Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) konnten bisher als vielversprechende Quelle pluripotenter Zellen für die Behandlung von derzeit unheilbaren Krankheiten, für die Rekonstitution und Regeneration von verletztem Gewebe und für die Entwicklung neuer Medikamente betrachtet werden. Trotz aller Vorteile im Zusammenhang mit der Verwendung von iPSCs, wie das geringe Risiko einer Ablehnung, die verringerten ethischen Fragen und die Möglichkeit, sie von jungen und alten Patienten ohne Unterschied in ihrem Reprogrammierungspotenzial zu erhalten, Probleme zu überwinden sind immer noch zahlreich. Tatsächlich kann eine Zellumprogrammierung, die mit viralen und integrierenden Viren durchgeführt wird, Infektionen verursachen, und die Einführung der erforderlichen Gene kann eine genomische Instabilität der Empfängerzelle induzieren und deren Einsatz in der Klinik beeinträchtigen. Insbesondere gibt es viele Bedenken über die Verwendung des c-Myc-Gens, das aus mehreren Studien für seine mutationsinduzierende Aktivität bekannt ist. Fibroblasten haben sich als die geeignete Zellpopulation für die zelluläre Reprogrammierung herausgebildet, da sie leicht zu isolieren und zu kulturieren sind und durch eine minimalinvasive Hautpunschbiopsie geerntet werden. Das hier beschriebene Protokoll enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung des gesamten Verfahrens, von der Probenverarbeitung zur Gewinnung von Zellkulturen, der Wahl der Reagenzien und Vorräte, der Reinigung und Zubereitung bis hin zur Zellumprogrammierung mittels einer kommerziellen nicht modifizierte RNAs (NM-RNAs)-basiertes Reprogramming Kit. Das gewählte Reprogramming Kit ermöglicht eine effektive Umprogrammierung von humanem Dermalem Fibroblasten auf iPSCs und kleine Kolonien können bereits 24 h nach der ersten Transfektion gesehen werden, auch bei Modifikationen in Bezug auf das Standarddatenblatt. Das in diesem Protokoll verwendete Reprogrammierungsverfahren bietet den Vorteil einer sicheren Neuprogrammierung, ohne das Risiko von Infektionen, die durch virale vektorbasierte Methoden verursacht werden, reduziert die zellulären Abwehrmechanismen und ermöglicht die Generierung von xenofreien iPSCs, alle kritische Merkmale, die für weitere klinische Anwendungen obligatorisch sind.
Die Zellumprogrammierung stellt eine neuartige Technologie dar, um jede somatische Zelle des Körpers in eine pluripotente Stammzelle, bekannt als iPSC1,zu verwandeln. Die Möglichkeit, eine adulte somatische Zelle wieder in einen pluripotenten und undifferenzierten Zustand umzuprogrammieren, hat die Grenzen überwunden, die durch die schlechte Verfügbarkeit und ethische Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung pluripotenter Zellen auferlegt wurden, die bisher nur von menschlichen Embryonen (embryonalen Stammzellen oder ESC)abstammten2,3,4. Im Jahr 2006 führten Kazutoshi Takahashi und Shinya Yamanaka eine bahnbrechende Studie durch, die die erste Umwandlung von adulten somatischen Zellen aus der Haut in pluripotente Zellen durch künstliche Zugabe von vier spezifischen Genen (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Ein Jahr später führten arbeiten in Thomsons Labor zur erfolgreichen Umprogrammierung somatischer Zellen in iPSCs durch Transduktion einer anderen Kombination von vier Genen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs bieten Wissenschaftlern und Forschern aus verschiedenen Bereichen, wie regenerative Medizin und Pharmakologie, eine Reihe von Möglichkeiten, um verschiedene Krankheiten zu untersuchen und zu behandeln, zusammen mit einer gechromischen Reflexion der Eigenschaften des Patienten, aus dem sie abgeleitet sind. Die Verwendung von iPSCs bietet mehrere Vorteile, darunter: das reduzierte Risiko für die Immunantwort aufgrund einer völlig autologen Herkunft der Zellen; die Möglichkeit, eine Zellbibliothek zu schaffen, ein wichtiges Werkzeug, um die Reaktion auf neue Medikamente und ihre Nebenwirkungen vorherzusagen, da sie in der Lage sind, sich kontinuierlich selbst zu erneuern und verschiedene Zelltypen zu erzeugen; und die Möglichkeit, einen maßgeschneiderten Ansatz für die Verabreichung von Arzneimitteln zu entwickeln7,8,9.
Verschiedene Techniken sind derzeit bekannt, um die Expression der Reprogrammierungsfaktoren zu induzieren, und sie sind in zwei Hauptkategorien enthalten: nichtvirale und virale vektorbasierte Methoden10,11,12,13. Nicht-virale Methoden umfassen mRNA-Transfektion, miRNA-Infektion/Transfektion, PiggyBac, Minicircle-Vektoren und episomale Plasmide und Exosomen10,11,12,13. Virale Methoden umfassen nicht integrierende Viren wie Adenovirus, Sendai-Virus und Proteine sowie die Integration von Viren wie Retrovirus und Lentivirus10,11,12,13.
Mehreren Studien zufolge wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen Methoden in Bezug auf die Wirksamkeit der Zellreprogrammierung festgestellt, daher hängt die Wahl des geeigneten Verfahrens streng vom verwendeten Zelltyp und von den nachfolgenden Anwendungen der erhaltenen iPSCsab 14,15. Alle genannten Methoden zeigen Nachteile, zum Beispiel, das Sendai-Virus ist für alle Zelltypen wirksam, erfordert aber viele Passagen, um iPSCs zu erhalten; Die Umprogrammierung durch Episomen eignet sich hervorragend für Blutzellen, benötigt jedoch eine Änderung der Standardkulturbedingungen für Fibroblasten; die PiggyBac-Methode könnte eine attraktive Alternative darstellen, aber Studien in menschlichen Zellen sind immer noch begrenzt und schwach10,11,12,13. Exosomen sind Nanovesikeln, die von Zellen physiologisch in alle Körperflüssigkeiten abgesondert werden. Jüngsten Studien zufolge sind sie für die interzelluläre Kommunikation verantwortlich und können in wichtigen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Migration und Differenzierung eine Rolle spielen. Exosomen können mRNA und miRNA mit einem völlig natürlichen Mechanismus transportieren und in Empfängerzellen übertragen, da sie die gleiche Zusammensetzung der Zellmembran16teilen. Daher sind Exosomen eine vielversprechende Neue-Generation-Technik für die Neuprogrammierung, aber ihr Potenzial, somatische Zellen nach ihrem Inhalt neu zu programmieren, wird noch untersucht. Virale vektorbasierte Methoden verwenden modifizierte Viren, um Reprogrammierungsgene an Empfängerzellen zu vermitteln. Diese Technik, trotz der hohen Effizienz der Umprogrammierung, gilt nicht als sicher, da die Integration des Virus in die Zelle für Infektionen, Teratome und genomische Instabilität verantwortlich sein kann17.
Das folgende Protokoll zur Erzeugung von iPSCs-Kolonien kombiniert den Neuprogrammierungscocktail von Yamanaka und Thompson und basiert auf der Anwendung einer Methode, die NM-RNAs und Immunevasion-Faktoren mit der Möglichkeit, sie unter xenofreien Bedingungen durchzuführen, erfordert. Der Grund für die Anwendung dieser Methode ist, innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft ein Protokoll zu verbreiten, das eine schnelle, einfache und hochwirksame Reprogrammierung von erwachsenen menschlichen Fibroblasten von der Bauchhaut in iPSCs18ermöglicht.
Die Stärken der vorgeschlagenen Methode sind in der Tat die einfache Leistung und die kurze Zeit, die für den Erhalt von iPSCs erforderlich ist. Darüber hinaus vermeidet die Methode zelluläre Abwehrmechanismen und die Verwendung von viralen Vektoren, die für relevante Probleme verantwortlich sind.
In Bezug auf das Standardprotokoll wurden folgende Änderungen vorgenommen: (1) Konfluente Fibroblasten wurden in Durchgang 4 synchronisiert, indem sie vor der Trypsinisierung 0,1% Serum für 48 h platzierten; (2) Die Zelldichte für Kultur und das Volumen der Reagenzien wurden für die Verwendung auf einer 24-Well-Multi-Well-Platte anstelle einer 6-Well-Platte angepasst; (3) Das Reprogrammierungsexperiment wurde mit einem 5%CO2-Inkubator anstelle eines Inkubators mit atmosphärischen (21%O2) oder hypoxischen (5%O2) Bedingungen durchgeführt.
iPSCs entwickeln sich schnell zum vielversprechendsten Zellkandidaten für Anwendungen in der regenerativen Medizin und zu einem enorm nützlichen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und Arzneimitteltests3,8. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Generierung menschlicher iPSCs aus einer Probe mit der Größe einer Hautpunschbiopsie mit einem einfachen und effizienten Verfahren, das keine spezifische Ausrüstung oder vorkenntnisse.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Anerkennung.
10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |