावधानियों को पढ़ने और समझने से पहले संभाल न करें। यौगिक या उसके समाधान (ओं) की धूल/वाष्प को श्वास न लेने के लिए केवल धुएं के हुड में संभालें। यदि साँस ले, ताजी हवा में ले जाएं और चिकित्सा ध्यान प्राप्त करें। घूस और आंख/त्वचा से संपर्क से बचने के लिए उचित रासायनिक सुरक्षा चश्मे, सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें । यदि निगल लिया जाता है, तो तुरंत जहर केंद्र या डॉक्टर/चिकित्सक को कॉल करें। यदि यह त्वचा पर या आंख (एस) में हो जाता है, तो बहुत सारे पानी से धोएं और चिकित्सा ध्यान प्राप्त करें।
    2. 100 मीटर पानी में घुलें।
    3. हिमनदों के 5 मिलीएल को असित एसिड डालें, मिलाएं, और 250 मिलील में पानी डालें।
    4. कमरे के तापमान पर स्टोर प्रकाश से संरक्षित।
      नोट: समाधान एक साल से अधिक समय के लिए स्थिर है।
  2. समाधान ए और समाधान बी तैयार करें।
    1. समाधान ए के लिए, बर्फ ठंडा 0.5 एम एचसीएल के 10 मिलीग्राम को एस्कोम्बिक एसिड के 0.3 ग्राम में जोड़ें। भंवर द्वारा एस्कोबिक एसिड भंग।
    2. समाधान बी के लिए, बर्फ ठंडे पानी के 1 एमएल को 70 मिलीग्राम अमोनियम हेप्टामोलिडेट टेट्राहाइड्रेट और भंवर को भंग करने के लिए जोड़ें।
      नोट: उपयोग तक बर्फ पर दोनों समाधान स्टोर करें। परख परिणाम की निरंतरता के लिए, दोनों समाधान एक सप्ताह की एक अधिकतम के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. कैलिब्रेशन के लिए 0 माइक्रोन, 62.5 माइक्रोन, 250 माइक्रोन और 500 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ फॉस्फेट (पीआई)मानक तैयार करें।
    1. रिएक्शन मिश्रण के 370 माइक्रोन युक्त चार माइक्रोट्यूब में 0 माइक्रोन, 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन और 5 एमएम एनए2एचपीओ4 डिहाइड्रेट के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    2. पानी के साथ 1 mL तक ऊपर।

4. एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए गतिविधि परख

नोट: परख के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह के लिए चित्रा 1 देखें ।

  1. समाधान ए के 10 मिलीएल में समाधान बी का 1 मिलील जोड़ें, भंवर द्वारा मिलाएं और बर्फ पर समाधान स्टोर करें।
    नोट: यह समाधान पारदर्शी और पीला होना चाहिए। उपयोग करने से पहले कम से कम 30 कम समय के लिए बर्फ पर समाधान ए + बी रखें। हालांकि, 3 घंटे के भीतर समाधान का उपयोग करें क्योंकि यह दीर्घकालिक भंडारण के बाद खराब हो जाएगा।
  2. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके ट्रिपलकेट में ट्यूब स्ट्रिप्स में 0 माइक्रोन, 62.5 माइक्रोन, 250 माइक्रोन और 500 माइक्रोएम पीआई मानक के 40 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: कोई पीमैं जोड़ा के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण एक खाली के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके ट्यूब स्ट्रिप्स में यौगिक समाधान के 25 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक यौगिक में ट्रिपलेट में तीन अलग-अलग सांद्रता होती है जो आधे अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50)के प्रारंभिक अनुमान के लिए पर्याप्त है। अधिक सटीक आईसी50 दृढ़ संकल्प के लिए, आठ अलग-अलग यौगिक सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। बेहिचक एंजाइम के लिए यौगिक समाधान को समान मात्रा में पानी से बदल दिया जाता है। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2.5 माइक्रोन, 25 माइक्रोन, और इमिडोडिफॉस्फेट (आईडीपी) सोडियम नमक के 250 माइक्रोन का उपयोग किया गया था।
  4. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके ट्यूब स्ट्रिप्स (पीआई मानक युक्त ट्यूबों को छोड़कर) में एमपीएई समाधान मिश्रण के 15 माइक्रोन जोड़ें।
  5. ट्यूब स्ट्रिप्स को चिपकने वाली सीलिंग शीट से सील करें। प्रत्येक ट्यूब पट्टी को अलग करने के लिए सीलिंग शीट काट ें।
  6. 5 मिन के लिए 71 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल प्री इनक्यूबेट करते हैं। बाद के चरणों के दौरान समय की खपत को कम करने के लिए प्रत्येक पट्टी के बीच 20 एस अंतराल के साथ हीटिंग ब्लॉक पर नमूनों को रखें।
  7. प्रत्येक पट्टी के लिए, चिपकने वाली सीलिंग खोलें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 2 एमएम सोडियम पायरोफॉस्फेट डिबेसिक के 10 माइक्रोन जोड़ें और 5 × के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। उसी सीलिंग का इस्तेमाल करफिर से ट्यूब स्ट्रिप को सील करें।
    नोट: यह कदम शुरू में 20 एस में पूरा करने के लिए मुश्किल हो सकता है; हालांकि कुछ परख के बाद यह आसान हो जाएगा।
  8. 5 मिन के लिए 71 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. प्रत्येक पट्टी के बीच 20 एस अंतराल के साथ कूलिंग उपकरण पर नमूने रखें। उन्हें 10 मिन के लिए ठंडा करते हैं लेकिन प्रत्येक पट्टी को ठंडा करने के 5 मिन के बाद संक्षेप में, सीलिंग शीट के नीचे पानी की बूंदों को डिडेंट करने के लिए, फिर इसे ठंडा करने वाले उपकरण पर वापस डाल दें और सीलिंग को हटा दें।
    नोट: कूलिंग उपकरण बस एक पॉलीस्टीरिन पेट्री डिश (आकार 150 मिमी × 15 मिमी) पानी से भरा और कम से कम 1 घंटे के लिए जमे हुए पर एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट रखकर बनाया जा सकता है। परख की शुरुआत से पहले उपकरण को फ्रीजर से लगभग 5 मिनट तक बाहर निकाला जाना चाहिए। नमूना ठंडा होने से ठीक पहले ठंडा उपकरण बाहर न लें क्योंकि यह प्रतिक्रिया मिश्रण को फ्रीज कर देगा और रंग विकास में बाधा डालेगा।
  10. कूलिंग के 10 मिन के बाद, समाधान ए + बी के 60 माइक्रोन जोड़ें, 5 × के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं और ट्यूब स्ट्रिप्स को 10 मिन के लिए कूलिंग उपकरण पर रखें।
  11. आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान के 90 माइक्रोन जोड़ें और एक स्थिर नीले रंग का उत्पादन करने के लिए कम से कम 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
    सावधानी: इसकी विषाक्तता के कारण सोडियम आर्सेनाइट युक्त सभी समाधानों को हर समय अतिरिक्त देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। इस प्रकार, आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान के अलावा एक धुएं हुड में किया जाना चाहिए।
  12. प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के 180 माइक्रोन को एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लेट में वितरित करें।
  13. माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 860 एनएम पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को मापें।

5. परिणाम विश्लेषण

  1. प्रत्येक नमूने की त्रिपालों और पीआई मानकों का औसत करें। फिर पृष्ठभूमि संकेत को खत्म करने के लिए खाली के साथ घटाना।
  2. पीआई मानक (एनमोल) की राशि के खिलाफ अवशोषक (ए860)मूल्यों की साजिश रचकर एक अंशांकन वक्र बनाएं और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ट्रेंडलाइन फ़ंक्शन प्राप्त करने के लिए रैखिक प्रतिगमन करें:
    Equation 1
  3. ऊपर रैखिक प्रतिगमन सूत्र के आधार पर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया से जारी फॉस्फेट राशि (एनमोल) की गणना करें।
  4. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके विशिष्ट गतिविधि की गणना करें:
    Equation 2
    जहां एनपीआई प्रतिक्रिया (एनएमओल) से जारी फॉस्फेट की मात्रा है, टी प्रतिक्रिया समय (न्यूनतम) है, और एमTmPPase परख (मिलीग्राम) में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध TmPPase की मात्रा है।
  5. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक अवरोधक एकाग्रता के लिए प्रतिशत गतिविधि की गणना करें:
    Equation 3
    जहां एसएमैंअवरोधक और एसएसंयुक्त राष्ट्र के साथ एक नमूने की विशिष्ट गतिविधि बेहिचक नमूने की विशिष्ट गतिविधि है ।
  6. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके चार-पैरामीटर खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से एक nonlinear प्रतिगमन फिट के साथ लॉगआईसी50 (अनुमान) और आईसी50 (अनुमान) की गणना करें:
    Equation 4
    जहां एक्स एकाग्रता का लॉग है (μM), वाई गतिविधि है (%), ऊपर और नीचे वाई (100% और 0%, क्रमशः) के रूप में एक ही इकाई में पठार हैं, लॉगआईसी50 में एक्स के समान लॉग इकाइयां हैं, और हिलस्लोप = ढलान कारक या पहाड़ी ढलान, जो यूनिटलेस है।
    नोट: सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)फिटिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। अवरोधक के बिना नमूने के लिए 0.01 माइक्रोएम (0.00 माइक्रोएम के बजाय) की एकाग्रता का उपयोग करें क्योंकि शून्य का लोगरिथम ्म परिभाषित नहीं है।

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल में, सकारात्मक नियंत्रण के रूपमें, पाइरोफोस्फेटेस के एक आम अवरोधक आईडीपी के साथ आठ यौगिकों (1−8) का परीक्षण किया गया था। प्रत्येक यौगिक तीन अलग सांद्रता (1 μM, 5 μM और 20 μM) ट्रिपलकेट में परीक्षण किया गया था । स्क्रीनिंग के कार्यप्रवाह को चित्रा 1में चित्रित किया गया है, जो नमूना और अभिकर्मक तैयारी से शुरू होकर 860 एनएम पर अवशोषण माप न हो।

इस प्रोटोकॉल के अंत में, समाधान ए + बी और आर्सेनिट-साइट्रेट के अलावा, समाधान मोलिडेट के साथ फॉस्फेट आयनों के जटिल गठन के कारण 709 एनएम और 860 एनएम14 पर अधिकतम अवशोषण के साथ एक स्थिर नीला रंग विकसित करते हैं जिसे देखा जा सकता है और एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया की घटना को दिखाता है। इस प्रयोग के लिए, हम जारी पीआई राशि के माप के लिए 860 एनएम पर अवशोषण का उपयोग करते हैं क्योंकि इसमें 709 एनएम15पर अवशोषण की तुलना में बेहतर पता लगाने की सीमा और संवेदनशीलता है। नीले रंग को कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के 30 न्यूनतम में पूरी तरह से विकसित किया जाता है और कम से कम 5 घंटे14के लिए स्थिर होता है। परख में 10 माइक्रोन की पीआई एकाग्रता के प्रति संवेदनशीलता है और अवशोषण 10−800 माइक्रोन14की एकाग्रता सीमा पर रैखिक है। यहां प्रतिनिधि परिणाम में, वेल्स E1−E3(चित्रा 2C)अवरोधक के बिना प्रतिक्रिया मिश्रण होते हैं और परख के अंत में नीले समाधान को देखा जा सकता है। यह कम यौगिक सांद्रता पर भी देखा जा सकता है जहां पूर्ण अवरोध नहीं पहुंचा है, जैसा कि कुओं में एफ 1−एफ 3 आईडीपी और वेल्स के लिए F4−A6 यौगिक 1 (एटीसी, TmPPase9का हाल ही में ज्ञात अप्रतिस्पर्धी अवरोधक) क्रमशः 2.5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन की एकाग्रता पर। आईडीपी और यौगिक 1की उच्च एकाग्रता, कम से कम नीले रंग (आईडीपी के लिए G1−G3 और H1−H3 और यौगिक 1के लिए बी 4−बी 6 और सी4−सी6) का अवलोकन किया जा सकता है जो एंजाइमैटिक गतिविधि के अवरोध का संकेत देता है। गैर-अवरोधक यौगिकों की सभी तीन सांद्रता(2, 3,और 8)ने बिना किसी अवरोधक(चित्रा 2C)के कुओं E1−E3 के रूप में एक ही नीले रंग की तीव्रता प्रदर्शित की।

860 एनएम पर अवशोषण माप के बाद, डेटा को संसाधित और विश्लेषण किया जा सकता है (प्रोटोकॉल अनुभाग 5 देखें)। चित्रा 2डी अपने रैखिक फिटिंग (y = 0.0576x + 0.0019) के साथ पीआई मानक के अंशांकन भूखंड को दर्शाता है; r2 = 0.999)। चित्रा 3 एंजाइमैटिक गतिविधि की साजिश से पता चलता है (%) प्रत्येक परीक्षण यौगिक की एकाग्रता के खिलाफ। अवरोध गतिविधि वाले यौगिकों के लिए, एक nonlinear वक्र फिटिंग भी दिखाई जाती है। IDP, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया, स्पष्ट रूप से उच्च एकाग्रता पर गतिविधि में कमी से पता चलता है । तीन अलग-अलग सांद्रता के आधार पर गणना की गई आईसी50 (अनुमान) 88.2 माइक्रोन(तालिका 1)है, जो आठ एकाग्रता अंक14के साथ पिछले माप (80.0 माइक्रोन) के समान है। यौगिक1, 4, 5, 6और 7 ने आईडीपी के रूप में इसी तरह की प्रवृत्ति दिखाई क्योंकि लगभग 1.3 माइक्रोन, 7.4 माइक्रोन, 19.0 माइक्रोन, 37.4 माइक्रोन और 156.1 माइक्रोन(तालिका 1)के आईसी50 (अनुमान) के साथ एकाग्रता बढ़ी है। यौगिकों के लिए 2, 3,और 8 परख सांद्रता पर गतिविधि या अवरोध में कोई कमी नहीं देखी जा सकती है। सटीक आईसी50उत्पन्न करने के लिए आठ एकाग्रता बिंदुओं के साथ एक अतिरिक्त परख किया जा सकता है। चित्रा 4 यौगिकों के लिए अवरोध वक्र दिखाता है 1, 5, 6, 7 और 8 के आईसी50 के साथ 1.7 माइक्रोन, 21.4 माइक्रोन, 58.8 माइक्रोन, 239.0 माइक्रोन और >500 माइक्रोन, क्रमशः9.

Figure 1
चित्रा 1: एक ९६ अच्छी तरह से थाली प्रारूप में TmPPase अवरोध परख का एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । लाल नंबरिंग प्रोटोकॉल के अनुसार परख के कदम दिखाता है और नीले तीर अंतराल आदेश दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नमूने, उनकी व्यवस्था और एक ९६ अच्छी तरह से थाली में रंग विकास । (A)यौगिकों की संरचनाएं 1−8 परख के लिए उपयोग की जाती हैं। इन यौगिकों की अवरोध गतिविधि विडिलेरिस एट अल 9 में सूचित किया गयाहै(ख)नमूना व्यवस्था। (ग)रंग विकास, आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान के अलावा 30 00। नियंत्रण अवरोधक (आईडीपी) और उपयोग किए गए नमूनों की सांद्रता, ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित, क्रमशः 2.5 माइक्रोन, 25 माइक्रोन, और 250 माइक्रोन एकाग्रता और 1 माइक्रोन, 5 माइक्रोन और 20 माइक्रोन एकाग्रता हैं। नीले रंग की तीव्रतामुझे एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया के कारण जारी की गई पी की मात्रा से मेल खाती है और रंग की कमी कोई एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया से मेल खाती है। (D)रैखिक फिटिंग (y = 0.0576x + 0.0019) के साथ860 के खिलाफ पीआई स्टैंडर्ड (एनमोल) के लिए कैलिब्रेशन वक्र; r2 = 0.999)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तीन अलग अलग अवरोधक सांद्रता के लिए TmPPase प्रतिशत गतिविधि के वक्र । आईसी50 (अनुमान) की गणना करने के लिए nonlinear प्रतिगमन घटता आईडीपी के साथ-साथ यौगिकों 1, 4, 5, 6 और 7 के लिए दिखाया गया है, लेकिन यौगिकों 2, 3और 8 के लिए नहीं क्योंकि वे परख सांद्रता पर TmPPase गतिविधि को बाधित नहीं कर रहे थे। प्रत्येक यौगिक के लॉगआईसी50 और आईसी50 (अनुमान) तालिका 1में दिखाए गए हैं। सभी डेटा तीन प्रतिकृति के साथ मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: यौगिकों के आठ एकाग्रता बिंदुओं से अवरोध वक्र 1, 5, 6, 7 और 8। यह आंकड़ा मामूली संशोधन केसाथ विडिलेरिस एट अल 9 से लिया जाता है। सभी डेटा तीन प्रतिकृति के साथ मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना लॉगआईसी50 आईसी50 (अनुमान) (μM)
Idp 1.95 ± 0.0142 87.9 ± 2.46
1 0.112 ± 0.0274 1.29 ± 0.0816
2 कोई अवरोध नहीं
3 कोई अवरोध नहीं
4 0.870 ± 0.0447 7.39 ± 0.760
5 1.28 ± 0.0296 19.0 ± 1.29
6 1.57 ± 0.0846 37.4 ± 7.29
7 2.19 ± 0.366 156 ± 131
8 कोई अवरोध नहीं

तालिका 1: आईडीपी के लॉगआईसी50 और आईसी50 (अनुमान) और चित्रा 3के डेटा के आधार पर यौगिक 1−8।

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Discussion

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यहां हम विडिलेरिस एट अल14के आधार पर 96 वेल प्लेट प्रारूप में टी मैरिटिमा से झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेज़ के लिए अवरोधकों की सरल स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह प्रोटोकॉल सस्ती है और 12-फॉस्फोमोमोलिब्डिक एसिड पर आधारित है, जो अम्लीय परिस्थितियों में ऑर्थोहोस्फेट और मोलिडेट से बनता है और एक अलग नीले रंगकेसाथ फॉस्फोमोलिब्डेनम प्रजातियों में कम हो जाता है। इस विधि को अन्य प्रोटोकॉलों पर पसंद किया जाता है, जैसे कि अधिक संवेदनशील मैलाचिते हरे परख16,क्योंकि यह विधि उच्च फॉस्फोलिपिड एकाग्रता की उपस्थिति में हस्तक्षेप नहीं दिखाती है जो TmPPase पुनर्सक्रियण14के लिए आवश्यक है।

स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को चित्रा 1 में चित्रित किया गया है और इस प्रक्रिया को पूरी तरह से 1 घंटे में पूरा किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल TmPPase के लिए 71 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम काम करने के तापमान और 5 न्यूनतम प्रतिक्रिया समय के साथ अनुकूलित किया गया है। चूंकि प्रतिक्रिया मिश्रण से इस तापमान पर पानी वाष्पित हो जाएगा, वाष्पीकरण14 को रोकने के लिए एक चिपकने वाली सीलिंग शीट (फिट और कवर करने के लिए कटा हुआ) लागू किया जाता है और सुखाया हुआ पानी बस केंद्रीकरण के साथ याद किया जाता है। 5 मिन ऊष्मायन समय चुना जाता है क्योंकि यह अभी भी एंजाइमैटिक रूप से जारी फॉस्फेट की रैखिक रेंज में है और विश्वसनीय स्क्रीनिंग14के लिए पर्याप्त है । इस प्रोटोकॉल में, एक अच्छा और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए समय और पाइपिंग कौशल महत्वपूर्ण कारक हैं। स्ट्रिप्स के बीच 20 एस अंतराल के साथ परख के दौरान अभिकर्मकों के अलावा बाद के चरणों को करने में आसानी के लिए एक अनुकूलित समय विकल्प है।

विभिन्न mPPases के लिए, इष्टतम तापमान और ऊष्मायन समय अवरोध परख में उपयोग करने से पहले अलग से निर्धारित किया जाना चाहिए । ऊपर दिए गए एंजाइम पुनर्सक्रियण प्रोटोकॉल को TmPPase के लिए अनुकूलित किया गया है और अन्य mPPases को एक अलग पुनर्सक्रियण प्रोटोकॉल की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पाइरोबाकुलम एयरोफिलम से एमपीपीएई को फिर से सक्रिय करने के लिए डीडीएम नहीं जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि यह इसकी एंजाइमैटिक गतिविधि17को कम कर देगा। चूंकि एंजाइम पहले से अच्छी तरह से तैयार होने पर कम सक्रिय हो जाएगा, इसलिए परख शुरू होने से कुछ देर पहले प्रतिक्रिया मिश्रण में पुनः सक्रिय एंजाइम को जोड़ा जाना चाहिए। आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान के अलावा प्रतिक्रिया उत्पाद कम से कम 5 घंटे14के लिए स्थिर है। इसलिए, परख के अगले बैच को तुरंत किया जा सकता है, और अवशोषण माप को बाद में सभी बैचों को एक बार में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को जेन और Aatos Erkko फाउंडेशन और BBSRC (BB/M021610) से एड्रियन गोल्डमैन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, फिनलैंड अकादमी (नंबर 308105) केनी विडिलेरिस, (नंबर 310297) से हेनरी Xhaard, और (नंबर 265481) को जरी येली-काउहल्लुमा, और यूनिवर्सिटी ऑफ हेलसिंकी रिसर्च फंड्स से गुस्ताव बोइजे एएफ जेनास। लेखक परियोजना के दौरान उसकी तकनीकी मदद के लिए बर्नाडेट गेहल का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

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References

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<em>थर्मोटोगा मैरिटिमा</em> झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग
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Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

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