Summary
細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。
Abstract
人工多能性幹細胞(iPSC)は、現在治療不可能な疾患の管理、傷ついた組織の再構成と再生、および新薬の開発のための多能性細胞の有望な供給源と考えることができる。拒絶反応のリスクが低い、倫理的な問題が減り、再プログラミングの可能性に違いもなく老若男女両方の患者からそれらを得る可能性など、iPSCの使用に関連するすべての利点にもかかわらず、克服すべき問題まだ数多くあります。実際、ウイルスと統合ウイルスで行われる細胞リプログラミングは感染症を引き起こし、必要な遺伝子の導入はレシピエント細胞のゲノム不安定性を誘発し、クリニックでの使用を損なう可能性があります。特に、c-Myc遺伝子の使用に関する多くの懸念があり、その突然変異誘導活性に関するいくつかの研究からよく知られている。線維芽細胞は、細胞リプログラミングに適した細胞集団として出現し、分離や培養が容易であり、低侵襲の皮膚パンチ生検によって収穫される。ここで説明するプロトコルは、サンプル処理から細胞培養物を得るためのサンプル処理から、試薬や供給品の選択、洗浄と調製、商業的な手段による細胞リプログラミングまで、手順全体の詳細なステップバイステップの説明を提供します。非変更 RNA (NM-RNA) ベースのリプログラミング キット。選択されたリプログラミングキットは、iPSCおよび小さなコロニーへのヒト真皮線維芽細胞の効果的なリプログラミングを可能にし、標準的なデータシートに関する変更を加えても、最初のトランスフェクションの後に早くも24時間見ることができます。このプロトコルで使用されるリプログラミング手順は、ウイルスベクターベースの方法によって引き起こされる感染のリスクなしに、安全なリプログラミングの利点を提供し、細胞の防御メカニズムを低減し、ゼノフリーiPSCの生成を可能にします。さらなる臨床適用のために必須である重要な特徴。
Introduction
細胞リプログラミングは、体のすべての体細胞をiPSC1として知られる多能性幹細胞に変換する新しい技術を表しています。成人体細胞を多能性および未分化状態に再プログラミングする可能性は、多能性細胞の使用に関連する利用可能性と倫理的問題によって課される限界を克服し、以前はヒト胚(胚性幹細胞またはESC)2、3、4からしか導出できなかった。2006年、高橋和俊と山中伸弥は、4つの特定の遺伝子を人工的に加えることで、成人の体細胞を皮膚から多能性細胞に初めて変換する先駆的な研究を行った(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5.1年後、トムソンの研究室で行われた作業は、4つの遺伝子の異なる組み合わせ(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)6の異なる組み合わせの伝達によって、体細胞をiPSCに再プログラミングすることに成功しました。
iPSCは、再生医療や薬理学など、さまざまな分野の科学者や研究者に多くの機会を提供し、異なる疾患を研究し、それらが由来する患者の特性のゲノム反射と共に治療するための優れたプラットフォームです。iPSCの使用は、細胞の完全に自家起源による免疫応答のリスクの低減を含むいくつかの利点を提供します。彼らは継続的に自己更新し、異なる細胞タイプを生成することができるので、新薬とその副作用への応答を予測するための重要なツール、細胞ライブラリを作成する可能性;薬物投与のためのカスタマイズされたアプローチを開発する機会7,8,9.
現在、多様な技術が知られており、リプログラミング因子の発現を誘導し、それらは2つの主要なカテゴリーに含まれている:非ウイルスおよびウイルスベクターベースの方法10、11、12、13。非ウイルス法は、mRNAトランスフェクション、miRNA感染/トランスフェクション、ピギーバク、ミニサークルベクターおよびエピソソームプラスミドおよびエキソソーム10、11、12、13を含む。ウイルスベースの方法は、アデノウイルス、センダイウイルスおよびタンパク質などの非統合ウイルス、およびレトロウイルスおよびレンチウイルス10、11、12、13のようなウイルスを統合する。
いくつかの研究によれば、細胞リプログラミングの有効性の点でこれらの方法の間で有意な差は見られなっていないが、したがって、適切な方法の選択は、使用される細胞タイプおよび得られたiPSCの後続の用途に厳密に依存する。前述のすべての方法は、例えば、センダイウイルスはすべての細胞タイプに有効であるが、iPSCを得るために多くの通路を必要とする欠点を示しています。エピソームによるリプログラミングは、血液細胞にとって優れていますが、線維芽細胞の標準的な培養条件の変更が必要です。PiggyBac法は魅力的な代替手段を表す可能性がありますが、ヒト細胞の研究はまだ限られており、弱い10、11、12、13.エキソソームは、細胞によってすべての体液に生理学的に分泌されるナノ小胞である。最近の研究によると、彼らは細胞間通信を担当し、細胞の増殖、移行、分化などの重要な生物学的プロセスに役割を持つことができます。エキソソームは、細胞膜16の同じ組成を共有するので、完全に自然なメカニズムを有するレシピエント細胞にmRNAおよびmiRNAを輸送および伝達することができる。したがって、エキソソームはリプログラミングのための有望な新世代技術ですが、その内容によって体細胞を再プログラムする可能性はまだ調査中です。ウイルスベクターベースの方法は、レシピエント細胞にリプログラミング遺伝子を伝えるために改変されたウイルスを使用します。この技術は、リプログラミングの高効率にもかかわらず、細胞内のウイルスの統合が感染、奇形腫およびゲノム不安定性17を引き起こし得るとして、安全であるとは考えられていない。
iPSCコロニーを生成する次のプロトコルは、山中とトンプソンのリプログラミングカクテルを組み合わせ、NM-RNAと免疫回避因子を必要とする方法の使用に基づいており、ゼノフリー条件でそれを実行する可能性があります。この方法の使用の背後にある根拠は、科学界内で、腹部皮膚からiPSC18への成人ヒト線維芽細胞の迅速かつシンプルかつ非常に効果的なリプログラミングを可能にするプロトコルを広めることである。
提案された方法の強みは、実際には、性能の容易さとiPSCの取得に要する短い時間です。さらに、この方法は、細胞の防御メカニズムとウイルスベクターの使用を回避し、関連する問題を担当します。
標準プロトコルに関しては、以下の改変が行われました:(1)コンフルエント線維芽細胞は、トリプシン化の前に48時間0.1%の血清に配置することによって通路4で同期しました。(2)培養用の細胞密度と試薬の体積は、6ウェルプレートの代わりに24ウェルマルチウェルプレート上の利用のために調整した。(3)リプログラミング実験は、大気(21%O2)または低酸素(5%O2)条件のインキュベーターの代わりに5%CO2インキュベーターを用いて行った。
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Protocol
ヒト組織からの標本は、大学病院フェデリコIIガイドラインを観察しながら、ヘルシンキ宣言に従って収集された。この研究に関与するすべての患者は書面による同意を提供した。
1. 物資・文化メディアの準備
- 1組の大きな外科用ハサミ、2組の細かい鉗子、2組の微小分離ハサミ、1L滅菌ボトル、500 mL滅菌ボトル、250mL滅菌ボトルを清潔でオートクレーブします。
- 100mmプレート、60mmプレート、35mmプレート、使い捨てメス、50mL滅菌チューブ、15mL滅菌チューブ、100mmガラス板を用意します。使用できる状態になるまで、無菌条件下で器具を保管してください。
- 使用前に22mm x 22mmカバーメガネを清掃・殺菌してください。このためには、ガラス板にカバーグラスを置き、70%エタノールで覆い、数秒待ってからエタノールを吸引します。37°Cのオーブンでメガネを乾燥させてからオートクレーブします。
- 市販の粉末塩を二重蒸留無菌水に溶解し、0.35gの重炭酸ナトリウムを加えて、市販の粉末塩をpH7.4で1L調製します。滅菌フードでろ過して滅菌し、使用するまで+4°Cで保存します。
- 無菌の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を500mL調製し、リン酸カリウムモノベーシック0.1g、塩化カリウム0.1g、塩化ナトリウム4.0g、リン酸ナトリウム二重蒸留水中に0.575gのリン酸ナトリウムを溶解して調製します。pH値(7.4)を確認し、ろ過により滅菌フードの下で殺菌します。使用するまで+4°Cで保管してください。
- トリプシン停止液(TSS)を50mL調製し、滅菌フードの下で45mLのHBSSに10%ウシ血清(FBS)の5mLを加えて調製します。使用するまで+4°Cで保管してください。
- 10%FBSと0.5%ペニシリンとストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を添加した250mLのダルベッコの修飾イーグル培地を使用して、線維芽細胞分離(I-DMEM)のためにダルベッコの修飾イーグル培地を調製します。使用するまで+4°Cで保管してください。
- 0.1%FBSと0.5%のペン/ストレップを滅菌フードで補充した250mLのDMEMを使用して、線維芽細胞同期(S-DMEM)用のDMEMを準備します。使用するまで+4°Cで保管してください。
2. ヒト皮膚線維芽細胞の単離
メモ:以下に報告する手順2.1~2.3は、無菌フードの下で実行する必要があります。直径約0.8cmの円筒形サンプルは、通路1で2 x 106線維芽細胞を生成する。
- HBSS溶液で腹部から得た新鮮な人間の皮膚のサンプルを100ミリメートル皿で洗います。やさしく振って血液やその他の生体液を取り除きます。手順を 3 回繰り返し、各洗浄で HBSS 溶液とプレートを交換します。
- サンプルを100mmプレートに入れ、細かい鉗子とはさみを使用して髪と脂肪を取り除き、メスで解剖して、傷跡、汚れ(例えば、ダーモグラフィーペンで図面した結果として)または焼かれた領域を避けるために2mm x 1mmの断片(合計16個の断片)を得る 組織の。
- 各35ミリメートル皿に4つの小さな断片を置き、無菌の22 mm x 22 mmカバーガラスで覆います。細かい鉗子の手段によって調節する。I-DMEM を 1.5 mL 追加します。
- プレートを5%CO2で37°Cで約15日間、または細胞が85%の合流に達するまでインキュベートします。培養培地を3日ごとに交換し、逆位相差顕微鏡を毎日用いて細胞の増殖をチェックする。
3. ヒト皮膚線維芽細胞の拡大
メモ:以下に報告する手順は、インキュベーターで実行されるステップを除き、無菌フードの下で実行する必要があります。
- カバーグラスを細かい鉗子で持ち上げ、100mm皿に逆さまに置き、1x滅菌PBSで洗います。
- サンプルの断片を取り出して捨て、1x滅菌PBSでプレートを洗浄します。
- 1x PBSを取り出し、トリプシンEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を3mLと1mLを加え、それぞれ100mm皿と35mm皿に入れたグラスを覆います。5%CO2で37°Cで5分間インキュベートします。
- 100 mm 皿に 5 mL の TSS を追加し、各 35 mm 皿に TSS を 2 mL 加えてトリプシン化をブロックします。懸濁液を15mL滅菌チューブに集め、400 x gで遠心分離機を4°Cで5分間回収します。
- 上清を吸引し、I-DMEMの12mLでペレットを再サスペンドする。セル懸濁液を60mmプレートごとに3mLのアリコートに分割します。
- 5% CO2で 37 °C でインキュベートします。毎日メディアを変更します。細胞が75%の合流に達するまで培養中に保ちます。
- プレートから媒体を吸引し、1x PBSで素早く洗浄する。
- トリプシン化(ステップ3.3および3.4)を3回繰り返して、通路4で細胞を得る。各60mm皿に1.5 mLのトリプシンEDTAと3 mLのTSSを使用してください。セルを分割する 1:3
- I-DMEMをS-DMEMに置き換えて細胞を同期させ、37°Cで48時間インキュベートし、5%CO2.
- 次の項目を準備します (セルの同期中)。
- 高度なDMEM(A-DMEM)の44.5 mLに5.0 mLのFBSと0.5 mLのL-グルタミンを加えて線維芽細胞膨張培地を準備し、+4°Cで保存します。
- 9つの滅菌RNaseフリーチューブのそれぞれに以下を組み合わせて、線維芽細胞リプログラミング用の全NM-RNA-リプログラミングカクテルを準備します:OSKMNL NM-RNAの32μL、EKB NM-RNAの24 μL、NM-microRNAの5.6μL(9アリコートの61.6 μL最終ボリューム)。
- フィブロスリプログラミング用の全NM-RNA-リプログラミングカクテルの61.6 μLの各チューブを、無菌、RNaseフリーチューブの4つの15.4μLシングルユースアリコートに分割し、-80°C(36アリコートの場合は15.4°L最終容積)で保存します。
4. 真皮線維芽細胞のiPSCへのリプログラミング
- 0 日目: 細胞の播種
注: 手順 4.1.1 ~ 4.1.3 および 4.1.8 ~ 4.1.9 は、無菌フードで実行する必要があります。基底膜マトリックス(BMM)ゲルは室温で急速に。したがって、冷蔵庫の氷の上で一晩BMMを解凍し、氷冷無血清培地で希釈し、予冷ピペット、チップ、チューブを使用することを強くお勧めします。- 細胞を播種する前に、それぞれ100°LのBMMでウェルをコーティングし、37°Cで少なくとも1時間インキュベートして24ウェルプレートを準備します。
- 培養中の細胞を用いてプレートから培地を吸引し、1x PBSで素早く洗浄する。
- トリプシン化(手順3.3および3.4)を繰り返して、通路5で細胞を得る。上清を吸引し、適切な体積の線維芽細胞膨張培地でペレットを再サスペンドする(ステップ3.10参照)。
- 70%アルコールでヘモサイトメーターを準備し、清掃します。
- 1.5 mLチューブに10°Lのトリパンブルーと10°Lのセル懸濁液を穏やかに混合して溶液を調製し、室温で1~2分間インキュベートします。5分より長くインキュベートしないように注意してください。
- 溶液のピペット10μLをヘモサイトメーターに配置し、それを反転相造影顕微鏡のステージに置いて数える。生存不可能な細胞は青色になり、生存可能な細胞は染色されない。
- ヘモサイトメーターチャンバーの少なくとも2つの正方形で細胞をカウントします。セルの総数を取得するには、次の計算を適用します。
セルの総数 = (カウントされたセル/平方数の合計数) x 2 x 10 x セル懸濁液の総体積 - 希釈を行い、500μLの線維芽細胞膨張培地あたり2.5x104細胞の密度を、カウントされた細胞の総数に基づいて得る。適切な量の線維芽細胞膨張培地でペレットを再サスペンドします。
- 24ウェルプレートの各ウェルにセル懸濁液のピペット500μL。細胞を37°Cで一晩インキュベートし、5%CO2.
- 1日目:トランスフェクション
注:すべての作業面と消耗品(手袋、ボトル、滅菌フード表面、ピペット)は、手順を開始する前にRNaseを取り外すための洗浄試薬で洗浄する必要があります。滅菌フードの下でステップ4.2.2、4.2.4~4.2.8を実行します。- 37°Cの水浴中で、ゼノフリー、無血清、低成長因子ヒトESC/iPSC培養培地(XF/FF培養培地)を温めます。
- 各ウェルから古い培地を取り出し、500 μL の事前温め XF/FF 培養培地に交換します。
- 少なくとも6時間、5%CO2の下で37°Cでインキュベートする。
- 室温で全NM-RNAリプログラミングカクテルの5つの15.4 μLアリコートを解凍し、氷の上に置きます。
- 各アリコートに234.6μLの還元血清培地を加え、軽く3~5回ピペットを加え、それぞれをTUBE A(RNA+還元血清培地)として標識します。
- 標識5無菌、RNaseフリー0.5mLチューブをTUBEBとして、6μLの合成siRNAトランスフェクション試薬を244μLの還元血清培地(RNAトランスフェクション試薬+還元血清培地)と混合する。
- 各チューブBの内容物をドロップワイズのチューブAに追加します(NM-RNAトランスフェクション複合溶液の500 μL最終体積を得る)。チューブの底部をタップして混ぜます。室温で15分間インキュベートする。
- 500 μLの5つのアリコートのそれぞれから125μLのNM-RNAトランスフェクション複合溶液を4ウェルに加え(合計20ウェルに達する)、プレートを傾け、ピペットを媒体にドロップワイズします。やさしく揺らして混ぜる。残りの 4 つのウェルを参考にします。
- 37°で15時間インキュベートし、5%CO2。
- 2-4日目:トランスフェクションを完了する
- 媒体を吸引する。滅菌フードの下の1日目のようにトランスフェクション手順を繰り返します。
- 5~10日目:メディアの変更
- 培地を吸引し、滅菌フードの下で新鮮な、予め温めたXF/FF培養培地と交換する。
- 37°で一晩インキュベートし、5%CO2.
- 位相差顕微鏡で毎日モニタリングするiPSCコロニーの形成を観察するまで培養してください。
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Representative Results
このプロトコルの目的は、NM-RNAに基づく非統合リプログラミング法を用いて腹部皮膚から分離された皮膚線維芽細胞を再プログラムし、特定の因子の発現を誘導することであった。この目標を達成するために、ヒト皮膚線維芽細胞をおなかのタック手術を受けた患者の皮膚標本から単離し、iPSCはOct4、Sox2、Klf4、cMyc、ナノグ、Lin28リプログラミング因子およびE3、K3、B18免疫回避因子を導入し、NM-RNAとmicroRNA技術を組み合わせた市販の再プログラミングキットを導入した。プロトコルのタイムラインを図 1にまとめます。
ヒト線維芽細胞は、培養後1週間以内に腹部皮膚のサンプルから抜け出し(図2A)、2週間以内に85%の合流に達した(図2B)。細胞は、プラスチック培養皿上の接着剤の成長を特徴とし、その形態は細長く紡錘状(図2C)から平坦化および星形に変化した(図2D)。線維芽細胞形態と培養における配置は、BMMに播種した後に劇的に変化し、細長い形態を獲得し、薄い分岐構造を形成するように配置した(図3A)。小さなコロニーは、最初のトランスフェクション(図3B)から1日目に培養で既に見られ、そのサイズは時間の経過とともに徐々に増加し、その数は7日目から14日目まで安定した状態を保ち(図3C,D)、おそらくより大きなコロニーを形成するために合併する小さなコロニーの結果として、
リプログラミング手順は抗生物質を使用して行われるため、微生物汚染が大きな問題であり、無菌状態が保証されていない場合に発生する可能性があります(図4)汚染を防ぐための標準的な手順を採用する(例えば、手袋を着用し、すべての表面からほこりを取り除き、70%エタノールですべての表面および機器を清掃し、覆い隠された細胞培養プレートでステップ中に話を避ける)。
図 1: プロトコルのタイムライン腹部皮膚からのヒト線維芽細胞の分離とリプログラミングの年表。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:真皮線維芽細胞の単離および培養。線維芽細胞の代表的な画像は、皮膚断片から増殖を上げる(A)線維芽細胞は約14日で合流に達し(B)、紡錘状(C)および星形(D)表現型を示した。皮膚の断片は白い星で示される。スケール バー = 200 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:皮膚線維芽細胞リプログラミング進行。BMMに播種された細胞は、配置と形態の顕著な変化を示した(A).最初のトランスフェクション(B)の後に早く24時間に形成されたiPSCの小さなコロニーとそのサイズは7日目(C)、および14(D)で徐々に増加し、その数は1日目から7日目の間に増加したが、最初のトランスフェクションから7日目から14日目の間は安定したままだった。スケール バー = 500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:リプログラミング手順中の微生物汚染リプログラミング手順中の線維芽細胞培養の微生物汚染を示す位相差顕微鏡を用いた代表的な画像。スケール バー = 500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
iPSCは、再生医療用途の最も有望な細胞候補として、また疾患モデリングおよび薬物検査のための非常に有用なツールとして急速に出現しています3,8.ここで提示されるプロトコルは、特定の機器やリプログラミング技術の経験を必要としないシンプルで効率的な手順で、スキンパンチ生検のサイズを持つサンプルからのヒトiPSCの生成について説明します。
めっき密度と増殖速度がリプログラミング効率に影響を与えるため、線維芽細胞の単離と培養を最適化して成功のチャンスを増やすことが最も重要です。また、最近では、皮膚線維芽細胞がリプログラミング技術に異なる反応を示し、具体的には、腹部領域の皮膚から単離された線維芽細胞は、他の身体領域18から単離された真皮線維芽細胞よりも容易かつ容易に再プログラムされることが報告されている。したがって、細胞増殖速度に基づいてめっき密度を再プログラムおよび定義する体細胞を正確に選択することが重要である。この目的のために、本プロトコルはまた、腹部の皮膚から真皮線維芽細胞を分離する方法と、手順を容易にし、加速するためにそれらをインビトロで伝播する方法についても指示する。
リプログラミングの前に、線維芽細胞は、細胞メモリ18を消去し、通過が多能性状態19の誘導を加速し得る報告された証拠に従うために通路5に到達するために伝播された。さらに、我々の経験によれば、培養中の線維芽細胞は可変増殖特性を示し、したがって、線維芽細胞を同期させ、細胞集団の変動性を低減するための追加のステップを導入することによってプロトコルを改変した。
山中とトムソンのアプローチ5、6に起因するリプログラミング因子の組み合わせを導入する市販のNM-RNAベースのキットを使用して、mRNAベースのリプログラミング20を改善することが証明されたmiRNAと共に、ヒト皮膚線維芽細胞はiPSCに再プログラムされ、初期のトランスフェクションの24時間後に早期に明らかになることができる。mRNAベースのリプログラミングの主な利点は、実際には、少数の細胞が非常に低いアヌプロイド率と再生医療での使用のためにこの方法で生成されたiPSCを安全にする統合の完全な欠如と一緒に20を再プログラムされた場合でも、コロニーの早期出現である。さらに、このプロトコルに使用される商用キットは、細胞傷害性および免疫原性NM−RNA22によって引き起こされる細胞死を防止することによってリプログラミングの効率を向上させることが知られている免疫調節因子を共送する。
リプログラミングに使用されるキットは6ウェルマルチウェルプレート用に設計されましたが、細胞密度を最適化し、24ウェルマルチウェルプレートで使用する試薬の体積を調整し、スキンパンチ生検からのヒトiPSCの生成に有効なプロトコルを作りました。さらに、O2コントロールを有する組織培養インキュベーターの必要性が複数の著者によって報告され、キットメーカーによって推奨される場合でも、ここで説明するプロトコルに従って、標準的な5%CO2インキュベーターで腹部皮膚からヒト皮膚線維芽細胞を再プログラムした。したがって、この手順は、大気(21%O2)または低酸素(5%O2)培養条件を必要とせずに任意の細胞培養実験室で行うことができるが、これらはリプログラミング効率24、25をさらに向上させる可能性がある。
それでも、ヒト以外の動物由来試薬を用い、研究目的で使用できる小さな皮膚検体iPSCから導出しました。最も魅力的なアプリケーションは、組織や臓器の再生のためであるが、iPSCは、異なる疾患をモデル化するために使用され、その後、基礎となる分子機構を調査し、特定の薬物および治療法を開発する3、26。
驚くべきことに、動物由来の試薬を適切な異種性試薬に置き換えると、同じプロトコルにより、成人ヒト線維芽細胞を臨床使用を保証する完全な異種培養環境でiPSCに再プログラミングすることができます。
ただし、負荷の高いワークロードを考慮する必要があります。私たちの意見では、週末に行う必要がある手順を含め、事前に慎重に実験を計画し、同期ステップ中にすべてのトランスフェクション試薬を準備することが重要です。実際、トランスフェクションは毎日4日間行われ、その後、細胞を毎日監視する必要があり、培地は日常的に置き換えられる。
さらに、iPSCコロニーの正確な同定は、形態学的基準のみに基づくものにはなれない。したがって、新たに導出されたiPSCは、細胞および分子分析を通じて複数の多能マーカーの発現を探索することを特徴付ける必要がある。広く受け入れられているマーカーには、NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81およびSSEA4が含まれ、これは免疫細胞化学分析および半定量的または定量的RT-PCRを用いた遺伝子発現解析によって同定され得る。アルカリホスファターゼ活性は多能性幹細胞においてアップレギュレートすることが示されているので、このような酵素活性の検出は、iPSCを同定し、リプログラミング27、28の発生を検証するために容易に行うことができる。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者には謝辞がない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
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