Summary
Een in vitro model systeem werd ontwikkeld om weefsel architectonische veranderingen vast te leggen tijdens long plaveisel carcinoom (LUSC) progressie in een 3-dimensionale (3D) co-cultuur met kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). Dit organoïde systeem biedt een uniek platform om de rollen van diverse tumorcel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen te onderzoeken die het tumorfenotype moduleren.
Abstract
Tumor-stroma interacties spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van longplaveisel carcinoom (LUSC). Echter, begrijpen hoe deze dynamische interacties bijdragen aan weefsel architectonische veranderingen waargenomen tijdens tumorigenese blijft uitdagend vanwege het ontbreken van geschikte modellen. In dit protocol beschrijven we de generatie van een 3D cocultuurmodel met behulp van een LUSC primaire celcultuur bekend als TUM622. TUM622 cellen werden opgericht uit een LUSC patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en hebben de unieke eigenschap om acinar-achtige structuren te vormen wanneer gezaaid in een kelder membraan matrix. We tonen aan dat TUM622 acini in 3D cocultuur de belangrijkste kenmerken van weefselarchitectuur recapituleert tijdens LUSC-progressie en de dynamische interacties tussen LUSC-cellen en componenten van de tumormicroomgeving (TME), inclusief de extracellulaire matrix (ECM) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). We passen ons belangrijkste 3D-kweekprotocol verder aan om aan te tonen hoe dit systeem kan worden gebruikt voor verschillende downstream-analyses. Over het algemeen creëert dit organoïde model een biologisch rijk en aanpasbaar platform dat men in staat stelt om inzicht te krijgen in de cel-intrinsieke en extrinsieke mechanismen die de verstoring van epitheelarchitecturen tijdens carcinoma progressie bevorderen en zal helpen het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen en diagnostische markers.
Introduction
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte wereldwijd. Longplaveisel celcarcinoom (LUSC), dat is de tweede meest voorkomende vorm van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en is goed voor ongeveer 30% van alle longkanker, wordt vaak gediagnosticeerd in vergevorderde stadia en heeft een slechte prognose1. Behandeling opties voor LUSC patiënten zijn een grote onvervulde behoefte die kan worden verbeterd door een beter begrip van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen die LUSC tumorigenese rijden.
Zoals bij de meeste menselijke kankers, wordt de pathogenese van LUSC gekenmerkt door de verstoring van de intacte, goed geordende epitheelweefselarchitectuur2. Tijdens dit proces gaan goede apical-basale celpolariteit, celcel- en celmatrixcontacten verloren, waardoor ongecontroleerde groei en invasief gedrag van de tumorcellen mogelijk worden. Het wordt nu algemeen gewaardeerd dat de kwaadaardige kenmerken van kankercellen niet kunnen worden gemanifesteerd zonder een belangrijk samenspel tussen kankercellen en hun lokale tumor micro-omgeving (TME)3. Belangrijke componenten in de TME, waaronder extracellulaire matrix (ECM), kankergerelateerde fibroblasten (CAF's) en endotheelcellen en infiltrerende immuuncellen geven actief vorm aan de TME en drijft tumorigenese4aan. Niettemin, onze huidige begrip van hoe de tumorcellen en deze belangrijke componenten in de TME interactie om weefsel architectonische veranderingen rijden tijdens LUSC progressie is zeer beperkt.
Driedimensionale (3D) cultuur is een belangrijk instrument om de biologische activiteiten van cel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen in het reguleren van weefsel architecturale veranderingen in zowel normale als zieke weefsels5te bestuderen. 3D-culturen bieden de juiste structurele en functionele context die meestal ontbreekt in traditionele tweedimensionale (2D) culturen. De toegevoegde afmetingen van dergelijke systemen bootsen weefsel in vivo nauwer na in vele aspecten van celfysiologie en cellulair gedrag, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie, eiwitexpressie en reactie op medicamenteuze behandeling. In de afgelopen jaren hebben inspanningen van verschillende laboratoria geleid tot de ontwikkeling van in vitro 3D-modellen voor zowel de normale long als NSCLC6,7,8. Echter, een model voor longplaveisel carcinoom dat zowel de dynamische weefsel architectonische veranderingen tijdens tumorigenese kan samenvatten als nemen van belangrijke stromal componenten was niet beschikbaar.
Hier beschrijven we de methoden voor het opzetten van een nieuwe 3-dimensionale (3D) cocultuur systeem met behulp van primaire PDX-afgeleide LUSC cellen (tum622) en CAFs9,10. Zowel TUM622 als CAFs zijn afgeleid van NSCLC-patiënt met slecht gedifferentieerde tumoren10. Wanneer ingebed als enkele cellen in ECM, een zeldzame subpopulatie van TUM622 cellen hebben de capaciteit om organoïden te vormen met acinaire-achtige structuren die een goede apical-basale cel polariteit weer te geven. Deze acinar-achtige structuren zijn hyperplastisch, vertonen heterogene expressie van stengel-achtige en differentiatie markers vergelijkbaar met de oorspronkelijke tumor, terwijl de resterende niet-invasieve, en dus na te bootsen de vroegste fase van lusc ontwikkeling. Belangrijk is dat we aantoonden dat de weefselarchitectuur van de acinaire-achtige structuren kan worden veranderd door remming van cel-intrinsieke signaleringstrajecten met kleine molecuulremmers of toevoeging van belangrijke componenten in de ECM, zoals CAFs, waarvan de laatste de acini-vorming verbetert en de acini verder uitlokt om invasief te worden wanneer ze in de nabijheid zijn. Samen suggereren deze gegevens dat dit 3D-cocultuursysteem van LUSC-organoïden een waardevol platform biedt voor het onderzoek naar de dynamische wederkerigheid tussen LUSC-cellen en de TME en kan worden aangepast voor het monitoren van de respons van LUSC-cellen op medicamenteuze behandeling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passaging en culturing TUM622 Cellen en CAFs in 2D Culturen
- Het doorgeven en kweken van TUM622 cellen
- Warm 3D kweekmedium en celdissociatiereagentia (zie Materiaaltabel) voor TUM622-cellen bij 37 °C.
- Passage TUM622 cellen bij 80% samenvloeiing in 2D-kolven. Meestal gebeurt dit 1 week na het passeren.
- Gooi oud medium uit een T75-kolf en was eenmaal met 6 mL HEPES-buffer. Vermijd pipetteren direct op de cellen.
- De HEPES-buffer aanzuigen. Voeg 4 mL trypsin/EDTA (0,25 mg/mL, zie Materiaaltabel)toe voor een snelle spoeling en gooi de trypsin/EDTA weg.
- Voeg 2 mL trypsin/EDTA toe en uitbroed bij 37 °C gedurende 5 min. Haal kolven uit de couveuse en tik op de kolven om de cellen los te maken zonder luchtbellen te maken en de kolven voor nog eens 5 min terug te brengen naar de couveuse.
OPMERKING: Langdurige blootstelling aan trypsine zal de cellen onomkeerbaar beschadigen en hun fenotype veranderen, dus het wordt aanbevolen om de tijd te beperken die cellen worden blootgesteld aan trypsine. - Bevestig cellen zijn losgemaakt en gescheiden onder een lichtmicroscoop (4x of 10x). Voeg 4 mL neutralisatiebuffer (TNS-buffer) (zie subcultuurreagenasinformatie in de Materiaaltabel)toe, gevolgd door 10 mL 3D-kweekmedium (zie Tabel met materialen).
- Pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen verder te scheiden met behulp van een 10 mL pipet. Breng de vering via een 40 μm celzeef over in een conische buis van 50 mL.
- Tel celnummers met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
- Zaad 0,8 x 106 cellen/T75-kolf in 20 mL 3D kweekmedium (zie Materiaaltabel).
- Voer de cellen om de andere dag door het vervangen van de helft van het gebruikte medium met vers medium.
- Het doorgeven en kweken van CAFs
- Passage CAFs wanneer cellen samenvloeiing bereiken. Meestal gebeurt dit na 5 dagen van het kweken van een 1:2 split.
- Bereid CAF medium met behulp van RPMI basale medium met 20% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 1% L-Glutamine en 1% Penicilline / Streptomycine. Verwarm het medium tot 37 °C.
- Spoel in een T75-kolf CAF's met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) eenmaal toe en voeg vervolgens 2 mL trypsine/EDTA toe en uitbroed bij 37 °C gedurende 5 min.
- Observeer onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat cellen in de kolf zijn gescheiden (4x of 10x). Zo niet, verleng de incubatie nog 2-3 min.
- Zodra cellen zijn losgemaakt en gescheiden, voeg 10 mL 3D-kweekmedium toe om de trypsine/EDTA te neutraliseren en meerdere keren op en neer te pipetomen om de CAF's verder te scheiden.
- Breng de celvering over in een conische buis van 50 mL en draai op 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Gooi de supernatant weg en bretel de pellet opnieuw in een passend volume van 3D-kweekmedium (zie Tabel met materialen)en passage in twee nieuwe T75-kolven.
2. Beplating TUM622 Cellen in de Extracellulaire Matrix voor 3D Culturing
- De dag voor het experiment, dooi flesjes van kelder membraan matrix in een 4 °C koelkast 's nachts. Cooldown plastic pipetten (2 mL) en tips op -20 °C 's nachts.
LET OP: Niet alle veel kelder membraan matrix hebben dezelfde capaciteit om de 3D-groei van TUM622 cellen te ondersteunen. Daarom is het noodzakelijk om meerdere partijen keldermembraanmatrix te verwerven en te testen om degenen te identificeren die robuuste acini-vorming ondersteunen. Meestal vereist dit een hogere eiwitconcentratie (16-18 mg/mL) in de matrix. - Op de dag van het experiment, warm 3D cultuurmedium, HEPES buffer, trypsin/EDTA en trypsine neutralisatie buffer (TNS) in een waterbad van 37 °C. Neem vlak voor het opzetten van de cultuur de ontdooide keldermembraanmatrix uit de koelkast en zet het flesje op ijs.
- Koel de weefselkweekplaten af op een metalen platformkoeler die op ijs is geplaatst. Plaats centrifugebuizen op een metalen koelrek op ijs.
- Met behulp van TUM622 cellen verkregen uit stap 1.1.7, bereken het gewenste aantal cellen die nodig zijn voor beplating. Typisch, 15.000-30.0000 cellen zijn nodig per put van een 24-put plaat. Lagere dichtheid is meer geschikt voor beeldvorming en kwantificering, terwijl een hogere dichtheid de voorkeur heeft bij het verzamelen van cellen voor RNA-extractie of westerse vlekken.
- Breng celsuspensie over in een gekoelde centrifugebuis (elke buis met cellen voor drievoudbeplating) en spin met 300 x g in een hangende emmercentrifuge bij 4 °C gedurende 5 min.
- Aanzuigen van de supernatant zorgvuldig met een aspirating pipet bevestigd aan een ongefilterde tip (20 μL), waardoor ongeveer 100 μL van het medium in de buis (gebruik markeringen op de buis als een gids).
- Tik voorzichtig op de zijkant van de buis om de pellet los te maken en te scheiden voordat u deze terugbrengt naar het koelrek.
- Met behulp van de 2 mL voorgekoelde pipetten, meng de matrix voorzichtig door een paar keer op en neer te stampen terwijl het flesje in contact blijft met het ijs. Pipetteer met een gelijkmatige en matige snelheid, zodat er geen bellen worden geïntroduceerd in de matrix tijdens deze procedure.
- Breng het juiste volume van de matrix over in elke centrifugebuis. Voor beplating drievouden in een 24-put plaat, voeg 1,1 mL kelder membraan matrix aan elke buis.
- Met behulp van voorgekoelde tips, pipet de matrix in elke buis op en neer ongeveer 10 keer om een uniforme cel vering te maken.
- Breng 310 μL cel/matrixsuspensie over in elke put van een voorgekoelde 24-putplaat. De pipet wordt geplaatst in een hoek van 90° aan het plaatoppervlak en de suspensie toegevoegd aan het midden van de put. De suspensie moet zich verspreiden en de hele put bedekken zonder dat de plaat hoeft te kantelen.
- Om downstream immunofluorescentie analyse te vergemakkelijken, plaat de cel / matrix suspensie parallel in 2-put kamer dia's. Breng 100 μL cel/matrixvering over naar het midden van een put van 2-putkamerdia (zie Materiaaltabel). Hierdoor kan de matrix een koepelachtige structuur vormen met een veel kleiner volume.
- Breng de plaat en de kamer terug in een weefselkweekincubator en broed gedurende 30 min in om de matrix te laten stollen. Bestudeer de plaat/glijbaan onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat enkele cellen gelijkmatig worden verdeeld binnen de matrix (4x of 10x).
- Voeg 1 mL voorverwarmde 3D-cultuur compleet medium toe aan elke put en 1,5 mL 3D-kweekmedium aan elke put van de kamerdia en breng ze vervolgens terug naar de couveuse.
3. 3D Coculturing van TUM622 Cellen en CAF's in de Extracellulaire Matrix
- Bereid celsuspensen van TUM622 en CAF's voor volgens sectie 2.
- Tel de CAF-celdichtheid door 10 μL celsuspensie in te nemen en te mengen met 10 μL trypanblauw.
- Voeg 10 μL van het mengsel toe aan elk van de twee kamers op een hemacytometer om de celdichtheid te tellen en te berekenen.
OPMERKING: CAF's hebben onregelmatige vormen en kunnen niet nauwkeurig worden geteld op een automatische celteller. - Co-inbedding tum622 cellen en CAF's in kelder membraan matrix
- Bereken op basis van de celdichtheidsinformatie het gewenste aantal cellen dat wordt gebruikt voor beplating. CAF's worden gezaaid bij een 2:1 verhouding van TUM622 cellen. Voor 30.000 TUM622-cellen die zijn ingezaaid, zijn bijvoorbeeld 60.000 CAF's mede-ingebed.
- Breng het juiste volume van TUM622 en CAFs celvering over in dezelfde centrifugebuis en volg stappen 2.5-2.11 voor beplating in 24-well platen. Voor immunofluorescentie mengt 60 μL TUM622/CAFs naar kamerdia's zoals beschreven in stap 2.12).
- Coculturing TUM622 met bedekte CAF's in keldermembraanmatrix (zie Tabel met materialen)
- Opzetten TUM622 mono-cultuur volgens stappen 2.5-2.13.
- Breng twee maal het aantal CAFs-suspensie (in vergelijking met het aantal INgezaaide TUM622-cellen) over in een centrifugebuis en spin op 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Aanzuigen van de supernatant en resuspend de CAFs in 1 mL van 3D cultuur medium.
- Breng de 1 mL CAFs-suspensie over naar de put die de ingebedde TUM622-cellen bevat.
4. Oogsten TUM622 Acini voor RNA/Eiwitextractie en Fluorescentie-geactiveerde Celsortering (FACS)
- Bereid de wasbuffer en de celoogstbuffer voor volgens het 3D-celoogstkitprotocol van de vorige dag en chill 's nachts bij 4 °C.
- Bewaar platen op een plaatkoeler en andere reagentia op ijs voordat u met het extractieproces begint.
- Aanzuigen media uit 3D-cultuur putten zonder het aanraken van de matrix en voorzichtig wassen de put 3 keer met 1 mL wasbuffer.
- Aanzuigen van de laatste wasbeurt en voeg 1 mL van de cel oogsten buffer aan elke put.
- Gebruik een p1000 pipet tip om de matrix af te schrapen van elke put.
- Pipetteer op en neer om de matrix verder te scheiden.
- Breng 1 mL van de mix over op een voorgekoelde conische buis van 15 mL. Voeg nog eens 1 mL oogstbuffer toe aan dezelfde put.
- Herhaal stap 4.5-4.7 en breng alle mix van dezelfde put over in één conische buis van 15 mL.
- Sluit de buizen af en laat 30 min op 4 °C.
- Vul elke buis met ijskoude PBS tot 10 mL en centrifugeer vervolgens bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Aanzuigen van de supernatant zonder het aanraken van de pellet. De supernatant moet matrixfragmenten bevatten, maar de sferoïden moeten allemaal worden verzameld aan de onderkant van de buis.
- Voeg ijskoude PBS toe voor een tweede wasbeurt. Keer de buis een paar keer om de pellet te scheiden. Draai naar beneden op 300 x g voor 5 min.
- Bereid tijdens het spinnen een lysisbuffer voor voor eiwit- en RNA-verzameling.
- Trek de supernatant zorgvuldig aan en voeg lysisbuffer toe voor downstream verwerking om eiwitten of RNA te verzamelen. Als alternatief kunnen cellen opnieuw worden opgeschort voor stroomanalyse /FACS-sortering of seriële passaging.
5. Immunofluorescentie van TUM622 Acini
- Bereid immunofluorescentiebuffer voor (IF-buffer: PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA), 0,2% Triton X-100 en 0,05% Tween-20), primaire blokkeringsbuffer (IF-buffer met 10% geitenserum), secundaire blokkeringsbuffer (primaire blokkeringsbuffer met 20 μg/mL geitanti-muis F(ab')2)
- Aanzuigen medium van 2-goed kamer dia's, spoel een keer met PBS en zet de dia op metalen plaat koeler op ijs. De kamerschuif moet de rest van het protocol op de metalen plaatkoeler blijven.
- Voeg voorgekoelde 4% PFA toe om de acini te repareren en 20 min op ijs in te broeden.
- Verwijder 4% PFA en was drie keer met 2 mL voorgekoelde PBS elk gedurende 5 min met zacht rocken op een rocker.
- Aspirate PBS en permeabilize met 1,5 mL van 0,5% Triton X-100 in PBS (voorgekoeld) gedurende 20 min. Tegen het einde van deze procedure zal de koepelachtige structuur losraken.
- Trek voorzichtig de permeabilisatiebuffer van de kamerschuif aan om monsterverlies te voorkomen. Dit wordt bereikt door een fijne tip (20 μL) aan de aspirating pipet toe te voegen en de punt naar de hoek van de kamer te drukken.
- Was drie keer met 2 mL voorgekoelde PBS elk gedurende 5 min met zacht rocken op een rocker.
- Blokkeer het monster met de primaire blokkeringsbuffer op ijs gedurende 1 uur.
- Verwijder de primaire blokkeringsbuffer en voeg secundaire blokkeringsbuffer toe en blokkeer gedurende 30 min.
- Voeg primaire antilichamen toe in de primaire blokkeringsbuffer en bebroed 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: De concentratie van de hier gebruikte antilichamen moet hoger zijn dan normaal gebruikt voor kleuringscellen in de 2D-cultuur. De meeste primaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, worden verdund bij 1:100 verdunning (zie Tabel met materialen). - Verwijder primaire antilichamen en was het monster 3 keer met 2 mL koude IF-buffer.
LET OP: De monsters kunnen los zijn, extra voorzichtig zijn bij het aspirating. - Bebroed de monsters in secundaire antilichamen verdund in primaire blokkeringsbuffer gedurende 1 uur bij RT. De voorkeur secundaire antilichamen moeten zeer cross-adsorbed om achtergrond kleuring te verminderen. De meeste secundaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, worden verdund bij 1:200 verdunning.
- Verwijder secundaire antilichamen en was het monster 3 keer met 2 mL koude IF-buffer.
LET OP: De monsters kunnen los zijn, extra voorzichtig zijn bij het aspirating. - Voeg PBS met DAPI (1:1.000 verdunning) toe tijdens de laatste wasbeurt om de kern te bevlekken. Het uitvoeren van een andere 2 wasbeurten in PBS.
- Beeld de monsters op een confocale microscoop binnen 3 dagen.
OPMERKING: Vanwege de grootte van de organoïden en grenzen in de werkafstand van het doel, worden monsters meestal afgebeeld op 10x of 20x vergroting.
6. 3D-cultuurmonsters voorbereiden op immunohistochemie
- Aanzuigenmedium van 2-put kamerdia's en één keer spoelen met PBS.
- Fix 3D culturen in 4% PFA bij 37 °C 's nachts.
- Verwijder 4% PFA, omring culturen met 2,5 mL histologie monstergel (zie Tabel met materialen) en plaats de dia op 4 °C om te stollen voor ten minste 1 uur.
- Breng monsters omgeven met histologische monstergel over naar weefselcassettes en 's nachts verwerkt in een geautomatiseerde weefselmonsterverwerker.
- Insluit monsters in paraffinewas en bereid je voor op het delenvan 12.
7. 3D Cytotoxiciteit Test voor Samengestelde Screening (Voorbeeld voor Een 96-well Plate)
- Zet een 96-put plaat op een plaat koeler, een 25 mL reservoir op een reservoir koeler en een 15 mL conische buizen op ijs voor het starten van het experiment.
- Bereid celmatrixsuspensen van TUM622-cellen voor in een voorgekoelde polypropyleenconische buis van 15 mL door het juiste volume keldermembraanmatrix aan cellen toe te voegen. De gewenste dichtheid voor TUM622 cellen is 10.000 cellen per 70-75 μL keldermembraanmatrix. Pipetteer een paar keer op en neer om zelfs het mengen van cellen binnen de matrix mogelijk te maken.
- Verplaats de plaat met plaatkoeler en reservoir met een reservoirkoeler weg van het ijs naar een droog oppervlak om contact van keldermembraanmatrix met ijs tijdens de overdracht te voorkomen.
- Breng het matrixcelmengsel over naar het koelreservoir zonder bellen te creëren.
- Breng met behulp van een mechanische meerkanaals pipet (10-300 μL) 70-75 μL van de mengcellen over in elke geschikte put van een 96-put.
- Incubeer plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min voor de keldermembraanmatrix om te stollen.
- Voeg 100 μL media toe in alle rijen en breng de plaat terug naar de couveuse.
- Start samengestelde doseren de volgende dag of later, afhankelijk van het doel van het experiment.
- Sferoïden kunnen worden opnieuw gevoed en opnieuw gedoseerd om de 2-3 dagen voor maximaal 10 dagen, door het verwijderen van gebruikte media met een 8- of 12-put vacuüm spruitstuk en vervangen door verse media met of zonder gewenste verbindingen.
- Het aantal TUM622 sferoïden kan worden gekwantificeerd met behulp van 3D imager volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TUM622 en CAF's in 2D cultuur
Figuur 1 presenteert de typische morfologie van TUM622 cellen en CAF's in de 2D-cultuur. TUM622 cellen zijn afgerond met grote kernen, terwijl CAFs zijn plat en langwerpig. TUM622 cellen kunnen 80%-90% samenvloeiing in cultuur bereiken. Verdere proliferatie leidt tot meer, maar kleinere cellen samengevoegd in kolonies die niet in direct contact komen. In tegenstelling, CAFs de voorkeur aan groeien bij een hogere celdichtheid en zal blijven vermenigvuldigen op volledige samenvloeiing als er voldoende voedingsstoffen worden verstrekt.
Groei en morfologie van TUM622 acini in 3D ECM
Figuur 2 presenteert een tijds-gangen experiment van TUM622 cellen gezaaid in 3D-cultuur. Gegevens tonen aan dat enkele TUM622 cellen in staat zijn organoïden te vormen met acinaire-achtige morfologieën wanneer ingebed. Tussen dag 5 en 7 wordt een lumen zichtbaar in de acinaire-achtige structuren en blijft daarna hol(figuur 2A). Elke acinus, samengesteld uit een monolaag van cellen rond het holle lumen, geeft een goede apical-basale polariteit vergelijkbaar met die van longepitheel in vivo (figuur 2B). Deze acinaire-achtige structuren zijn hyperplastisch en blijven groeien zolang er voldoende voedingsstoffen aanwezig zijn. De cultuur kan tot 24 dagen worden gehandhaafd voordat de ECM volledig uiteenvalt (figuur 2C). Door verdunningstest (LDA) (niet getoonde gegevens) te beperken, wordt geschat dat slechts een zeldzame subpopulatie van TUM622-cellen (<0,02%) hebben de capaciteit om acinaire structuren te vormen9.
Groei en morfologie van tum622-CAFs cocultuur
Figuur 3 toont de opzet en representatieve resultaten van TUM622-CAF coculturen. CAF's kunnen worden geïntegreerd in de cocultuur door ofwel overteleggen op de top van de matrix of co-embedded met de TUM622 cellen. Ongeacht de opstelling, de aanwezigheid van CAFs sterk versterkt het aantal en de grootte van de sferoïden gevormd (Figuur 3B). Interessant is dat wanneer TUM622 acini in de nabijheid komen van CAF's, ze de acini aanzetten om invasief te worden en migreren naar de CAF's, waardoor "tear-drop" zoals structuren(figuur 3C) wordt gevormd. Merk op dat TUM622 acini in monocultuur geen invasief gedrag vertonen en alleen "tear-drop" vormen zoals structuren wanneer ze in de buurt van CAFs staan.
Representatieve immunofluorescentie en immunohistochemie kleuringresultaten
Figuur 4 toont representatieve resultaten van immunofluorescentie en immunohistochemie kleuring van TUM622 acini na 10 dagen kweken. Confocale beelden werden genomen op het equatoriale vlak van immunofluorescerend gekleurdtum622 acini (figuur 4A). Elke sectie van het immunohistochemiemonster kan daarentegen acini vangen op verschillende vlakken (figuur 4B). Beide resultaten toonden heterogene expressie van stamachtige en gedifferentieerde cellen binnen elk acinus.
TUM622 3D cytotoxiciteit test met behulp van een Wnt-padremmer
Figuur 5 toont de dosisrespons van TUM622 acini behandeld met XAV939, een tankyrase-remmer (figuur 5A,B). XAV939 werd toegevoegd aan de cultuur 1 dag na beplating en verfrist om de 2 dagen voor een totaal van 10 dagen. Aan het einde van het experiment werd het aantal acini gekwantificeerd door een imager. Brightfield beelden bij hogere vergroting werden ook verworven om de morfologie van sferoïden in controle versus XAV939-behandelde putten(Figuur 5C) vast te leggen. Over het algemeen geeft XAV939 dosisafhankelijke remming weer op acinivorming en verandert de weefselarchitectuur van de gevormde sferoïden. Deze resultaten suggereren dat activering van de canonieke Wnt-route vereist is tijdens TUM622 acinaire morfogenese.
Figuur 1: TUM622 en CAF's in 2D-cultuur. Representatieve heldere-veld beelden van TUM622 cellen en CAFs gekweekt in 2D. Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al.9 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Groei en morfologie van TUM622 acini in 3D ECM. (A) Time course beelden van TUM622 cellen gekweekt in kelder membraan matrix over een periode van 10 dagen. Schaalstaaf = 100 μm. (B) Immunofluorescentie van TUM622 acini gekleurd met apical-basale celpolariteitmarkers, Golgi-enzym (GM-130, groen, apical) en Integrin alpha 6 (CD49f, basale, red). (C) Kwantificering van acini nummer (rechts y-as, rood) en de gemiddelde grootte van acini (linker y-as, blauw) verguld in drievoud in een 24-goed plaat over 24 dagen in de cultuur. Foutbalken vertegenwoordigen SD. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al.9 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Groei en morfologie van tum622-CAFs cocultuur. (A) Schematische tekening van de opstelling van TUM622-CAFs cocultuur. CAF's zijn bedekt of co-embedded met TUM62 cellen in ECM. Na 6-12 dagen in cocultuur, TUM622 cellen zijn in staat om meer en grotere acini in vergelijking met mono-cultuur te vormen en binnen te vallen de ECM wanneer in de nabijheid en direct contact met CAFs. Merk op dat het invasieve fenotype alleen kon worden waargenomen in de co-cultuur. (B) Brightfield beeld van TUM622 3D culturen in de aanwezigheid of afwezigheid van bedekte CAFs na 8 dagen. Schaalbalken = 200 μm. (C) Brightfield-afbeeldingen met scheurdruppelvormige acini-vorming in coculturen, ongeacht CAF's, zijn bedekt of co-embedded in de ECM. Schaalbalken = 200 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al.9 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve immunofluorescentie en immunohistochemie kleuringresultaten. (A) Antilichaamkleuring van acini met markers van stamcellen/voorlopercellen (CXCR4 en SOX2), mesenchyme (Vimentin), epitheeldifferentiatie (Involucrin), apoptose (Cleaved-Caspase-3) en proliferatie (Ki67) in groen, DAPI in blauw, E-cadherin en Phalloidin in het rood. Schaalbalk = 50 μm. (B) Immunohistochemie op FFPE-secties van TUM622 acini. Schaalbalk = 100 μm (boven) en 50 μm (onder). Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al.9 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: TUM622 3D cytotoxiciteittest met behulp van een Wnt-padremmer. (A) Kwantificering van sferoïde getallen in een 96-put plaat waar TUM622 cellen werden behandeld met dimethylsulfoxide (Control) of XAV939. Elke voorwaarde wordt in drievouden weergegeven. Foutbalken vertegenwoordigen SD. (B) Hele put beelden van een 24-put plaat genomen met een imager met de remmende effecten van XAV939 op acini vorming. (C) Representatieve brightfield beelden van de controle vs behandeld putten waaruit de morfologische veranderingen veroorzaakt door XAV939 behandeling. Schaalbalken = 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Chen et al.9 en gebruikt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumoren zijn heterogene weefsels samengesteld uit kankercellen naast elkaar bestaande met stromalcellen zoals kanker-geassocieerde fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen binnen de ECM. Samen, deze diverse componenten cross-talk en invloed op de tumor micro-omgeving, het spelen van een actieve rol in het stimuleren van tumorigenese, een proces dat progressieve veranderingen in tumorarchitectuur impliceert. Idealiter moet een in vitro model van tumorontwikkeling in staat zijn om de dynamische weefselarchitecturale veranderingen in menselijke tumoren in vivo vast te leggen, het complexe samenspel van diverse celtypen binnen de tumormicroomgeving en tegelijkertijd experimentele manipulatie op zowel de tumorcellen als de componenten in de TME. Hoewel er de laatste jaren veel vooruitgang is geboekt in 3D-kankermodellen, zijn dergelijke modellen niet gemakkelijk beschikbaar voor LUSC. De meeste modellen die tot op heden zijn gerapporteerd, bevatten slechts enkele aspecten van deze belangrijke functies. Hier rapporteren we de methoden voor een 3D cocultuursysteem van LUSC dat tegelijkertijd belangrijke weefselarchitecturale veranderingen vastlegt die tijdens de ontwikkeling van lusc worden waargenomen, evenals dynamische interacties tussen tumorcellen en belangrijke componenten van de TME, waaronder de ECM en CAF's.
Het vermogen van dit systeem om weefselarchitecturale veranderingen nauwkeuriger te modelleren is gebaseerd op de unieke eigenschap van TUM622-cellen bij het vormen van organoïden met acinaire-achtige morfologieën wanneer ingebed in 3D EC. Gevormd uit een zelfvernieuwende eencellig, is elke acinus samengesteld uit een monolaag van cellen rond een holle lumen. Deze monolaag van cellen vertoont apical-basale celpolariteit en blijft niet-invasief, die lijkt op de weefselarchitectuur van het longepitheel. Terwijl TUM622 als een 3D mono-cultuur hyperplastische groei weergeeft, verbetert de toevoeging van CAF's de acinaire morfogenese verder en induceert meer en grotere acini om zich te vormen. Belangrijk is dat CAFs dynamische weefselarchitecturale veranderingen in TUM622-cellen aanroepen wanneer de twee celtypen in de nabijheid komen, waardoor de TUM622-cellen hun apical-basale polariteit kunnen verliezen en de matrix naar de CAF's kunnen binnendringen. Deze fenotypische veranderingen recapituleren zowel vroege hyperplasie als late invasieve stadia van LUSC.
In tegenstelling tot veel tumor sferoïde modellen waarbij elke sferoïde wordt gevormd door aggregatie van vele cellen, is elke TUM622 acinus afgeleid van een enkele cel9. Door in vitro LDA wordt geschat dat slechts een kleine subpopulatie (≤0,02%) van TUM622 cellen hebben een dergelijke capaciteit9. Hoewel zeldzaam, konden deze cellen zichzelf vernieuwen zoals blijkt uit hun vermogen om seriële passaging ondergaan in 3D en onderscheiden in een heterogene populatie van cellen vergelijkbaar met die van de oorspronkelijke tumor. Vanwege deze unieke eigenschap van TUM622 cellen, is het van cruciaal belang om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van enkele TUM622 cellen binnen de ECM op het moment van beplating voor succesvolle kweek- en downstream-analyse. Om dit doel te bereiken, moeten verschillende belangrijke punten zorgvuldig worden gevolgd in het protocol, waaronder de bepaling van de juiste zaaidichtheid, het koel houden van alle gereedschappen en reagentia tijdens het mengen van cellen en matrix om voortijdige stolling te voorkomen, het vermijden van de introductie van bellen tijdens het mengproces en het toestaan van voldoende tijd voor matrix om volledig te stollen voordat het toevoegen van kweekmedium. Samen zullen deze voorzorgsmaatregelen helpen om een meer uniforme matrix substraat en cultuur conditie voor alle ingebedde cellen te bereiken.
Eenmaal met succes vastgesteld, kan deze cultuur worden gebruikt voor een verscheidenheid van downstream-analyses om de cel en biochemische proces dat tumorigenese reguleren ontleden. Het aantal en de grootte van acini gevormd in elke put kan worden gecontroleerd in de tijd met heldere veld imagers en gebruikt als een uitlezing voor de proliferative en zelfvernieuwing capaciteit van TUM622 cellen. Meer gedetailleerde dynamiek in de morfogenese van elke acinus kan worden waargenomen met live-imaging op een confocale microscoop, met of zonder verschillende etikettering kleurstoffen. Het geconditioneerde medium kan worden verzameld op meerdere tijdpunten tijdens de cultuurperiode voor het analyseren van oplosbare factoren die kunnen bemiddelen cel-cel of cel-matrix cross-talks. TUM622-cellen die rechtstreeks uit de ECM worden geëxtraheerd met protocol 4 zijn geschikt voor RNA- en eiwitextractie voor genexpressieanalyse, stroomcytometriekwantificering of FACS-sortering op basis van celoppervlakmarkers. Als alternatief kunnen de culturen worden vastgesteld voor in situ immunofluorescentie of immunohistochemie studies om de ruimtelijk-temporele verdelingen van verschillende markers te begrijpen. Hoewel vergelijkbaar, immunohistochemie vormt een aanvulling op immunofluorescentie methoden in die zin dat het mogelijk maakt de bemonstering van hele acini die mogelijk niet mogelijk zijn als gevolg van de beperkende imaging-diepte van de confocale doelstellingen. Voor beide methoden zijn de tijd en temperatuur waarop fixatie en permeabilisatie worden uitgevoerd van cruciaal belang, vooral gezien het feit dat TUM622-cellen zijn ingebed in een dichte matrix (>90% keldermembraanmatrix) in tegenstelling tot veel andere 3D-culturen waar matrixdichtheid is veel lager. Daarom is aandacht voor gestandaardiseerde en consistente fixatie en verwerking noodzakelijk om repliceerende resultaten te verkrijgen.
Met behulp van dit systeem als een platform, kan men vervolgens onderzoeken hoe cel-intrinsieke veranderingen in de tumorcellen, evenals cel-extrinsieke veranderingen in de tumor micro-omgeving, invloed epitheliale architectuur en model vroege gebeurtenissen die betrokken zijn bij carcinoma vorming. Bijvoorbeeld, de rollen van oncogenes of tumor suppressor genen in het reguleren van tumorweefsel architectuur kan worden bestudeerd door gain- of loss-of-function experiment gericht op het gen van belang in de tumorcellen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat overexpressie van SOX2, die vaak wordt waargenomen in LUSC, verandert het fenotype van TUM622 cellen, zoals blijkt uit een verlies van hyperplasie in 3D en progressie naar dysplastische groei9. Aan de andere kant, men zou kunnen vergelijken normale versus kanker-geassocieerde fibroblasten in cocultuur instellingen, bepalen hoe matrix componenten of de stijfheid impact acini groei / morfologie / invasie, en als het blokkeren van bepaalde cytokinen zou kunnen interfereren met cel-cel communicatie en op zijn beurt beïnvloeden weefsel architectuur en tumor progressie. Belangrijk is dat al deze testen kunnen worden uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde therapeutische middelen en worden gebruikt als een instrument om de drugrespons van LUSC-cellen te bepalen met een multidimensionale uitlezing11. Het is ook belangrijk op te merken dat dit systeem beperkt is met betrekking tot de paden die het zou kunnen worden gebruikt om te ondervragen, omdat slechts enkele, maar niet alle belangrijke signaleringstrajecten de groei en morfologie van TUM622-organoïden in de cultuur reguleren (d.w.z. remming van Wnt, maar niet Notch-signalering beïnvloedt acinaire mophogenese van TUM622-cellen)9.
Samengevat tonen we aan dat dit organoïde systeem een uniek platform biedt voor het genereren van nieuwe inzichten in het dynamische samenspel tussen LUSC-cellen en de tumormicroomgeving tijdens tumorprogressie. We verwachten dat ons modelsysteem een waardevol platform zal zijn voor medicijnontdekking en -ontwikkeling. In dit verband moet screening van nieuwe anti-kankertherapeutica in een native tumorweefselcontext helpen bij de selectie en ontwikkeling van effectievere therapieën die op LUSC zijn gericht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van Pfizer Inc.
Acknowledgments
Wij danken Magali Guffroy, John Kreeger, en Stephani Bisulco van de Pfizer-Oncologie Histopathologie en Biomarker groep voor pathologie / histologie ondersteuning en Michael Arensman voor kritische herziening van het manuscript. We danken ook het Pfizer Postdoctoral Program en de Oncology R&D groep, met name Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin en Jennifer Tejeda voor hun steun aan het programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
