Summary

Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

Een in vitro model systeem werd ontwikkeld om weefsel architectonische veranderingen vast te leggen tijdens long plaveisel carcinoom (LUSC) progressie in een 3-dimensionale (3D) co-cultuur met kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). Dit organoïde systeem biedt een uniek platform om de rollen van diverse tumorcel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen te onderzoeken die het tumorfenotype moduleren.

Abstract

Tumor-stroma interacties spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van longplaveisel carcinoom (LUSC). Echter, begrijpen hoe deze dynamische interacties bijdragen aan weefsel architectonische veranderingen waargenomen tijdens tumorigenese blijft uitdagend vanwege het ontbreken van geschikte modellen. In dit protocol beschrijven we de generatie van een 3D cocultuurmodel met behulp van een LUSC primaire celcultuur bekend als TUM622. TUM622 cellen werden opgericht uit een LUSC patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en hebben de unieke eigenschap om acinar-achtige structuren te vormen wanneer gezaaid in een kelder membraan matrix. We tonen aan dat TUM622 acini in 3D cocultuur de belangrijkste kenmerken van weefselarchitectuur recapituleert tijdens LUSC-progressie en de dynamische interacties tussen LUSC-cellen en componenten van de tumormicroomgeving (TME), inclusief de extracellulaire matrix (ECM) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). We passen ons belangrijkste 3D-kweekprotocol verder aan om aan te tonen hoe dit systeem kan worden gebruikt voor verschillende downstream-analyses. Over het algemeen creëert dit organoïde model een biologisch rijk en aanpasbaar platform dat men in staat stelt om inzicht te krijgen in de cel-intrinsieke en extrinsieke mechanismen die de verstoring van epitheelarchitecturen tijdens carcinoma progressie bevorderen en zal helpen het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen en diagnostische markers.

Introduction

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte wereldwijd. Longplaveisel celcarcinoom (LUSC), dat is de tweede meest voorkomende vorm van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en is goed voor ongeveer 30% van alle longkanker, wordt vaak gediagnosticeerd in vergevorderde stadia en heeft een slechte prognose1. Behandeling opties voor LUSC patiënten zijn een grote onvervulde behoefte die kan worden verbeterd door een beter begrip van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen die LUSC tumorigenese rijden.

Zoals bij de meeste menselijke kankers, wordt de pathogenese van LUSC gekenmerkt door de verstoring van de intacte, goed geordende epitheelweefselarchitectuur2. Tijdens dit proces gaan goede apical-basale celpolariteit, celcel- en celmatrixcontacten verloren, waardoor ongecontroleerde groei en invasief gedrag van de tumorcellen mogelijk worden. Het wordt nu algemeen gewaardeerd dat de kwaadaardige kenmerken van kankercellen niet kunnen worden gemanifesteerd zonder een belangrijk samenspel tussen kankercellen en hun lokale tumor micro-omgeving (TME)3. Belangrijke componenten in de TME, waaronder extracellulaire matrix (ECM), kankergerelateerde fibroblasten (CAF’s) en endotheelcellen en infiltrerende immuuncellen geven actief vorm aan de TME en drijft tumorigenese4aan. Niettemin, onze huidige begrip van hoe de tumorcellen en deze belangrijke componenten in de TME interactie om weefsel architectonische veranderingen rijden tijdens LUSC progressie is zeer beperkt.

Driedimensionale (3D) cultuur is een belangrijk instrument om de biologische activiteiten van cel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen in het reguleren van weefsel architecturale veranderingen in zowel normale als zieke weefsels5te bestuderen. 3D-culturen bieden de juiste structurele en functionele context die meestal ontbreekt in traditionele tweedimensionale (2D) culturen. De toegevoegde afmetingen van dergelijke systemen bootsen weefsel in vivo nauwer na in vele aspecten van celfysiologie en cellulair gedrag, waaronder proliferatie, differentiatie, migratie, eiwitexpressie en reactie op medicamenteuze behandeling. In de afgelopen jaren hebben inspanningen van verschillende laboratoria geleid tot de ontwikkeling van in vitro 3D-modellen voor zowel de normale long als NSCLC6,7,8. Echter, een model voor longplaveisel carcinoom dat zowel de dynamische weefsel architectonische veranderingen tijdens tumorigenese kan samenvatten als nemen van belangrijke stromal componenten was niet beschikbaar.

Hier beschrijven we de methoden voor het opzetten van een nieuwe 3-dimensionale (3D) cocultuur systeem met behulp van primaire PDX-afgeleide LUSC cellen (tum622) en CAFs9,10. Zowel TUM622 als CAFs zijn afgeleid van NSCLC-patiënt met slecht gedifferentieerde tumoren10. Wanneer ingebed als enkele cellen in ECM, een zeldzame subpopulatie van TUM622 cellen hebben de capaciteit om organoïden te vormen met acinaire-achtige structuren die een goede apical-basale cel polariteit weer te geven. Deze acinar-achtige structuren zijn hyperplastisch, vertonen heterogene expressie van stengel-achtige en differentiatie markers vergelijkbaar met de oorspronkelijke tumor, terwijl de resterende niet-invasieve, en dus na te bootsen de vroegste fase van lusc ontwikkeling. Belangrijk is dat we aantoonden dat de weefselarchitectuur van de acinaire-achtige structuren kan worden veranderd door remming van cel-intrinsieke signaleringstrajecten met kleine molecuulremmers of toevoeging van belangrijke componenten in de ECM, zoals CAFs, waarvan de laatste de acini-vorming verbetert en de acini verder uitlokt om invasief te worden wanneer ze in de nabijheid zijn. Samen suggereren deze gegevens dat dit 3D-cocultuursysteem van LUSC-organoïden een waardevol platform biedt voor het onderzoek naar de dynamische wederkerigheid tussen LUSC-cellen en de TME en kan worden aangepast voor het monitoren van de respons van LUSC-cellen op medicamenteuze behandeling11.

Protocol

1. Passaging en culturing TUM622 Cellen en CAFs in 2D Culturen Het doorgeven en kweken van TUM622 cellen Warm 3D kweekmedium en celdissociatiereagentia (zie Materiaaltabel) voor TUM622-cellen bij 37 °C. Passage TUM622 cellen bij 80% samenvloeiing in 2D-kolven. Meestal gebeurt dit 1 week na het passeren. Gooi oud medium uit een T75-kolf en was eenmaal met 6 mL HEPES-buffer. Vermijd pipetteren direct op de cellen. De HEPES-buffer aanzuigen. Voeg 4 mL tryp…

Representative Results

TUM622 en CAF’s in 2D cultuurFiguur 1 presenteert de typische morfologie van TUM622 cellen en CAF’s in de 2D-cultuur. TUM622 cellen zijn afgerond met grote kernen, terwijl CAFs zijn plat en langwerpig. TUM622 cellen kunnen 80%-90% samenvloeiing in cultuur bereiken. Verdere proliferatie leidt tot meer, maar kleinere cellen samengevoegd in kolonies die niet in direct contact komen. In tegenstelling, CAFs de voorkeur aan groeien bij een hoge…

Discussion

Tumoren zijn heterogene weefsels samengesteld uit kankercellen naast elkaar bestaande met stromalcellen zoals kanker-geassocieerde fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen binnen de ECM. Samen, deze diverse componenten cross-talk en invloed op de tumor micro-omgeving, het spelen van een actieve rol in het stimuleren van tumorigenese, een proces dat progressieve veranderingen in tumorarchitectuur impliceert. Idealiter moet een in vitro model van tumorontwikkeling in staat zijn om de dynamische weefselarchitecturale v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Magali Guffroy, John Kreeger, en Stephani Bisulco van de Pfizer-Oncologie Histopathologie en Biomarker groep voor pathologie / histologie ondersteuning en Michael Arensman voor kritische herziening van het manuscript. We danken ook het Pfizer Postdoctoral Program en de Oncology R&D groep, met name Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin en Jennifer Tejeda voor hun steun aan het programma.

Materials

Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

References

  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

View Video