Перепрограммирование клеток требует введения ключевых генов, которые регулируют и поддерживают плюрипотентное клеточное состояние. Описанный протокол позволяет формировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) колонии из человеческих кожных фибробластов без вирусных/интеграционных методов, но с использованием немодифицированных РНК (NM-RNA) в сочетании с факторами иммунного уклонения, уменьшающими механизмы клеточной защиты.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IПС) можно считать на сегодняшний день перспективным источником плюрипотентных клеток для лечения неизлечимых в настоящее время заболеваний, для восстановления и регенерации поврежденных тканей и для разработки новых препаратов. Несмотря на все преимущества, связанные с использованием iPSCs, такие как низкий риск отторжения, снижение этических вопросов, а также возможность получить их от молодых и старых пациентов без каких-либо различий в их перепрограммировании потенциал, проблемы для преодоления по-прежнему многочисленны. В самом деле, перепрограммирование клеток проводится с вирусными и интеграции вирусов может вызвать инфекции и введение необходимых генов может вызвать геномную нестабильность клетки-реципиента, ухудшая их использование в клинике. В частности, существует много опасений по поводу использования гена c-Myc, известного по нескольким исследованиям, для его мутационной активности. Фибробласты стали подходящей популяцией клеток для клеточного перепрограммирования, поскольку они легко изолируются и культуре и собирают сявречноинбиоцией пунша кожи. Описанный здесь протокол содержит подробное пошаговое описание всей процедуры, от обработки образцов до получения клеточных культур, выбора реагентов и принадлежностей, очистки и подготовки, перепрограммирования клеток с помощью коммерческого немодифицированные РНК (NM-RNA) на основе перепрограммирования комплекта. Выбранный набор перепрограммирования позволяет эффективно перепрограммировать человека дермальной фибробластов для iPSCs и небольших колоний можно увидеть уже в 24 ч после первого трансфекции, даже с изменениями в отношении стандартного листа данных. Процедура перепрограммирования, используемая в этом протоколе, предлагает преимущество безопасного перепрограммирования, без риска инфекций, вызванных вирусными векторными методами, уменьшает механизмы клеточной защиты, и позволяет генерации ксено-свободных iPSCs, все критические особенности, которые являются обязательными для дальнейшего клинического применения.
Перепрограммирование клеток представляет собой новую технологию для преобразования каждой соматической клетки тела в плюрипотентную стволовую клетку, известную как iPSC1. Возможность перепрограммирования взрослых соматических клеток обратно в плюрипотентное и недифференцированное состояние преодолела пределы, налагаемые плохой доступностью и этические вопросы, связанные с использованием плюрипотентных клеток, ранее только вытекающих из человеческих эмбрионов (эмбриональные стволовые клетки или ESC)2,3,4. В 2006 году Кадзутоси Такахаси и Синья Яманака провели новаторское исследование, в ходе чего было проведено первое преобразование взрослых соматических клеток из кожи в плюрипотентные клетки путем искусственного добавления четырех специфических генов (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Год спустя, работа, проведенная в лаборатории Томсона, привела к успешному перепрограммированию соматических клеток в iPSCs путем трансдукции другой комбинации из четырех генов (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs предлагают ряд возможностей для ученых и исследователей в различных областях, таких как регенеративная медицина и фармакология, являясь отличной платформой для изучения и лечения различных заболеваний наряду с генотипическим отражением характеристик пациента, из которых они получены. Использование iPSCs обеспечивает ряд преимуществ, включая: снижение риска иммунного ответа из-за полностью аутологичных происхождения клеток; возможность создания клеточной библиотеки, важного инструмента для прогнозирования реакции на новые лекарства и их побочные эффекты, поскольку они способны непрерывно самостоятельно обновлять и генерировать различные типы клеток; и возможность разработать индивидуальный подход к лекарственным препаратам7,8,9.
Различные методы известны в настоящее время, чтобы вызвать выражение факторов перепрограммирования, и они включены в две основные категории: невирусные и вирусные векторные методы10,11,12,13. Невирусные методы включают трансфекцию мРНК, инфекцию/трансфекцию миРНК, PiggyBac, переносчики мини-круга и эпизомальные плазмиды и экзосомы10,11,12,13. Вирусные методы включают неинтегрирующие вирусы, такие как аденовирус, вирус Сендай и белки, а также интеграцию вирусов, таких как ретровирус и лентивирус10,11,12,13.
По данным нескольких исследований, никаких существенных различий среди этих методов с точки зрения эффективности перепрограммирования клеток не было замечено, следовательно, выбор подходящего метода строго зависит от используемого типа клеток и от последующих применений iPSCs, полученных14,15. Все упомянутые методы показывают недостатки, например, вирус Сендай эффективен на всех типах клеток, но требует много проходов для получения iPSCs; перепрограммирование эписомами отлично подходит для клеток крови, но нуждается в изменении стандартных условий культуры фибробластов; метод PiggyBac может представлять собой привлекательную альтернативу, но исследования в клетках человека по-прежнему ограничены ислабые 10,11,12,13. Экзосомы являются нано-пузырьками физиологически выделяется во все жидкости организма клетками. Согласно последним исследованиям, они отвечают за межклеточную коммуникацию и могут играть определенную роль в важных биологических процессах, таких как пролиферация клеток, миграция и дифференциация. Экзосомы могут транспортировать и передавать мРНК и миРНК в клетки-реципиенты с полностью естественным механизмом, так как они имеют один и тот же состав клеточной мембраны16. Таким образом, экзосомы являются перспективным методом нового поколения для перепрограммирования, но их потенциал для перепрограммирования соматических клеток по их содержанию все еще находится под следствием. Вирусные векторные методы используют вирусы, модифицированные для передачи генов перепрограммирования клеткам-реципиентам. Этот метод, несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, не считается безопасным, так как интеграция вируса в клетку может быть ответственна за инфекцию, тератомы и геномную нестабильность17.
Следующий протокол для генерации колоний iPSCs сочетает в себе коктейль перепрограммирования Яманаки и Томпсона и основан на использовании метода, требующего NM-РНК и факторов уклонения от иммунитета с возможностью выполнения его в условиях, свободных от ксено. Обоснование использования этого метода заключается в распространении в рамках научного сообщества протокола, позволяющего быстрое, простое и высокоэффективное перепрограммирование фибробластов взрослого человека из брюшной кожи в iPSCs18.
Сильные стороны предлагаемого метода, по сути, простота работоспособности и короткое время, необходимое для получения iPSCs. Кроме того, метод позволяет избежать механизмов клеточной защиты и использования вирусных векторов, ответственных за соответствующие вопросы.
Что касается стандартного протокола, то были внесены следующие изменения: (1) Конфлюентные фибробласты были синхронизированы при прохождении 4, размещая в 0,1% сыворотке 48 ч до трипсиизации; (2) Плотность клеток для культуры и объем реагентов были скорректированы для использования на 24-хорошо многоколодцной пластины вместо 6-колой пластины; (3) Эксперимент перепрограммирования был выполнен с использованием 5% CO2 инкубатор вместо инкубатора с атмосферными (21% O2) или гипоксических (5% O2) условия.
iPSCs быстро становятся наиболее перспективными кандидатами клеток для регенеративной медицины приложений и как чрезвычайно полезный инструмент для моделирования заболеваний и тестирования на наркотики3,8. Протокол, представленный здесь, описывает гене?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы не имеют подтверждений.
10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |