Summary
Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.
Abstract
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kunnen tot op heden worden beschouwd als een veelbelovende bron van pluripotente cellen voor het beheer van momenteel onbehandelbare ziekten, voor de reconstitutie en regeneratie van gewonde weefsels en voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Ondanks alle voordelen met betrekking tot het gebruik van iPSCs, zoals het lage risico van afwijzing, de verminderde ethische kwesties, en de mogelijkheid om ze te verkrijgen van zowel jonge als oude patiënten zonder enig verschil in hun herprogrammatie potentieel, problemen om te overwinnen zijn nog steeds talrijk. In feite kan het opnieuw programmeren van cellen, uitgevoerd met virale en het integreren van virussen, infecties veroorzaken en kan de introductie van vereiste genen een genomische instabiliteit van de ontvangende cel induceren, waardoor het gebruik ervan in de kliniek wordt aantasten. In het bijzonder zijn er veel zorgen over het gebruik van c-myc gen, bekend uit verschillende studies voor de mutatie-inducerende activiteit. Fibroblasten zijn ontstaan als de geschikte celpopulatie voor cellulaire herprogrammering omdat ze gemakkelijk te isoleren en cultuur en worden geoogst door een minimaal invasieve huid Punch biopsie. Het hier beschreven protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de hele procedure, van de monsterverwerking tot het verkrijgen van celculturen, de keuze van reagentia en leveringen, de reiniging en de voorbereiding, tot de herprogrammering van de cellen door middel van een commerciële niet-gemodificeerde RNAs (NM-RNAs)-gebaseerde herprogrammeerset. De gekozen herprogrammeeringskit maakt een effectieve herprogrammering van menselijke huid fibroblast naar iPSCs mogelijk en kleine kolonies kunnen al 24 uur na de eerste transfectie worden gezien, zelfs met wijzigingen met betrekking tot het standaardgegevens blad. De herprogrammatie procedure die in dit protocol wordt gebruikt, biedt het voordeel van een veilige herprogrammering, zonder het risico van infecties veroorzaakt door op virale vectoren gebaseerde methoden, vermindert de cellulaire afweermechanismen en maakt het mogelijk om xeno-vrije iPSCs te genereren, alle kritieke functies die verplicht zijn voor verdere klinische toepassingen.
Introduction
Celherprogrammering vertegenwoordigt een nieuwe technologie om elke somatische cel van het lichaam om te zetten in een pluripotente stamcel, bekend als iPSC1. De mogelijkheid om een volwassen somatische cel terug te herprogrammeren naar een pluripotente en ongedifferentieerde toestand heeft de grenzen overwonnen die zijn opgelegd door de slechte beschikbaarheid en ethische kwesties in verband met het gebruik van pluripotente cellen, die voorheen alleen konden worden afgeleid van menselijke embryo's (embryonale stamcellen of ESC)2,3,4. In 2006 voerden Kazutoshi Takahashi en Shinya Yamanaka een baanbrekend onderzoek uit om de eerste conversie van volwassen somatische cellen van de huid naar pluripotente cellen te bereiken door kunstmatig vier specifieke genen toe te voegen (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Een jaar later leidde het werk in het laboratorium van Thomson tot de succesvolle herprogrammering van somatische cellen in iPSCs door transductie van een andere combinatie van vier genen (Oct4, Sox2, nanog, Lin28)6.
iPSCs bieden een aantal mogelijkheden voor wetenschappers en onderzoekers van verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde en farmacologie, zijnde een uitstekend platform voor het bestuderen en behandelen van verschillende ziekten, samen met een genotypische reflectie van de kenmerken van de patiënt die ze zijn afgeleid van. Het gebruik van iPSCs biedt verschillende voordelen, waaronder: het verlaagde risico op immuunrespons als gevolg van een volledig autologe oorsprong van cellen; de mogelijkheid van het creëren van een celbibliotheek, een belangrijk instrument om de reactie op nieuwe drugs en hun bijwerkingen te voorspellen, als ze in staat zijn om voortdurend Self-verlengen en het genereren van verschillende celtypen; en de kans om een aangepaste aanpak voor Drug Administration7,8,9te ontwikkelen.
Op dit moment zijn diverse technieken bekend om de expressie van de herprogrammatie factoren te induceren en ze zijn opgenomen in twee belangrijke categorieën: niet-virale en virale vector-gebaseerde methoden10,11,12,13. Niet-virale methoden omvatten mRNA transfectie, Mirna-infectie/transfectie, piggybac, minicircle vectoren en episomale plasmiden en exosomen10,11,12,13. Virale gebaseerde methoden omvatten niet-integrerende virussen, zoals adenovirus, Sendai virus en eiwitten, en het integreren van virussen zoals retrovirus en lentivirus10,11,12,13.
Volgens verschillende studies, geen significante verschillen zijn opgemerkt onder deze methoden in termen van effectiviteit van celherprogrammering, vandaar, de keuze van de geschikte methode strikt afhankelijk van het gebruikte type cel en op de daaropvolgende toepassingen van de ipscs verkregen14,15. Alle genoemde methoden vertonen nadelen, bijvoorbeeld, het Sendai-virus is effectief op alle celtypen, maar vereist veel passages om iPSCs te verkrijgen; herprogrammering door episomes is uitstekend voor bloedcellen, maar heeft behoefte aan aanpassing van de standaardcultuur omstandigheden voor fibroblasten; de piggybac-methode kan een aantrekkelijk alternatief zijn, maar studies in menselijke cellen zijn nog steeds beperkt en zwak10,11,12,13. Exosomen zijn nano-blaasjes fysiologisch uitgescheiden in alle lichaamsvloeistoffen door cellen. Volgens recente studies zijn ze verantwoordelijk voor intercellulaire communicatie en kunnen ze een rol spelen in belangrijke biologische processen, zoals celproliferatie, migratie en differentiatie. Exosomen kunnen mRNA en miRNA transporteren en overdragen aan ontvangende cellen met een volledig natuurlijk mechanisme, omdat ze dezelfde samenstelling van het celmembraan16delen. Daarom zijn exosomen een veelbelovende nieuwe generatie techniek voor herprogrammering, maar hun potentieel om somatische cellen te herprogrammeren door hun inhoud wordt nog steeds onderzocht. Virale vectoren gebaseerde methoden gebruiken virussen aangepast om herprogrammatie genen over te brengen naar ontvangende cellen. Deze techniek, ondanks de hoge efficiëntie van herprogrammering, wordt niet als veilig beschouwd, omdat de integratie van het virus in de cel verantwoordelijk kan zijn voor infectie, teratomen en genomische instabiliteit17.
Het volgende protocol voor het genereren van iPSCs kolonies combineert de Yamanaka en Thompson's Herprogrammeerbare cocktail en is gebaseerd op het gebruik van een methode die NM-Rna's en immuun ontduiking factoren vereist met de mogelijkheid om het uit te voeren in xeno-vrije omstandigheden. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om binnen de wetenschappelijke gemeenschap een protocol te verspreiden dat een snelle, eenvoudige en zeer effectieve herprogrammering van volwassen menselijke fibroblasten uit de buikhuid in iPSCs18mogelijk maakt.
De sterke punten van de voorgestelde methode zijn in feite het gemak van prestaties en de korte tijd die nodig is om iPSCs te verkrijgen. Bovendien, de methode vermijdt cellulaire afweermechanismen en het gebruik van virale vectoren, verantwoordelijk voor relevante kwesties.
Met betrekking tot het standaardprotocol werden de volgende wijzigingen aangebracht: (1) confluente fibroblasten werden gesynchroniseerd bij passage 4 door in 0,1% serum te plaatsen voor 48 h vóór de trypsinoisatie; (2) de cellulaire dichtheid voor cultuur en het volume van de reagentia werden aangepast voor het gebruik op een 24-Well multi-well plaat in plaats van een 6-well plaat; (3) het herprogrammeeringsexperiment werd uitgevoerd met een 5% CO2 -incubator in plaats van een incubator met atmosferische (21% o2) of hypoxische (5% o2) condities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De specimens uit menselijk weefsel werden verzameld volgens de verklaring van Helsinki met inachtneming van de richtlijnen van het universitair ziekenhuis Federico II. Alle bij deze studie betrokken patiënten hebben schriftelijke toestemming gegeven.
1. voorbereiding van benodigdheden en kweek media
- Reinig en autoclaaf een groot paar chirurgische schaar, twee sets van fijne Tang, twee paren van microdissecting schaar, 1 L steriele fles, 500 mL steriele fles, en een 250 mL steriele fles.
- Bereid 100 mm platen, 60 mm platen, 35 mm platen, wegwerp scalpels, 50 mL steriele buizen, 15 mL steriele buizen en een 100 mm glasplaat. Bewaar instrumenten onder steriele omstandigheden totdat ze klaar zijn voor gebruik.
- Reinig en steriliseren 22 mm x 22 mm afdek glazen voor gebruik. Plaats hiervoor de afdek glazen in een glasplaat, dek ze af met 70% ethanol en wacht een paar seconden voordat u de ethanol opzuigen. Laat de afdek glazen drogen in een oven van 37 °C en vervolgens autoclaaf.
- Bereid 1 L van de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hank bij pH 7,4 door de in de handel verkrijgbare poeder zouten in dubbel gedistilleerd steriel water op te lossen en 0,35 g natriumbicarbonaat toe te voegen. Steriliseren door filtratie onder een steriele kap en bewaren bij + 4 °C tot het gebruik.
- Bereid 500 mL steriele 1x fosfaat-gebufferde-zoutoplossing (PBS) door 0,1 g kalium fosfaat monobasisch, 0,1 g kaliumchloride, 4,0 g natriumchloride en 0,575 g natriumfosfaatdibasisch in steriel dubbel gedestilleerd water op te lossen. Controleer de pH-waarde (7,4) en steriliseren onder een steriele kap door filtratie. Bewaren bij + 4 °C tot gebruik.
- Bereid 50 mL trypsine stop Solution (TSS) door 5 mL 10% foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 45 mL HBSS onder een steriele kap. Bewaren bij + 4 °C tot gebruik.
- Bereid de Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium voor fibroblast isolatie (I-DMEM) met behulp van 250 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 0,5% penicillaire en streptomycine (pen/STREP) onder een steriele kap. Bewaren bij + 4 °C tot gebruik.
- Bereid de DMEM voor de synchronisatie van fibroblasten (S-DMEM) met behulp van 250 mL DMEM aangevuld met 0,1% FBS en 0,5% pen/STREP onder een steriele kap. Bewaren bij + 4 °C tot gebruik.
2. isolatie van menselijke huid fibroblasten
Opmerking: de onderstaande stappen 2,1 tot 2,3 moeten worden uitgevoerd onder een steriele kap. Een cilindrisch monster dat ongeveer 0,8 cm in diameter meet, levert 2 x 106 fibroblasten op doorgang 1.
- Was het vers verkregen monster van de menselijke huid uit de buik in een schaal van 100 mm met HBSS-oplossing. Schud voorzichtig om bloed en andere biologische vloeistoffen te verwijderen. Herhaal de stap drie keer, het veranderen van de HBSS-oplossing en de plaat bij elke wasbeurt.
- Plaats het monster in een 100 mm plaat, verwijder het haar en vet met behulp van fijne Tang en schaar, en ontleden het met een scalpel om 2 mm x 1 mm fragmenten te verkrijgen (voor in totaal 16 fragmenten), Vermijd littekens, vuil (bijv. als gevolg van tekeningen met dermografische pen) of verbrande gebieden van het weefsel.
- Plaats 4 kleine fragmenten in elke 35 mm schaal, bedek met een steriel 22 mm x 22 mm afdekglas. Aanpassen door middel van fijne Tang. Voeg 1,5 mL I-DMEM toe.
- Inincuberen de platen bij 37 ° c in 5% CO2 gedurende ongeveer 15 dagen of totdat cellen 85% samenloop bereiken. Verander het kweekmedium elke 3 dagen en controleer de uitgroei van cellen met een omgekeerde fase-contrast Microscoop dagelijks.
3. uitbreiding van de fibroblasten van de menselijke huid
Opmerking: de hieronder aangegeven stappen moeten worden uitgevoerd onder een steriele kap, met uitzondering van de stappen die in de incubator worden uitgevoerd.
- Til de afdek glazen op met een fijne Tang, plaats ze ondersteboven in een 1 100 mm-schaal en was met 1x steriele PBS.
- Verwijder fragmenten van de monsters en gooi ze weg, was de platen met 1x steriele PBS.
- Verwijder 1x PBS en voeg 3 mL en 1 mL trypsine-EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur) toe om glazen te bedekken die zijn geplaatst in de schaal van 100 mm en de gerechten van 35 mm. Inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C met 5% CO2.
- Blokkeer de trypsinisatie door 5 mL TSS toe te voegen aan de 100 mm schaal en 2 mL TSS aan elke 35 mm schaal. Vang de suspensie op in 15 mL steriele buisjes, centrifugeer op 400 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten.
- Zuig de supernatant op en relaat de pellet in 12 mL I-DMEM. Splits de celsuspensie op in 3 mL aliquots voor elke 60 mm plaat.
- Inincuberen bij 37 °C met 5% CO2. Verander het medium dagelijks. Houd cellen in cultuur totdat ze een samenvloeiing van 75% bereiken.
- Aspirate het medium van de platen en spoel snel in 1x PBS.
- Herhaal trypsinoisatie (stappen 3,3 en 3,4) driemaal om cellen te verkrijgen bij passage 4. Gebruik 1,5 mL trypsine-EDTA en 3 mL TSS in elke 60 mm schaal. Splits de cellen 1:3.
- Synchroniseer de cellen door het vervangen van de I-DMEM met S-DMEM en inincuberen voor 48 h bij 37 °C met 5% CO2.
- Bereid de volgende (tijdens de synchronisatie van de cel).
- Bereid fibroblast-expansie medium door 5,0 mL FBS en 0,5 mL L-glutamine toe te voegen aan 44,5 mL Advanced DMEM (A-DMEM), bewaren bij + 4 °C.
- Bereid totaal NM-RNA-herprogrammeerbaar cocktail voor voor fibroblast-herprogrammering door het volgende te combineren in elk van de 9 steriele RNase-vrije buizen: 32 μL OSKMNL NM-RNA, 24 μL van EKB NM-RNA, 5,6 μL van NM-microRNAs (61,6 μL eindvolume voor 9 aliquots).
- Verdeel elke buis van 61,6 μL totaal NM-RNA-Herprogrammeerbare cocktail voor fibroblast herprogrammering in vier 15,4 μL enkelvoudige aliquots in steriele, RNase vrije buizen en bewaar bij-80 °C (15,4 μL eindvolume voor 36 aliquots).
4. herprogrammering van dermale fibroblasten aan iPSCs
- Dag 0: Celseeding
Opmerking: de stappen 4.1.1 tot en met 4.1.3 en 4.1.8 tot en met 4.1.9 moeten worden uitgevoerd onder een steriele kap. Kelder membraan matrix (BMM) gels snel bij kamertemperatuur. Daarom wordt het sterk aanbevolen om BMM 's nachts op ijs in een koelkast te ontdooien, het met ijskoud serumvrij medium te verdunnen en voorgekoelde pipets, tips en tubes te gebruiken.- Maak een 24-put plaat met een coating van elk goed met 100 μL BMM en inincuberen gedurende ten minste 1 uur bij 37 °c voordat de cellen worden zaaien.
- Aspireren het medium van platen met cellen in cultuur en snel wassen in 1x PBS.
- Herhaal trypsinisatie (stappen 3,3 en 3,4) om cellen bij passage 5 te verkrijgen. Zuig de supernatant op en hervat de pellet in een geschikte hoeveelheid fibroblasten expansie medium (zie stap 3,10).
- Bereid en reinig de hemocytometer met 70% alcohol.
- Bereid een oplossing voor door zachtjes 10 μl trypaan blauw en 10 μL celsuspensie in een buis van 1,5 mL te mengen en gedurende 1 – 2 minuten bij kamertemperatuur in te brokkelen. Let op dat u niet langer dan 5 minuten inbroor.
- Pipetteer 10 μL van de oplossing in de hemocytometer plaats het op het podium van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop om te tellen. Niet-levensvatbare cellen zullen blauw zijn, terwijl levensvatbare cellen onbevlekt zullen zijn.
- Tel de cellen in ten minste 2 kwadraten van de hemocytometer kamer. Pas de volgende berekening toe om het totale aantal cellen te verkrijgen:
totaal aantal cellen = (totaal aantal getelde cellen/vierkant getal) x 2 x 10 x totaal volume van celsuspensie - Voer een verdunning uit om een dichtheid van 2,5 x 104 cellen per 500 μL fibroblasten expansie medium te verkrijgen, op basis van het totale aantal getelde cellen. Respendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid fibroblasten expansie medium.
- Pipetteer 500 μL van de celsuspensie in elke put van de 24-pits plaat. Incuberen de cellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Dag 1: transfectie
Opmerking: alle werkoppervlakken en benodigdheden (bijv. handschoenen, flessen, steriele motorkap, pipettors) moeten worden gereinigd met reinigings reagens voor het verwijderen van RNase voordat de procedure wordt gestart. Voer de stappen 4.2.2, 4.2.4 – 4.2.8 uit onder een steriele kap.- Opwarmen xeno-gratis, serumvrij, lage groeifactor humaan ESC/iPSC-kweekmedium (XF/FF-kweekmedium) in een waterbad van 37 °C.
- Verwijder het oude medium van elke put en vervang het door 500 μL vooraf opgewarmd XF/FF-kweekmedium.
- Inincuberen bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende ten minste 6 uur.
- Ontdooien vijf 15,4 μL aliquots van totaal NM-RNA Herprogrammeerbare cocktail bij kamertemperatuur en plaats het op ijs.
- Voeg 234,6 μL verlaagd serum medium toe aan elk aliquot, Pipetteer 3 – 5 keer zachtjes en label elk als buis A (RNA + gereduceerd-serum medium).
- Label 5 steriele, RNase-vrije 0,5 ml buizen als buis B en meng 6 μL synthetisch siRNA transfectiereagens met 244 μL verlaagd serum medium (RNA-transfectie reagens + gereduceerd-serum medium).
- Voeg de inhoud van elke buis B toe aan een buis met een druppelsgewijs (om 500 μL eindvolume nm-RNA transfectie complexe oplossing te verkrijgen). Meng door op de onderkant van de buis te tikken. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg 125 μl nm-RNA-transfectie complexe oplossing toe van elk van de vijf aliquots van 500 μL tot 4 putjes (om in totaal 20 putjes te bereiken), kantel de plaat en Pipetteer druppelsgewijs in het medium. Meng door zachtjes te schommelen. Gebruik de resterende 4 Wells als referentie.
- Incuberen gedurende 15 uur bij 37 °C, 5% CO2.
- Dag 2 – 4: Voltooi de Transfectie
- Aspirate het medium. Herhaal de transfectie procedure op dag 1 onder de steriele motorkap.
- Dag 5 – 10: media wijzigingen
- Aspirate het medium en de uitwisseling met verse, pre-warmed XF/FF cultuurmedium onder een steriele kap.
- Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO2.
- Houd in cultuur tot het observeren van de vorming van iPSC kolonies controle dagelijks door een fase-contrast Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het protocol was om dermale fibroblasten die geïsoleerd waren van de buikhuid te herprogrammeren met behulp van niet-integrerende herprogrammeer methode op basis van NM-Rna's om de expressie van specifieke factoren te induceren. Om dit doel te bereiken, werden menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd van huid specimens van patiënten die een buik Tuck-operatie ondergingen en werden ipscs gegenereerd met introductie van Oct4, Sox2, Klf4, cmyc, nanog, Lin28 herprogrammeer factoren en E3-, K3-, b18-immuunontduiking factoren door een commerciële kant-en-klare herprogrammeerset die nm-RNA De tijdlijn van het protocol wordt samengevat in Figuur 1.
Menselijke fibroblasten groeiden uit van monsters van de buikhuid binnen een week van de cultuur (Figuur 2A) en bereikten 85% samenvloeiing binnen twee weken (Figuur 2B). Cellen werden gekenmerkt door lijm groei op kunststof cultuur gerechten en hun morfologie varieerden van langwerpige en spindel vormig (Figuur 2C) tot afgevlakt en stervormig (Figuur 2D). De morfologie en opstelling van fibroblast in cultuur veranderde drastisch na zaaien op BMM, toen ze een langwerpige morfologie verworven en gearrangeerd om dunne vertakte structuren te vormen (Figuur 3A). Kleine kolonies waren al zichtbaar in de cultuur op dag 1 van de eerste transfectie (Figuur 3B) en hun grootte groeide geleidelijk, terwijl hun aantal steeg tot dag 7 en vervolgens stabiel bleef tussen dag 7 en dag 14 (Figuur 3C, D), waarschijnlijk als gevolg van kleinere kolonies samenvoegen om grotere kolonies te vormen.
Aangezien de herprogrammatie procedure wordt uitgevoerd met behulp van antibiotica vrije media, is microbiële besmetting een belangrijk probleem en kan deze optreden (Figuur 4) indienster iele omstandigheden niet worden gegarandeerd, standaardprocedures om verontreiniging te voorkomen (bijv. het dragen van handschoenen, verwijderen van stof uit alle oppervlakken, reinigen van alle oppervlakken en apparatuur met 70% ethanol, Vermijd praten tijdens stappen met
Figuur 1: protocol tijdlijn. Tijdlijn van isolatie en herprogrammering van menselijke fibroblasten uit de buikhuid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: isolatie en cultuur van dermale fibroblasten. Representatieve beelden van fibroblasten uitgroei uit de huid fragmenten (A). Fibroblasten bereikten samenvloeiing in ongeveer 14 dagen (B) en toonden spil vormig (C) en stervormig (D) fenotype. Huid fragmenten worden aangegeven door een witte ster. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: huid fibroblast herprogrammering progressie. Cellen die op BMM zijn geseerd toonden een duidelijke verandering in de opstelling en morfologie (a). Kleine kolonies van iPSCs gevormd al 24 h na de eerste transfectie (B) en hun grootte steeg progressief op dag 7 (C), en 14 (D), terwijl hun aantal steeg tussen dag 1 en dag 7, maar bleef stabiel tussen dag 7 en 14 van de eerste transfectie. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: microbiële besmetting tijdens de herprogrammatie procedure. Representatieve afbeelding met behulp van fase contrast microscopie die een microbiële besmetting van de fibroblasten cultuur vertoont tijdens de herprogrammatie procedure. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ipscs zijn snel opkomende als de meest veelbelovende cel kandidaat voor regeneratieve geneeskunde toepassingen en als een enorm nuttig instrument voor ziekte modellering en drug testing3,8. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de generatie van menselijke iPSCs van een monster met de grootte van een huid Punch biopsie met een eenvoudige en efficiënte procedure die geen specifieke apparatuur of eerdere ervaring met herprogrammering technologie vereist.
Het is van primair belang om fibroblast-isolatie en-cultuur te optimaliseren om de kans op succes te vergroten, omdat plating dichtheid en proliferatie de doeltreffendheid van herprogrammering beïnvloeden. Verder is onlangs gemeld dat dermale fibroblasten anders reageren op herprogrammeer technologie en dat, in het bijzonder, fibroblasten die geïsoleerd zijn van de huid van de abdominale regio gemakkelijker en gemakkelijk worden geherprogrammeerd dan dermale fibroblasten geïsoleerd van andere lichaamsgebieden18. Daarom is het belangrijk om de somatische cellen nauwkeurig te selecteren om te herprogrammeren en de plating dichtheid te definiëren op basis van het celproliferatie percentage. Met dit doel, het huidige protocol geeft ook instructies over hoe te isoleren van de dermale fibroblasten uit de buikhuid en hoe ze te propageren in vitro om te verlichten en versnellen van de procedure.
Voorafgaand aan herprogrammering werden fibroblasten doorgegeven om passage 5 te bereiken om het celgeheugen te wissen18 en te voldoen aan het gerapporteerde bewijs dat de afdraaien de inductie van pluripotente staat19kon versnellen. Bovendien, volgens onze ervaring, fibroblasten in cultuur vertonen variabele proliferatieve eigenschappen, dus hebben we het protocol gewijzigd door een extra stap te introduceren om fibroblasten te synchroniseren en de variabiliteit in de celpopulatie te verminderen.
Met behulp van een commerciële nm-RNAS-Kit die een combinatie introduceert van herprogrammeer factoren die voortvloeien uit de aanpak van Yamanaka en Thomson5,6, samen met Mirna waarvan is bewezen dat het mRNA-gebaseerde herprogrammering20verbetert, kunnen menselijke dermale fibroblasten met succes worden geherprogrammeerd naar IPSC en worden kleine kolonies al 24 uur na de eerste transfectie zichtbaar. De belangrijkste voordelen van mRNA-gebaseerde herprogrammering zijn inderdaad de vroege opkomst van kolonies, zelfs wanneer een laag aantal cellen wordt geherprogrammeerd20 samen met een zeer lage aneuploïdie rate en de volledige afwezigheid van integratie die ipscs gegenereerd met deze methode veilig voor een gebruik in regeneratieve geneeskunde. Bovendien levert de commerciële Kit die voor dit protocol wordt gebruikt, immunomodulerende factoren waarvan bekend is dat ze de efficiëntie van herprogrammering verbeteren door de celdood te voorkomen die wordt veroorzaakt door cytotoxische en immunogene nm-RNAS21,22.
Hoewel de kit die wordt gebruikt voor herprogrammering is ontworpen voor 6-well multi-well plaat, hebben we de cellulaire dichtheid geoptimaliseerd en het volume van de reagentia aangepast voor het gebruik op een 24-Well multi-well plaat om het protocol effectief te maken voor het opwekken van menselijke iPSCs van een huid Punch biopsie. Bovendien, hoewel als de noodzaak van een weefselkweek incubator met O2 controle wordt gerapporteerd door verschillende auteurs20,23 en aanbevolen door de fabrikant van de kit, volgens het hier beschreven protocol, hebben we de menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid in een standaard 5% Co2 -incubator geherprogrammeerd. Daarom kan de procedure worden uitgevoerd in elk celcultuurlaboratorium zonder de noodzaak van atmosferische (21% o2) of hypoxische (5% o2) cultuuromstandigheden, hoewel deze de herprogrammering van de efficiëntie24,25verder kunnen verbeteren.
Niettemin gebruikten we niet-humane dierlijke reagentia om te worden afgeleid van kleine huid monsters iPSCs die voor onderzoeksdoeleinden kunnen worden gebruikt. Hoewel de meest aantrekkelijke toepassing is voor de regeneratie van weefsels en organen, ipscs zijn gebruikt voor het modelleren van verschillende ziekten en vervolgens beide onderzoeken op onderliggende moleculaire mechanismen en ontwikkelen van specifieke geneesmiddelen en therapieën3,26.
Opmerkelijk, door het vervangen van dierlijke reagentia voor geschikte xeno-vrije reagentia, maakt hetzelfde protocol het herprogrammeren van volwassen menselijke fibroblasten in iPSCs mogelijk in een volledige xeno-vrije cultuur omgeving die hun klinisch gebruik rechtvaardigt.
Er moet echter rekening worden gehouden met de zware werklast. Naar onze mening is het van cruciaal belang om het experiment goed van tevoren te plannen, inclusief stappen die tijdens het weekend moeten worden uitgevoerd, en om alle transfectie-reagentia te bereiden tijdens de synchronisatie stap. Inderdaad, transfectie moet elke dag worden uitgevoerd voor vier dagen en, daarna, cellen moeten worden gecontroleerd elke dag en het medium moet worden vervangen op een dagelijkse basis.
Bovendien kan de nauwkeurige identificatie van iPSC-kolonies niet uitsluitend gebaseerd zijn op morfologische criteria. Vandaar, nieuw afgeleide iPSCs moeten worden gekarakteriseerd op zoek naar de uitdrukking van meerdere pluripotente markers door middel van cellulaire en moleculaire analyses. Algemeen aanvaarde markers zijn onder andere NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 en SSEA4, die kunnen worden geïdentificeerd door immunocytochemische analyse en door genexpressie analyse met behulp van semi-kwantitatieve of kwantitatieve RT-PCR. Aangezien de activiteit van alkalische fosfatase is aangetoond dat het upregulated is in pluripotente stamcellen, kan de opsporing van dergelijke enzymatische activiteit gemakkelijk worden uitgevoerd om ipscs te identificeren en het optreden van herprogrammering te controleren27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkentelings.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
