Summary
מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.
Abstract
כתוצאה מפגיעה בתאי גזע (iPSCs) יכולה להיחשב, עד היום, מקור מבטיח של תאים בעלי עוצמה לניהול המחלות הבלתי ניתן לטיפול כרגע, עבור החוקה והתחדשות של רקמות פצועות ולפיתוח תרופות חדשות. למרות כל היתרונות הנוגעים לשימוש ב-iPSCs, כגון הסיכון הנמוך של דחייה, הסוגיות האתיות ההפדלות, והאפשרות להשיג אותם מחולים צעירים וישנים ללא כל הבדל בפוטנציאל התכנות שלהם, בעיות להתגבר על הם עדיין רבים. למעשה, תא מתכנות שנערך עם ויראלי ושילוב וירוסים יכול לגרום לזיהומים המבוא של גנים נדרשים יכול לגרום לחוסר יציבות גנומית של תא הנמען, פגיעה בשימוש שלהם במרפאה. בפרט, יש חששות רבים לגבי השימוש ב-c-Myc גן, ידוע מספר מחקרים לפעילות מוטציה שלה ממריץ. פיברותקיעות התפתחה כאוכלוסיית התא המתאים לתיכנות מחודש של הסלולר כפי שהם קל לבודד את התרבות, הם נקצרו על ידי ניקוב העור פולשנית מינימלית. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של ההליך כולו, מעיבוד לדוגמה כדי להשיג תרביות תאים, בחירת ריאגנטים ואספקה, ניקוי והכנה, לתא התיכנות מראש על ידי האמצעים של מסחרי ערכת הניתנת לתיכנות מבוססת RNAs (NM-RNAs) שאינה משתנה. הערכה הניתנת לתיכנות מראש מאפשר התכנות מראש יעיל של האדם העור פיברוהפיצוץ כדי iPSCs ומושבות קטנות ניתן לראות מוקדם ככל 24 h לאחר העברה הראשון, גם עם שינויים עם הכבוד לגליון הנתונים הרגיל. הליך התיכנות מחודש המשמש בפרוטוקול זה מציע את היתרון של בטוח תכנות מחודש, ללא הסיכון של זיהומים הנגרמים על ידי נגיפי שיטות וקטורים מבוססי, מפחית את מנגנוני ההגנה הסלולרית, ומאפשר את הדור של xeno iPSCs חינם, כל תכונות קריטיות הכרחיות עבור יישומים קליניים נוספים.
Introduction
תכנות התא מייצג טכנולוגיה חדשנית להפוך כל תא הסומטיים של הגוף לתוך תא גזע pluripotent המכונה iPSC1. האפשרות לתיכנות מחודש של תא סומטיים למבוגרים בחזרה למצב pluripotent מובחן יש להתגבר על המגבלות המוטלות על ידי זמינות העניים וסוגיות אתיות הקשורות לשימוש בתאי pluriפוטנטי, בעבר רק ללעג של עוברי אדם (תאי גזע עובריים או ESC)2,3,4. בשנת 2006, Kazutoshi טקהאשי ושינייה יאמאנאקה ערכו מחקר חלוצי השגת ההמרה הראשונה של תאים סומטיים בוגרים מהעור לתאים בעלי עוצמה מלאכותית על ידי הוספת ארבעה גנים ספציפיים (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. שנה לאחר מכן, העבודה שנערכה במעבדה של תומסון הובילה לתכנות מחדש של תאים סומטיים לתוך iPSCs על ידי התמרה של שילוב שונה של ארבעה גנים (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs מציעים מספר הזדמנויות למדענים וחוקרים של תחומים שונים, כגון רפואה רגנרטיבית ופרמקולוגיה, להיות פלטפורמה מצוינת ללמוד ולטפל במחלות שונות יחד עם השתקפות genotypic של המאפיינים של המטופל שהם נגזר. השימוש ב iPSCs מספק מספר יתרונות כולל: סיכון מופחת לתגובה חיסונית בשל מקור אוטוולוגי לחלוטין של תאים; האפשרות של יצירת ספריית תאים, כלי חשוב כדי לנבא את התגובה לתרופות חדשות ואת תופעות הלוואי שלהם, כפי שהם מסוגלים ברציפות לחדש את עצמי וליצור סוגי תאים שונים; וההזדמנות לפתח גישה מותאמת אישית. למנהל התרופות7,8,9
טכניקות מגוונות ידועות כיום, כדי לגרום לביטוי של גורמי תכנות משנה והם נכללים בשתי קטגוריות עיקריות: שיטות וקטוריות שאינן ויראליות ונגיפי10,11,12,13. שיטות שאינן ויראליות כוללות העברה של mrna, זיהום/העברה, העברה, מיני וקטורים ו אפיזומיום ואקזומים10,11,12,13. שיטות המבוססות על ויראלי כוללות וירוסים שאינם משתלבים, כגון אדנווירוס, וירוס סנדאי וחלבונים, ושילוב וירוסים כמו רטרווירוס ו-וירוס10,11,12,13.
לדברי מספר מחקרים, אין הבדלים משמעותיים הבחין בין שיטות אלה במונחים של יעילות של תא מתיכנות מראש, ומכאן, הבחירה של השיטה המתאימה תלוי לחלוטין בסוג התא המשמש וביישומים הבאים של iPSCs שהתקבלו14,15. כל השיטות שהוזכרו להראות חסרונות, למשל, וירוס סנדאי הוא יעיל בכל סוגי התאים, אבל דורש הרבה מעברים כדי להשיג iPSCs; מתכנות מראש על ידי אפיזומים מצוין עבור תאי דם, אבל צריך שינוי של תנאי התרבות הסטנדרטיים לפיברופיצוצים; השיטה מסוגלת לייצג חלופה אטרקטיבית אך מחקרים בתאי האדם עדיין מוגבלים וחלשים10,11,12,13. אקסוזומים הם ננו-שלפוחית פיזיולוגית המופרש לתוך נוזלי הגוף בתאים. לפי המחקרים האחרונים, הם אחראים לתקשורת בין-תאית ויכולים להיות בעלי תפקיד בתהליכים ביולוגיים חשובים, כגון הפצת תאים, הגירה ובידול. אקסוזומים יכול להעביר ולהעביר mRNA ו miRNA לתאי הנמען עם מנגנון טבעי לחלוטין, כפי שהם חולקים את הרכב זהה של קרום התא16. לכן, האקסוזומים היא טכניקת הדור החדש והמבטיח לתכנות, אך הפוטנציאל שלהם לתכנות מיתכנת תאים סומטיים על-ידי תוכנם עדיין נמצא בחקירה. ויראלי וקטורים מבוססי שיטות להשתמש וירוסים שונה כדי להעביר גנים מתיכנות לתאי הנמען. טכניקה זו, למרות היעילות הגבוהה של תכנות מראש, אינו נחשב בטוח, כמו שילוב של הנגיף בתוך התא יכול להיות אחראי על זיהום, teratomas ויציבות גנומית17.
הפרוטוקול הבא כדי לייצר מושבות iPSCs משלבת את הקוקטייל התכנות של יאמאנאקה ו תומפסון והוא מבוסס על השימוש בשיטה הדורשת NM-RNAs וגורמי התחמקות החיסונית עם האפשרות לבצע את זה בתנאי xeno-חינם. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא להתפשט, בתוך הקהילה המדעית, פרוטוקול המאפשר תכנות מהיר, פשוט, יעיל מאוד של העור האנושי מפני הבטן לתוך iPSCs18.
היתרונות של השיטה המוצעת הם, למעשה, את קלות הביצועים ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג iPSCs. יתרה מזאת, השיטה נמנעת ממנגנוני הגנה סלולאריים והשימוש בווקטורים ויראליות, האחראים לסוגיות רלוונטיות.
ביחס לפרוטוקול הסטנדרטי, נעשו השינויים הבאים: (1) פיברולזציה שוטפת סונכרנו במעבר 4 על ידי הצבת ב 0.1% סרום עבור 48 h לפני הטריסינוניזציה; (2) הצפיפות התאית לתרבות ולנפח של ריאגנטים הותאמו לניצול על צלחת מרובת היטב של 24 שעות במקום צלחת של 6 היטב; (3) ניסוי תכנות מחודש בוצע באמצעות אינקובטור 5% CO2 במקום אינקובטור עם אטמוספרית (21% o2) או ארוי (5% o2) תנאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הדגימות מרקמת האדם נאספו על פי הצהרת הלסינקי תוך התבוננות בבית החולים האוניברסיטאי פדריקו II הנחיות. כל המטופלים המעורבים במחקר זה סיפק הסכמה בכתב.
1. הכנת אספקה ומדיית תרבות
- נקי ומאוטוקלב זוג אחד גדול של מספריים כירורגית, שתי סטים של מלקחיים עדינים, שני זוגות של מספריים מיקרובתר, 1 בקבוק סטרילי, 500 mL בקבוק סטרילי, ו 250 mL בקבוק סטרילי.
- להכין 100 מ"מ לוחות, 60 מ"מ לוחות, 35 מ"מ צלחות, מנתחים חד פעמיים, 50 mL סטרילי צינורות, 15 מ ל צינורות סטרילי, ו-100 לוחית זכוכית. אחסן מכשירים תחת תנאים סטריליים עד לצורך שימוש.
- ניקוי וחטא 22 מ"מ x 22 מ"מ לכסות משקפיים לפני השימוש. עבור זה, מקום לכסות משקפיים בצלחת זכוכית, לכסות אותם עם 70% אתנול ולחכות כמה שניות לפני מנושמת אתנול. בואו לכסות משקפיים יבשים בתנור ב 37 ° c ולאחר מכן לאחר מכן החיטוי אותם.
- להכין 1 L של האנק של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) ב-pH 7.4 על ידי המסת מלחים אבקת מסחרית זמין במים כפולים מזוקקים והוסיף 0.35 g של נתרן ביקרבונט. לעקר על ידי סינון תחת מכסה סטרילי ולאחסן ב + 4 ° צ' עד השימוש.
- להכין 500 mL של סטרילי 1x פוספט מאגור-תמיסת מלח (PBS) על ידי המסת 0.1 g של אשלגן פוספט חד-בסיסי, 0.1 g של אשלגן כלוריד, 4.0 g של נתרן כלוריד ו-a 0.575 g של נתרן פוספט dibasic במים סטרילי כפול מזוקקים. בדוק את ערך ה-pH (7.4) וחטא תחת מכסה סטרילי על ידי סינון. החנות ב + 4 ° צ' עד השימוש.
- הכינו 50 mL של טריפסין להפסיק פתרון (TSS) על ידי הוספת 5 מ ל של 10% סרום העובר העוברי (FBS) כדי 45 mL של HBSS תחת מכסה סטרילי. החנות ב + 4 ° צ' עד השימוש.
- הכינו את מדיום הנשר השונה של Dulbecco לבידוד פיברוהפיצוץ (I-Dמאמ) באמצעות 250 mL של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% FBS ו 0.5% פניצילין ו סטרפטומיצין (עט/דלקת) תחת מכסה סטרילי. החנות ב + 4 ° צ' עד השימוש.
- הכן את DMEM לסנכרון באמצעות 250 mL של DMEM בתוספת 0.1% FBS ו 0.5% עט/דלקת תחת מכסה סטרילי. החנות ב + 4 ° צ' עד השימוש.
2. בידוד של האדם העורי פיברותקיעות
הערה: שלבים 2.1 עד 2.3 המדווחים להלן חייבים להתבצע תחת מכסה סטרילי. דגם גלילי מדידה כ 0.8 ס מ בתשואות קוטר 2 x 106 פיברותקיעות במעבר 1.
- רוחצים את המדגם הטרי של העור האנושי מהבטן בצלחת 100 מ"מ עם פתרון HBSS. ללחוץ בעדינות כדי להסיר דם ונוזלים ביולוגיים אחרים. חזור על השלב שלוש פעמים, שינוי הפתרון HBSS ואת הצלחת בכל כביסה.
- מניחים את המדגם בצלחת 100 מ"מ, להסיר שיער ושומן באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, ולנתח אותו עם אזמל להשיג 2 מ"מ x 1 שברי מילימטר (עבור סך של 16 שברים) הימנעות צלקות, מלוכלך (למשל, כתוצאה מציורים עם העט dermographic) או אזורים שרפו של הרקמה.
- מניחים 4 שברים קטנים בכל מנה 35 מ"מ, כיסוי עם זכוכית סטרילית 22 מ"מ x 22 מ"מ לכסות. כוונן על-ידי האמצעים של מלקחיים עדינים. הוסף 1.5 mL של I-DMEM.
- מודיית את הצלחות ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור כ 15 ימים או עד תאים להגיע 85% המפגש. לשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים ולבדוק את הצמיחה של התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך מפני הפאזה מדי יום.
3. התרחבות של פיברוהכדורים לעור האדם
הערה: יש לבצע את השלבים המדווחים להלן תחת כיסוי סטרילי, למעט השלבים שבוצעו בחממה.
- הרם את משקפי הכיסוי עם מלקחיים עדינים, למקם אותם הפוך-למטה ב 1 100 מ"מ צלחת ולשטוף עם 1 x מעוקר PBS.
- הסר קטעים של דגימות ולמחוק אותם, לשטוף את הצלחות עם 1x מעוקר PBS.
- הסר 1x PBS והוסף 3 מ ל ו 1 מ ל טריפסין-EDTA (Ethylenediamאצטט חומצה) כדי לכסות משקפיים ממוקם בצלחת 100 mm ו 35 mm מנות, בהתאמה. מודטה עבור 5 דקות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- לחסום את הטריסיזציה על ידי הוספת 5 מ ל של TSS לצלחת 100 מ"מ ו 2 מ ל של TSS כדי כל הצלחת 35 mm. לאסוף את ההשעיה לתוך 15 מ"ל שפופרות סטרילי, צנטריפוגה ב 400 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.
- ומשהה את הגלולה ב -12 מ ל. של הזיכרון העצמי לפצל את השעיית התא לתוך 3 mL שלוש מילימטר עבור כל צלחת 60 מ"מ.
- מודטה ב 37 ° צ' עם 5% CO2. שנה את המדיום מדי יום. שמרו על תאים בתרבות עד שיגיעו למפגש של 75%.
- מביסה את המדיום מהלוחות ומכבסת במהירות 1x PBS.
- חזור על טריסיזציה (שלבים 3.3 ו-3.4) שלוש פעמים כדי להשיג תאים במעבר 4. השתמש ב-1.5 mL של טריפסין-EDTA ו-3 מ ל של TSS בכל מנה 60 מ"מ. . פצל את התאים 1:3
- לסנכרן את התאים על ידי החלפת ה-I-DMEM עם S-DMEM ו הדגירה עבור 48 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- הכן את הפרטים הבאים (במהלך סינכרון התא).
- הכנת פיברובלסט בינונית הרחבה על ידי הוספת 5.0 mL של FBS ו 0.5 mL של L-גלוטמין ל 44.5 mL של DMEM מתקדם (A-DMEM), החנות ב + 4 ° c.
- הכנת הכולל NM-RNA-רנ א קוקטייל עבור פיברומאטור מתכנות על ידי שילוב הבאים בכל אחד 9 RNase סטרילי-שפופרות חינם: 32 μL של OSKMNL NM-RNA, 24 μL של EKB NM-RNA, 5.6 μL של NM-microRNAs (61.6 μL האחרון נפח עבור 9 שעות).
- לחלק כל שפופרת של 61.6 μL של סה כ NM-RNA-תכנות משני קוקטיילים עבור פיברוהפיצוץ לתוך ארבעה 15.4 μL לשימוש יחיד ali, בצינורות סטרילי, RNase-חינם ולאחסן ב-80 ° צ' (15.4 כמות סופית של μL עבור 36 ali,).
4. תיכנות מראש של פיברוהכדורים לiPSCs
- יום 0: זריעת תאים
הערה: שלבים ה4.1.1 ל4.1.3 ו4.1.8 ל4.1.9 חייבים להתבצע תחת מכסה סטרילי. מטריצת קרום המרתף (BMM) ג'ל במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, מומלץ מאוד להפשיר BMM לילה על הקרח במקרר, לדלל אותו עם הקרח קר ללא סרום בינוני ולהשתמש מקורר מקרר, טיפים, וצינורות.- הכינו צלחת 24-באר על-ידי ציפוי כל טוב עם 100 μL של BMM ו-דגירה עבור לפחות 1 h ב 37 ° צ' לפני זריעת התאים.
- מתיף את המדיום מצלחות עם תאים בתרבות ולשטוף במהירות 1x PBS.
- חזור על טריסיוניזציה (שלבים 3.3 ו-3.4) כדי להשיג תאים במעבר 5. מנושף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של אמצעי הרחבה לפיברותקיעות (ראה שלב 3.10).
- הכינו ונקו את הדימום עם 70% אלכוהול.
- להכין פתרון על ידי ערבוב בעדינות 10 μl של טריפי כחול 10 μL של השעיית התא ב 1.5 mL שפופרת, ו דגירה עבור 1 – 2 דקות בטמפרטורת החדר. להיזהר לא הדגירה יותר מ 5 דקות.
- הפיפטה 10 μL של הפתרון לתוך מקום ההאבל על הבמה הפוכה בשלב מיקרוסקופ ניגודיות השלב לספור. תאים לא קיימא יהיה כחול, בעוד תאים קיימא יהיה בלתי מוכתם.
- לספור את התאים בלפחות 2 ריבועים של החדר המוציטומטר. החל את החישוב הבא כדי לקבל את המספר הכולל של התאים:
המספר הכולל של תאים = (המספר הכולל של תאים שנספרו/מספר מרובע) x 2 x 10 x נפח כולל של השעיית תא - בצע דילול כדי לקבל צפיפות של 2.5 x 104 תאים לכל 500 μl של בינונית הרחבה פיברותקיעות, בהתבסס על המספר הכולל של תאים שנספרו. השהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של אמצעי הרחבה לפיברותקיעות.
- פיפטה 500 μL של התא מושעה לתוך כל טוב של צלחת 24. התאים הדגירה הלילה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- יום 1: העברה לפני החצייה
הערה: כל משטחי העבודה והאספקה (למשל, כפפות, בקבוקים, משטחי מכסה סטרילי, פיפטורים) יש לנקות עם ניקוי מגיב להסרת RNase לפני תחילת השגרה. בצע שלבים 4.2.2, 4.2.4 – 4.2.8 תחת מכסה סטרילי.- לחמם את xeno-חינם, סרום ללא, גורם גדילה נמוכה האדם ESC/iPSC בינונית תרבות (XF/FF תרבות בינונית) באמבט מים 37 ° c.
- הסר את המדיום הישן מכל באר ולהחליף אותו עם 500 μL של מדיום התרבות טרום מחומם.
- מודטה ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור לפחות 6 h.
- הפשרת חמישה 15.4 μL האלימטים של הכולל של NM-RNA הקוקטייל בטמפרטורת החדר ואז מניחים אותו על הקרח.
- הוסף 234.6 μL של בינוני סרום מופחת לכל aliquot, בעדינות פיפטה 3 – 5 פעמים ולסמן כל אחד כמו צינור A (RNA + מופחת סרום מוקטן ).
- תווית 5 סטרילי, RNase-חינם 0.5 mL צינורות כמו צינור B ו לערבב 6 μl של הדבקה מלאכותית המתכלה עם 244 μl של בינוני סרום מופחת (RNA-transfection זיהום מופחת בינונית סרום).
- הוסף את התוכן של כל צינור B לצינור A dropwise (כדי להשיג 500 μL הסופי של פתרון מורכב של NM-RNA). לערבב על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
- הוסף 125 μL של הפתרון המורכב של NM-RNA מתוך כל אחד מחמשת האליבטים של 500 μL ל -4 בארות (כדי להגיע לסכום של 20 בארות), הטיית הצלחת ופיליטוף לתוך המדיום. מערבבים על ידי נדנדה בעדינות. השתמש בארבע הבארות הנותרות כהפניה.
- דגירה עבור 15 h ב 37 ° צ', 5% CO2.
- יום 2 – 4: להשלים את החצייה
- . מרוב את המדיום חזור על הליך החצייה כמו ביום הראשון תחת המכסה הסטרילי.
- יום 5 – 10: שינויי מדיה
- מתיף את המדיום ולהחליף עם טרי, טרום מחומם מדיום התרבות XF/FF תחת מכסה סטרילי.
- דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2.
- שמור בתרבות עד התבוננות היווצרות של המושבות iPSC הניטור מדי יום על ידי מיקרוסקופ פאזה ניגודיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת הפרוטוקול היתה לתכנת מראש את העור פיברותקיעות מבודדים מהעור הבטן באמצעות שיטה שאינה שילוב שיטת התכנות מבוסס NM-RNAs כדי לגרום לביטוי של גורמים ספציפיים. כדי להשיג מטרה זו, העור האדם פיברותקיעות היו מבודדים מתוך דגימות מהעור של חולים שעברו ניתוח טאק הבטן ו iPSCs נוצרו היכרות Oct4, Sox2, Klf4, cmyc, nanog, Lin28 גורמים מוכנים מראש ו E3, K3, B18 גורמי התחמקות החיסונית על-ידי מסחרי מוכן לשימוש הערכה מראש המערכת ה ציר הזמן של הפרוטוקול מסוכם באיור 1.
מדגמים של עור הבטן בתוך שבוע של תרבות (איור 2א) והגיעו 85% למפגש בתוך שבועיים (איור 2ב). התאים האופיינים בצמיחה דביקה על מנות התרבות הפלסטית והמבנה שלהם מגוון מוארך ובצורת ציר (איור2 ג) לשיטוח ובצורת כוכב (איור 2ד). מורפולוגיה והסדר פיברובלסט בתרבות שונו באופן דרמטי לאחר זריעה ב-BMM, כאשר הם רכשו מבנה מוארך ומסודרים ליצירת מבני מסוקנים דקים (איור 3א). המושבות הקטנות כבר היו גלויות בתרבות ביום 1 מהגלגול הראשון (איור 3ב) וגודלם גדל בהדרגתיות לאורך זמן, בעוד המספר שלהם גדל עד היום 7 ולאחר מכן נשאר יציב בין יום 7 ויום 14 (איור 3ג, ד), כנראה כתוצאה של מושבות קטנות מיזוג ליצור מושבות גדולות יותר.
מאז הליך תכנות משנה מבוצעת באמצעות מדיה ללא אנטיביוטיקה, זיהום מיקרוביאלית היא בעיה מרכזית והיא עלולה להתרחש (איור 4) אם התנאים סטרילי אינם מובטחים אימוץ הליכים סטנדרטיים כדי למנוע זיהום (למשל, לבישת כפפות, להסיר אבק מכל המשטחים, לנקות את כל המשטחים וציוד עם 70% אתנול, להימנע מ
איור 1: ציר זמן של פרוטוקול. הזמן של בידוד ותכנות מראש של האדם העור הבטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בידוד ותרבות של פיברובילי העורי. תמונות מייצגות של הגידול בגידולים משברי העור (א). פיברופיצוצים הגיעו למפגש בעוד כ -14 ימים (ב) והראו בצורת פלך (C) ובצורת כוכב (D) פנוטיפ. שברי העור מסומנים על-ידי כוכב לבן. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התפתחות העור פיברוההדף מתיכנות מתכנות. תאים שנזרע BMM הראו שינוי מסומן בהסדר מורפולוגיה (א). מושבות קטנות של iPSCs נוצר כבר 24 שעות לאחר הגלגול הראשון (ב) וגודל שלהם גדל בהדרגה ביום 7 (ג), ו 14 (ד), בעוד המספר שלהם גדל בין יום 1 ו יום 7 אבל נשאר יציב בין יום 7 ו 14 מהגלגול הראשון. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהום חיידקים במהלך הליך משנה תכנות. דמות מייצגת המשתמשת במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה המציגה זיהום מיקרוביאלית של תרבות הפיברותקיעות במהלך הליך התיכנות מחודש. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs הם מתעוררים במהירות כמו המועמד התא המבטיח ביותר עבור יישומים רפואה רגנרטיבית וככלי מאוד שימושי עבור דוגמנות מחלות ובדיקות סמים3,8. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הדור של iPSCs אנושי ממדגם בעל גודל של ניקוב עור ביופסיה עם הליך פשוט ויעיל שאינו דורש שום ציוד ספציפי או ניסיון קודם עם טכנולוגיית תכנות משנה.
זה החשיבות העיקרית כדי לייעל בידוד הפיברופיצוץ ותרבות כדי להגדיל את הסיכוי להצלחה, כמו צפיפות ציפוי ושיעור התפשטות ההשפעה מתיכנות מראש. יתר על כן, זה כבר דווח לאחרונה כי פיברופיצוצים העור להגיב באופן שונה הטכנולוגיה התכנות, במיוחד, פיברותקיעות מבודדים מהעור של אזור הבטן הם בקלות רבה יותר ומתוכנת ברצון מאשר פיברוטים העורי מבודדים מאזורים אחרים בגוף18. לכן, חשוב לבחור במדויק את התאים הסומטיים כדי לתכנת מראש ולהגדיר את צפיפות הציפוי על בסיס קצב הפצת התאים. למטרה זו, הפרוטוקול הנוכחי גם מורה על איך לבודד פיברותקיעות העור מהעור הבטן וכיצד להפיץ אותם באופן מתורבת כדי להקל ולהאיץ את ההליך.
לפני תכנות מתיכנות, פיברופיצוצים הופץ כדי להגיע למעבר 5 כדי למחוק את זיכרון התא18 ולעמוד בראיות דיווח כי מעבר יכול להאיץ את האינדוקציה של מצב pluriפוטנטי19. יתר על כן, על פי הניסיון שלנו, הגידולים בתערוכה תרבות משתנה נכסים מתרבים, ולכן שינו את הפרוטוקול על ידי החדרת צעד נוסף כדי לסנכרן פיברומוטים ולהפחית את השונות באוכלוסיית התאים.
שימוש בערכה מסחרית ננומטר-rnas מבוסס המציג שילוב של גורמים מתכנות מחודש כתוצאה של יאמאנאקה ו תומסון של הגישה5,6, יחד עם mirna כי הוכחו לשפר mrna מבוסס תכנות מחודש20, האדם פיברותקיעות העור יכול להיות תכנות מחודש בהצלחה כדי ipsc ומושבות קטנות להיות ברורה ככל 24 היתרונות העיקריים של התכנות מבוסס mRNA הם, אכן, הופעתה המוקדמת של מושבות גם כאשר מספר נמוך של תאים מתוכנת משנה20 יחד עם שיעור מאוד נמוך מאוד, העדר שילוב מוחלט הופכים iPSCs שנוצר עם שיטה זו בטוח לשימוש ברפואה רגנרטיבית. יתרה מזאת, הערכה המסחרית המשמשת לפרוטוקול זה מספקת שיתוף גורמים אימונומודולטוריים הידועים כדי לשפר את יעילות התיכנות מראש על-ידי מניעת מוות התאים הנגרם על-ידי מערכת החיסונית והאנטי-מגנטית-rnas21,22.
למרות הקיט המשמש תכנות מחודש תוכנן עבור הצלחת 6-באר multi-היטב, אנו אופטימיזציה צפיפות תאית ומותאמים את נפח של ריאגנטים לניצול על הצלחת 24-באר רב להפוך את הפרוטוקול יעיל עבור הדור של האדם iPSCs מן העור אגרוף ביופסיה. יתר על כן, למרות שאם הצורך באינקובטור של תרבות רקמות עם השליטה O2 מדווח על ידי מספר סופרים20,23 ומומלץ על ידי יצרן הערכה, בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן אנו מתוכנת באמצעות העור האדם פיברופיצוצים מהעור הבטן בחממה 5% CO2 . לפיכך, ניתן לבצע את ההליך בכל מעבדה לתרבות התא ללא צורך במצב אטמוספרי (21% o2) או ארוי (5% o2) תנאי תרבות, למרות שאלה עשויים לשפר עוד יותר את יעילותהתיכנות 24,25.
למרות זאת, השתמשנו בחומרים שאינם בני אדם בעלי חיים שנגזר לנבוע מדגימות עור קטנות iPSCs שניתן להשתמש בהם למטרות מחקר. למרות היישום האטרקטיבי ביותר הוא להתחדשות של רקמות ואיברים, iPSCs שימשו למידול מחלות שונות ולאחר מכן שניהם לחקור על מנגנונים מולקולריים ולפתח תרופות ספציפיות טיפולים3,26.
באופן מדהים, החלפת בעלי חיים בעלי ממון עבור ריאגנטים xeno לא מתאים, אותו פרוטוקול מאפשר תיכנות מחודש של מבוגרים האדם פיברותקיעות לתוך iPSCs בסביבה המלאה xeno-חינם תרבות כי צווי השימוש הקליני שלהם.
עם זאת, עומס העבודה הכבד צריך להילקח בחשבון. לדעתנו, חשוב לתכנן את הניסוי היטב מראש, כולל צעדים שצריך לבצע בסופי שבוע, ולהכין את כל ריאגנטים החצייה במהלך שלב הסנכרון. ואכן, העברה היא להתבצע כל יום במשך ארבעה ימים, ולאחר מכן, התאים צריכים להיות מנוטרים בכל יום ובינוני הוא להיות מוחלף על בסיס יומי.
יתרה מזאת, הזיהוי המדויק של מושבות iPSC אינו ניתן להסתמך על קריטריונים מורפולוגיים בלבד. מכאן, iPSCs נגזר החדש צריך להיות מאופיין בחיפוש אחר הביטוי של סמנים pluripotent מרובים באמצעות ניתוחים סלולריים ומולקולריים. סמנים מקובלים באופן נרחב כוללים NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 ו SSEA4, אשר עשוי להיות מזוהה על ידי ניתוח האימונוציטוכימיקלים ובאמצעות ניתוח ביטוי גנטי באמצעות למחצה כמותי או כמותי RT-PCR. מאז הפעילות האלקליין פוספספטאז הוכח להיות upregulated בתאי גזע בפלאוריטי, זיהוי של פעילות אנזימטית כגון ניתן לבצע בקלות כדי לזהות iPSCs ולאמת את ההתרחשות של תכנות מסוג27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
למחברים אין ותודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
