Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie
Summary
Een in vitro model systeem werd ontwikkeld om weefsel architectonische veranderingen vast te leggen tijdens long plaveisel carcinoom (LUSC) progressie in een 3-dimensionale (3D) co-cultuur met kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). Dit organoïde systeem biedt een uniek platform om de rollen van diverse tumorcel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen te onderzoeken die het tumorfenotype moduleren.
Abstract
Tumor-stroma interacties spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van longplaveisel carcinoom (LUSC). Echter, begrijpen hoe deze dynamische interacties bijdragen aan weefsel architectonische veranderingen waargenomen tijdens tumorigenese blijft uitdagend vanwege het ontbreken van geschikte modellen. In dit protocol beschrijven we de generatie van een 3D cocultuurmodel met behulp van een LUSC primaire celcultuur bekend als TUM622. TUM622 cellen werden opgericht uit een LUSC patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en hebben de unieke eigenschap om acinar-achtige structuren te vormen wanneer gezaaid in een kelder membraan matrix. We tonen aan dat TUM622 acini in 3D cocultuur de belangrijkste kenmerken van weefselarchitectuur recapituleert tijdens LUSC-progressie en de dynamische interacties tussen LUSC-cellen en componenten van de tumormicroomgeving (TME), inclusief de extracellulaire matrix (ECM) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). We passen ons belangrijkste 3D-kweekprotocol verder aan om aan te tonen hoe dit systeem kan worden gebruikt voor verschillende downstream-analyses. Over het algemeen creëert dit organoïde model een biologisch rijk en aanpasbaar platform dat men in staat stelt om inzicht te krijgen in de cel-intrinsieke en extrinsieke mechanismen die de verstoring van epitheelarchitecturen tijdens carcinoma progressie bevorderen en zal helpen het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen en diagnostische markers.
Introduction
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte wereldwijd. Longplaveisel celcarcinoom (LUSC), dat is de tweede meest voorkomende vorm van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en is goed voor ongeveer 30% van alle longkanker, wordt vaak gediagnosticeerd in vergevorderde stadia en heeft een slechte prognose1. Behandeling opties voor LUSC patiënten zijn een grote onvervulde behoefte die kan worden verbeterd door een beter begrip van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen die LUSC tumorigenese rijden.
Zoals bij de meeste menselijke kankers, wordt de pathogenese van LUSC gekenmerkt door de verstoring van de intacte, goed geordende epitheelweefselarchitectuur2. Tijdens dit proces gaan goede apical-basale celpolariteit, celcel- en celmatrixcontacten verloren, waardoor ongecontroleerde groei en invasief gedrag van de tumorcellen mogelijk worden. Het wordt nu algemeen gewaardeerd dat de kwaadaardige kenmerken van kankercellen niet kunnen worden gemanifesteerd zonder een belangrijk samenspel tussen kankercellen en hun lokale tumor micro-omgeving (TME)3. Belangrijke componenten in de TME, waaronder extracellulaire matrix (ECM), kankergerelateerde fibroblasten (CAF’s) en endotheelcellen en infiltrerende immuuncellen geven actief vorm aan de TME en drijft tumorigenese4aan. Niettemin, onze huidige begrip van hoe de tumorcellen en deze belangrijke componenten in de TME interactie om weefsel architectonische veranderingen rijden tijdens LUSC progressie is zeer beperkt.
Driedimensionale (3D) cultuur is een belangrijk instrument om de biologische activiteiten van cel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen in het reguleren van weefsel architecturale veranderingen in zowel normale als zieke weefsels5te bestuderen. 3D-culturen bieden de juiste structurele en functionele context die meestal ontbreekt in traditionele tweedimensionale (2D) culturen. De toegevoegde afmetingen van dergelijke systemen bootsen weefsel in vivo nauwer na in vele aspecten van celfysiologie en cellulair gedrag, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie, eiwitexpressie en reactie op medicamenteuze behandeling. In de afgelopen jaren hebben inspanningen van verschillende laboratoria geleid tot de ontwikkeling van in vitro 3D-modellen voor zowel de normale long als NSCLC6,7,8. Echter, een model voor longplaveisel carcinoom dat zowel de dynamische weefsel architectonische veranderingen tijdens tumorigenese kan samenvatten als nemen van belangrijke stromal componenten was niet beschikbaar.
Hier beschrijven we de methoden voor het opzetten van een nieuwe 3-dimensionale (3D) cocultuur systeem met behulp van primaire PDX-afgeleide LUSC cellen (tum622) en CAFs9,10. Zowel TUM622 als CAFs zijn afgeleid van NSCLC-patiënt met slecht gedifferentieerde tumoren10. Wanneer ingebed als enkele cellen in ECM, een zeldzame subpopulatie van TUM622 cellen hebben de capaciteit om organoïden te vormen met acinaire-achtige structuren die een goede apical-basale cel polariteit weer te geven. Deze acinar-achtige structuren zijn hyperplastisch, vertonen heterogene expressie van stengel-achtige en differentiatie markers vergelijkbaar met de oorspronkelijke tumor, terwijl de resterende niet-invasieve, en dus na te bootsen de vroegste fase van lusc ontwikkeling. Belangrijk is dat we aantoonden dat de weefselarchitectuur van de acinaire-achtige structuren kan worden veranderd door remming van cel-intrinsieke signaleringstrajecten met kleine molecuulremmers of toevoeging van belangrijke componenten in de ECM, zoals CAFs, waarvan de laatste de acini-vorming verbetert en de acini verder uitlokt om invasief te worden wanneer ze in de nabijheid zijn. Samen suggereren deze gegevens dat dit 3D-cocultuursysteem van LUSC-organoïden een waardevol platform biedt voor het onderzoek naar de dynamische wederkerigheid tussen LUSC-cellen en de TME en kan worden aangepast voor het monitoren van de respons van LUSC-cellen op medicamenteuze behandeling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumoren zijn heterogene weefsels samengesteld uit kankercellen naast elkaar bestaande met stromalcellen zoals kanker-geassocieerde fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen binnen de ECM. Samen, deze diverse componenten cross-talk en invloed op de tumor micro-omgeving, het spelen van een actieve rol in het stimuleren van tumorigenese, een proces dat progressieve veranderingen in tumorarchitectuur impliceert. Idealiter moet een in vitro model van tumorontwikkeling in staat zijn om de dynamische weefselarchitecturale v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Magali Guffroy, John Kreeger, en Stephani Bisulco van de Pfizer-Oncologie Histopathologie en Biomarker groep voor pathologie / histologie ondersteuning en Michael Arensman voor kritische herziening van het manuscript. We danken ook het Pfizer Postdoctoral Program en de Oncology R&D groep, met name Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin en Jennifer Tejeda voor hun steun aan het programma.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
