Summary
A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.
Abstract
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) poderiam ser consideradas, até o momento, uma fonte promissora de células pluripotentes para o manejo de doenças atualmente intratáveis, para a reconstituição e regeneração de tecidos feridos e para o desenvolvimento de novos medicamentos. Apesar de todas as vantagens relacionadas ao uso de iPSCs, como o baixo risco de rejeição, as questões éticas diminuídas e a possibilidade de obtê-las de pacientes jovens e idosos sem qualquer diferença em seu potencial de reprogramação, problemas para superar ainda são numerosos. Na verdade, a reprogramação celular realizada com vírus virais e integradores pode causar infecções e a introdução de genes necessários pode induzir uma instabilidade genômica da célula receptora, prejudicando seu uso na clínica. Em particular, há muitas preocupações sobre o uso do gene c-Myc, bem conhecido de vários estudos para a sua atividade indutora de mutação. Fibroblastos surgiram como a população celular adequada para reprogramação celular como eles são fáceis de isolar e cultura e são colhidas por uma biópsia de perfuração da pele minimamente invasiva. O protocolo aqui descrito fornece uma descrição detalhada passo a passo de todo o procedimento, desde o processamento de amostras até a obtenção de culturas celulares, escolha de reagentes e suprimentos, limpeza e preparação, até a reprogramação celular por meio de um comercial RNAs não modificados (NM-RNAs) kit de reprogramação baseada em RNAs. O kit de reprogramação escolhido permite uma reprogramação eficaz do fibroblasto dérmico humano para iPSCs e pequenas colônias pode ser visto tão cedo quanto 24 h após a primeira transfecção, mesmo com modificações no que diz respeito à folha de dados padrão. O procedimento de reprogramação utilizado neste protocolo oferece a vantagem de uma reprogramação segura, sem o risco de infecções causadas por métodos virais baseados em vetores, reduz os mecanismos de defesa celular e permite a geração de iPSCs livres de xeno, todos características críticas que são obrigatórias para novas aplicações clínicas.
Introduction
A reprogramação celular representa uma nova tecnologia para transformar todas as células somáticas do corpo em uma célula-tronco pluripotente, conhecida como iPSC1. A possibilidade de reprogramar uma célula somática adulta de volta a um estado pluripotente e indiferenciado superou os limites impostos pela baixa disponibilidade e questões éticas relacionadas ao uso de células pluripotentes, anteriormente derivadas apenas de embriões humanos (células-tronco embrionárias ou ESC)2,3,4. Em 2006, Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka realizaram um estudo pioneiro alcançando a primeira conversão de células somáticas adultas da pele em células pluripotentes adicionando artificialmente quatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Um ano depois, o trabalho realizado no laboratório da Thomson levou à reprogramação bem-sucedida de células somáticas em iPSCs por transdução de uma combinação diferente de quatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
Os iPSCs oferecem uma série de oportunidades para cientistas e pesquisadores de diferentes áreas, como medicina regenerativa e farmacologia, sendo uma excelente plataforma para estudar e tratar diferentes doenças, juntamente com um reflexo genotípico das características do paciente de que são derivados. O uso de iPSCs fornece várias vantagens, incluindo: o risco reduzido de resposta imune devido a uma origem completamente autóloga das células; a possibilidade de criar uma biblioteca celular, uma ferramenta importante para prever a resposta a novas drogas e seus efeitos colaterais, pois eles são capazes de se auto-renovar continuamente e gerar diferentes tipos de células; e a chance de desenvolver uma abordagem personalizada para a administração de medicamentos7,8,9.
Diversas técnicas são conhecidas no momento, para induzir a expressão dos fatores de reprogramação e estão incluídas em duas categorias principais: métodos não virais e virais baseados em vetores10,11,12,13. Métodos não virais incluem transfecção de mRNA, infecção/transfecção de miRNA, PiggyBac, vetores de minicírculos e plasmídeos episómicos e exossomos10,11,12,13. Métodos baseados em vírus incluem vírus não integradores, como Adenovírus, vírus Sendai e proteínas, e integração de vírus como Retrovírus e Lentivirus10,11,12,13.
De acordo com vários estudos, não foram observadas diferenças significativas entre esses métodos em termos de eficácia da reprogramação celular, portanto, a escolha do método adequado depende estritamente do tipo celular utilizado e das aplicações subsequentes dos iPSCs obtidos14,15. Todos os métodos mencionados mostram desvantagens, por exemplo, o vírus Sendai é eficaz em todos os tipos de células, mas requer um monte de passagens para obter iPSCs; reprogramação por epísmios é excelente para as células do sangue, mas precisa de modificação das condições culturais padrão para fibroblastos; o método PiggyBac poderia representar uma alternativa atraente, mas os estudos em células humanas ainda são limitados e fracos10,11,12,13. Exossomos são nano-vesículas fisiologicamente secretadas em todos os fluidos corporais por células. De acordo com estudos recentes, eles são responsáveis pela comunicação intercelular e podem ter um papel em importantes processos biológicos, como proliferação celular, migração e diferenciação. Exossomos podem transportar e transferir mRNA e miRNA para células receptoras com um mecanismo completamente natural, pois compartilham a mesma composição da membrana celular16. Portanto, exossomos são uma técnica promissora de nova geração para reprogramação, mas seu potencial para reprogramar células somáticas por seu conteúdo ainda está investigação. Métodos baseados em vetores virais usam vírus modificados para transmitir genes de reprogramação para as células receptoras. Esta técnica, apesar da alta eficiência da reprogramação, não é considerada segura, pois a integração do vírus dentro da célula pode ser responsável pela infecção, teratópodes e instabilidade genômica17.
O seguinte protocolo para gerar colônias de iPSCs combina o coquetel de reprogramação de Yamanaka e Thompson e é baseado no uso de um método que exige NM-RNAs e fatores de evasão imunológica com a possibilidade de realizá-lo em condições livres de xeno. A lógica por trás do uso deste método é se espalhar, dentro da comunidade científica, um protocolo que permite uma reprogramação rápida, simples e altamente eficaz de fibroblastos humanos adultos da pele abdominal para iPSCs18.
Os pontos fortes do método proposto são, de fato, a facilidade de desempenho e o curto espaço de tempo necessário para obter iPSCs. Além disso, o método evita mecanismos de defesa celular e o uso de vetores virais, responsáveis por questões relevantes.
Com relação ao protocolo padrão, foram feitas as seguintes modificações: (1) Os fibroblastos de confluentto foram sincronizados na passagem 4 ao colocar em 0,1% de soro por 48 h antes da trippsinização; (2) A densidade celular para a cultura e o volume de reagentes foram ajustados para a utilização em uma placa multi-poço de 24 poços em vez de uma placa de 6 poços; (3) O experimento de reprogramação foi realizado usando uma incubadora de 5% de CO2 em vez de uma incubadora com condições atmosféricas (21% O2)ou hipóxico (5% O2).
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Protocol
Os espécimes do tecido humano foram coletados de acordo com a Declaração de Helsínquia, observando as diretrizes do Hospital Universitário Federico II. Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o consentimento escrito.
1. Preparação de Suprimentos e Cultura Mídia
- Limpe e autoclave um grande par de tesouras cirúrgicas, dois conjuntos de fórceps finos, dois pares de tesouras microdissecting, 1 L garrafa estéril, 500 mL garrafa estéril, e uma garrafa estéril de 250 mL.
- Prepare placas de 100 mm, placas de 60 mm, placas de 35 mm, bisturis descartáveis, tubos estéreis de 50 mL, tubos estéreis de 15 mL e uma placa de vidro de 100 mm. Armazenar instrumentos em condições estéreis até que esteja pronto para uso.
- Limpe e esterilizar 22 mm x 22 mm óculos de tampa antes de usar. Para isso, coloque os óculos de cobertura em uma placa de vidro, cubra-os com 70% de etanol e espere por alguns segundos antes de aspirar o etanol. Deixe os copos de cobertura secar em um forno a 37 °C e, em seguida, autoclave-los.
- Prepare 1 L da solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) no pH 7.4 dissolvendo sais pulverizados comercialmente disponíveis na água estéril dobro-destilada e adicionando 0.35 g do bicarbonato de sódio. Esterilizar por filtragem um capô estéril e armazenar a +4 °C até o uso.
- Prepare 500 mL de estéril 1x fosfato-buffered-salina (PBS) dissolvendo 0,1 g de fosfato de potássio monobasic, 0,1 g de cloreto de potássio, 4,0 g de cloreto de sódio e 0,575 g de fosfato de sódio dibasic em água estéril de destilado duplo. Verifique o valor do pH (7,4) e esterilizar um capô estéril por filtragem. Guarde a +4°C até o uso.
- Prepare 50 mL de solução de stop de trippsina (TSS), adicionando 5 mL de 10% de soro bovino fetal (FBS) a 45 mL de HBSS um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.
- Prepare o meio eagle modificado do Dulbecco para isolamento de fibroblasto (I-DMEM) usando 250 mL do meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% FBS e 0,5% penicilina e estreptomicina (caneta/estreptococo) um capuz estéril. Guarde a +4°C até o uso.
- Prepare o DMEM para sincronização de fibroblastos (S-DMEM) usando 250 mL de DMEM complementados com 0,1% FBS e 0,5% caneta/estreptococo um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.
2. Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos
NOTA: Os passos 2.1 a 2.3 relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril. Uma amostra cilíndrica medindo cerca de 0,8 cm de diâmetro produz 2 x 106 fibroblastos na passagem 1.
- Lave a amostra recém-obtida de pele humana do abdômen em um prato de 100 mm com solução HBSS. Agite delicadamente para remover o sangue e outros fluidos biológicos. Repita a etapa três vezes, alterando a solução HBSS e a placa em cada lavagem.
- Coloque a amostra em uma placa de 100 mm, retire o cabelo e a gordura usando fórceps finos e tesouras, e disseque-a com um bisturi para obter fragmentos de 2 mm x 1 mm (para um total de 16 fragmentos) evitando cicatrizes, sujas (por exemplo, como resultado de desenhos com caneta dermográfica) ou áreas queimadas do tecido.
- Coloque 4 pequenos fragmentos em cada prato de 35 mm, cubra com um vidro de cobertura estéril de 22 mm x 22 mm. Ajuste por meio de fórceps finos. Adicionar 1,5 mL de I-DMEM.
- Incubar as placas a 37 °C em 5% DE CO2 por cerca de 15 dias ou até que as células atinjam 85% de confluência. Mude o meio de cultura a cada 3 dias e verifique a conseqüência das células usando um microscópio de contraste de fase invertido diariamente.
3. Expansão dos fibroblastos da pele humana
NOTA: Os passos relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril, exceto os passos realizados na incubadora.
- Levante os óculos de capa com fórceps finos, coloque-os de cabeça para baixo em um prato de 100 mm e lave com PBS 1x estéril.
- Retire fragmentos das amostras e descartá-los, lavar placas com 1x PBS estéril.
- Retire 1x PBS e adicione 3 mL e 1 mL de trippsina-EDTA (ácido tetraáptico etilediamina) para cobrir copos colocados no prato de 100 mm e pratos de 35 mm, respectivamente. Incubar para 5 min em 37 °C com 5% CO2.
- Bloquear a trypsinização, adicionando 5 mL de TSS para o prato de 100 mm e 2 mL de TSS para cada prato de 35 mm. Colete a suspensão em tubos estéreis de 15 mL, centrífuga a 400 x g a 4 °C por 5 min.
- Ascute o supernatant e resuspenda a pelota em 12 mL de I-DMEM. Divida a suspensão celular em 3 mL aliquots para cada placa de 60 mm.
- Incubar a 37 °C com 5% CO2. Mude o meio diariamente. Mantenha as células na cultura até atingirem uma confluência de 75%.
- Aspirar o meio das placas e lavar rapidamente em 1x PBS.
- Repita a trypsinização (passos 3,3 e 3,4) três vezes para obter células na passagem 4. Use 1,5 mL de trypsin-EDTA e 3 mL de TSS em cada prato de 60 mm. Divida as celas 1:3.
- Sincroniza as células substituindo o I-DMEM por S-DMEM e incubar por 48 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Prepare o seguinte (durante a sincronização celular).
- Prepare o meio de expansão do fibroblasto adicionando 5,0 mL de FBS e 0,5 mL de l-glutamina a 44,5 mL de DMEM avançado (A-DMEM), loja a +4 °C.
- Prepare o coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblastos, combinando o seguinte em cada um dos 9 tubos livres de RNase estéreis: 32 μL de OSKMNL NM-RNA, 24 μL de EKB NM-RNA, 5,6 μL de NM-microRNAs (61,6 μL volume final para 9 aliquots).
- Divida cada tubo de 61,6 μL de coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblasto em quatro alíquos de uso único de 15,4 μL em tubos estéreis, livres de RNase e guarde a -80 °C (15,4 μL volume final para 36 alíquos).
4. Reprogramação de fibroblastos dérmicos para iPSCs
- Dia 0: Semeadura celular
NOTA: Os passos 4.1.1 a 4.1.3 e 4.1.8 a 4.1.9 devem ser realizados um capô estéril. Gémeos de matriz de membrana do porão (BMM) rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, é fortemente recomendado descongelar BMM durante a noite no gelo em uma geladeira, diluí-lo com meio soro-frio-frio e usar pipetas pré-resfriados, pontas e tubos.- Prepare uma placa de 24 poços revestindo cada poço com 100 μL de BMM e incubar por pelo menos 1 h a 37 °C antes de semear as células.
- Assaa o meio de placas com células na cultura e lave rapidamente em 1x PBS.
- Repita a trypsinização (passos 3.3 e 3.4) para obter células na passagem 5. Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média (ver passo 3.10).
- Prepare e limpe o hemocytometer com 70% de álcool.
- Prepare uma solução misturando suavemente 10 μl de trippan azul e 10 μL de suspensão celular em tubo de 1,5 mL, e incubar por 1-2 min à temperatura ambiente. Tenha cuidado para não incubar mais de 5 min.
- Pipeta 10 μL da solução para o hemocytometer colocá-lo no palco de um microscópio de contraste fase invertida para contar. Células não viáveis serão azuis, enquanto células viáveis serão desmanhadas.
- Conte as células em pelo menos 2 quadrados da câmara do hemocytometer. Aplique o seguinte cálculo para obter o número total de células:
número total de células = (número total de células contadas/número quadrado) x 2 x 10 x volume total de suspensão celular - Realize uma diluição para obter uma densidade de 2,5 x 104 células por 500 μL de fibroblastos de médium de expansão, com base no número total de células contadas. Resuspenda a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média.
- Pipette 500 μL da suspensão celular em cada poço da placa de 24 poços. Incubate células durante a noite em 37 °C e 5% CO2.
- Dia 1: Transfecção
NOTA: Todas as superfícies de trabalho e suprimentos (por exemplo, luvas, garrafas, superfícies de capô estéril, pipettors) devem ser limpos com reagente de limpeza para remover RNase antes de iniciar o procedimento. Executar etapas 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 uma capa estéril.- Aqueça xeno-livre, soro-livre, fator de baixo crescimento humano ESC / iPSC cultura média (XF / FF cultura média) em um banho de água 37 ° C.
- Retire o velho meio de cada poço e substituí-lo por 500 μL de pré-aquecido XF / FF meio de cultura.
- Incubar a 37 °C abaixo de 5% CO2 para pelo menos 6 h.
- Descongele cinco alíquos de 15,4 μL do coquetel total de reprogramação nm-rna à temperatura ambiente e coloque-o no gelo.
- Adicione 234,6 μL de meio de soro reduzido a cada alíquota, delicadamente pipette 3-5 vezes e rotular cada um como TUBO A (RNA + meio de soro reduzido).
- Etiqueta 5 estéril, rnase-livre 0,5 mL tubos como tubo B e misturar 6 μL de sintético siRNA transfecção reagente com 244 μL de meio de soro reduzido (RNA-transfecção reagente + meio de soro reduzido).
- Adicione o conteúdo de cada TUBO B a um TUBO A dropwise (para obter 500 μL volume final de solução de transfecção NM-RNA complexo). Misture tocando no fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente por 15 min.
- Adicione 125 μL de solução complexa de transfecção NM-RNA de cada um dos cinco alíquos de 500 μL a 4 poços (para atingir um total de 20 poços), inclinando a placa e tubulação dropwise no meio. Misture balançando suavemente. Use os 4 poços restantes como referência.
- Incubar por 15 h a 37 °C, 5% CO2.
- Dia 2-4: Complete a transfecção
- Aspirar o meio. Repita o procedimento de transfecção como no dia 1 o capô estéril.
- Dia 5-10: Mudanças na mídia
- Assaa o meio e troque com o meio fresco, pré-aquecido da cultura de XF/FF uma capa estéril.
- Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2.
- Mantenha-se na cultura até observar a formação de colônias do iPSC monitorando diariamente por um microscópio de contraste de fase.
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Representative Results
O objetivo do protocolo foi reprogramar fibroblastos dérmicos isolados da pele abdominal, utilizando método de reprogramação não integrador com base em RNAs Para induzir a expressão de fatores específicos. Para atingir esse objetivo, os fibroblastos dérmicos humanos foram isolados de amostras de pele de pacientes submetidos a cirurgia de abdominoplastia e iPSCs foram gerados introduzindo outubro4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Fatores de reprogramação Lin28 e e3, K3, B18 fatores de evasão imunológica por um kit de reprogramação comercial pronto para uso que combina tecnologia NM-RNA e microRNA. A linha do tempo do protocolo é resumida na Figura 1.
Os fibroblastos humanos superaram de amostras de pele abdominal dentro de uma semana de cultura(Figura 2A)e atingiram 85% de confluência dentro de duas semanas (Figura 2B). As células foram caracterizadas pelo crescimento adesivo em pratos de cultura plástica e sua morfologia variou de alongado e em forma de fuso (Figura 2C) para achatado e em forma de estrela (Figura 2D). A morfologia e o arranjo do fibroblasto na cultura mudaram dramàtica após a semeadura em BMM, quando adquiriram uma morfologia alongada e arranjaram para dar forma a estruturas ramificadas finas (figura 3A). Pequenas colônias já eram visíveis na cultura no dia 1 da primeira transfecção (Figura 3B)e seu tamanho cresceu progressivamente ao longo do tempo, enquanto seu número aumentou até o dia 7 e, em seguida, manteve-se estável entre o dia 7 e o dia 14 (Figura 3C,D),provavelmente como resultado de colônias menores se fundindo para formar colônias maiores.
Uma vez que o procedimento de reprogramação é realizado usando mídia livre de antibióticos, a contaminação microbiana é um problema importante e pode ocorrer (Figura 4)se as condições estéreis não forem garantidas Adote procedimentos padrão para evitar a contaminação (por exemplo, usar luvas, remover poeira de todas as superfícies, limpar todas as superfícies e equipamentos com 70% de etanol, evitar falar durante etapas com placas de cultura celular descobertas).
Figura 1: Cronograma do protocolo. Cronograma de isolamento e reprogramação de fibroblastos humanos da pele abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Isolamento e cultura de fibroblastos dérmicos. Imagens representativas de fibroblastos conseqüência dos fragmentos da pele (A). Fibroblastos atingiu confluência em cerca de 14 dias(B)e mostrou em forma de fuso (C) e em forma de estrela (D)fenótipo. Fragmentos de pele são indicados por uma estrela branca. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Progressão de reprogramação de fibroblasto da pele. As células semeadas no BMM mostraram uma mudança acentuada no arranjo e morfologia(A). Pequenas colônias de iPSCs formaram-se logo às 24 h após a primeira transfecção (B)e seu tamanho aumentou progressivamente no dia 7 (C), e 14(D),enquanto seu número aumentou entre o dia 1 e o dia 7, mas permaneceu estável entre os dias 7 e 14 da primeira transfecção. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Contaminação microbiana durante o procedimento de reprogramação. Imagem representativa usando microscopia de contraste de fase mostrando uma contaminação microbiana da cultura dos fibroblastos durante o procedimento de reprogramação. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
IPSCs estão emergindo rapidamente como o candidato celular mais promissor para aplicações de medicina regenerativa e como uma ferramenta tremendamente útil para modelagem de doenças e testes de drogas3,8. O protocolo apresentado aqui descreve a geração de iPSCs humanos de uma amostra com o tamanho de uma biópsia de perfuração de pele com um procedimento simples e eficiente que não requer nenhum equipamento específico ou experiência prévia com tecnologia de reprogramação.
É de importância primordial otimizar o isolamento e a cultura do fibroblasto para aumentar a chance de sucesso, já que a densidade de revestimento e a taxa de proliferação impactam a eficiência da reprogramação. Além disso, tem sido recentemente relatado que os fibroblastos dérmicos respondem de forma diferente à tecnologia de reprogramação e, especificamente, os fibroblastos isolados da pele da região abdominal são mais facilmente e facilmente reprogramados do que os fibroblastos dérmicos isolados de outras regiões do corpo18. Portanto, é importante selecionar com precisão as células somáticas para reprogramar e definir a densidade de revestimento com base na taxa de proliferação celular. Para esse objetivo, o protocolo atual também instrui sobre como isolar os fibroblastos dérmicos da pele abdominal e como propagá-los in vitro para facilitar e acelerar o procedimento.
Antes da reprogramação, os fibroblastos foram propagados para alcançar a passagem 5 para apagar a memória celular18 e cumprir com evidências relatadas de que a passaging poderia acelerar a indução do estado pluripotente19. Além disso, de acordo com nossa experiência, os fibroblastos na cultura exibem propriedades proliferativas variáveis, assim, modificamos o protocolo introduzindo um passo adicional para sincronizar fibroblastos e reduzir a variabilidade na população celular.
Usando um kit comercial baseado em NM-RNAs que introduz uma combinação de fatores de reprogramação resultantes da abordagem5,6,de Yamanaka e Thomson, juntamente com miRNA que foram comprovadamente para melhorar a reprogramação baseada em mRNA20,os fibroblastos dérmicos humanos podem ser reprogramados com sucesso para iPSC e pequenas colônias se tornam aparentes já 24 h após a primeira transfecção. As principais vantagens da reprogramação baseada em mRNA são, de fato, o surgimento precoce de colônias, mesmo quando um baixo número de células é reprogramado20, juntamente com uma taxa de aneuploide muito baixa e a completa ausência de integração que tornam os iPSCs gerados com este método seguro para um uso em medicina regenerativa. Além disso, o kit comercial utilizado para este protocolo co-oferece fatores imunomodulantes que são conhecidos por melhorar a eficiência da reprogramação, impedindo a morte celular causada por NM-RNAs citotóxico e imunogênico21,22.
Embora o kit usado para reprogramação tenha sido projetado para placa multi-poço de 6 poços, otimizamos a densidade celular e ajustamos o volume de reagentes para a utilização em uma placa multi-poço de 24 poços para tornar o protocolo eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de uma biópsia de perfuração de pele. Além disso, mesmo que a necessidade de uma incubadora de cultura de tecidocom controle O2 seja relatada por vários autores20,23 e recomendada pelo fabricante do kit, seguindo o protocolo descrito aqui, reprogramamos fibroblastos dérmicos humanos da pele abdominal em uma incubadora padrão de 5% de CO2. Portanto, o procedimento pode ser realizado em qualquer laboratório de cultura celular sem a necessidade de condições de cultura atmosférica (21% O2)ou hipóxico (5% O2),embora estes possam melhorar ainda mais a eficiência de reprogramação24,25.
No entanto, usamos reagentes derivados de animais não humanos para derivar de pequenos espécimes de pele iPSCs que podem ser usados para fins de pesquisa. Embora a aplicação mais atraente seja para a regeneração de tecidos e órgãos, os iPSCs têm sido usados para modelar diferentes doenças e, em seguida, investigar sobre os mecanismos moleculares subjacentes e desenvolver medicamentos e terapias específicas3,26.
Notavelmente, substituindo reagentes derivados de animais por reagentes xeno-livres apropriados, o mesmo protocolo permite a reprogramação de fibroblastos humanos adultos em iPSCs em um ambiente de cultura completo livre de xeno que merece seu uso clínico.
No entanto, a carga de trabalho pesada precisa ser levada em consideração. Em nossa opinião, é fundamental planejar o experimento com cuidado com antecedência, incluindo etapas que precisam ser realizadas durante os finais de semana e preparar todos os reagentes de transfecção durante a etapa de sincronização. De fato, a transfecção deve ser realizada todos os dias por quatro dias e, posteriormente, as células precisam ser monitoradas todos os dias e médios devem ser substituídas diariamente.
Além disso, a identificação precisa das colônias do IPSC não pode ser baseada unicamente em critérios morfológicos. Assim, os iPSCs recém-derivados precisam ser caracterizados em busca da expressão de múltiplos marcadores pluripotentes através de análises celulares e moleculares. Marcadores amplamente aceitos incluem NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA4, que podem ser identificados pela análise imunocitoquímica e pela análise de expressão gênica usando RT-PCR semiquantitquantitativa ou quantitativa. Uma vez que a atividade de fosfatase alcalina tem se mostrado regulamentada em células-tronco pluripotentes, a detecção de tal atividade enzimática pode ser facilmente realizada para identificar iPSCs e verificar a ocorrência de reprogramação27,28.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
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