폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템
Summary
시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.
Abstract
종양 기질 상호 작용은 폐 편평상피암 (LUSC)의 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 그러나, 이러한 동적 상호 작용이 종양 발생 중에 관찰 된 조직 건축 변화에 기여하는 방법을 이해하는 것은 적절한 모델의 부족으로 인해 도전 남아있다. 이 프로토콜에서는 TUM622로 알려진 LUSC 1차 세포 배양을 사용하여 3D 공동배양 모델의 생성을 설명합니다. TUM622 세포는 LUSC 환자 유래 이종이식(PDX)으로부터 확립되었으며 지하 막 매트릭스에서 파종될 때 acinar와 같은 구조를 형성하는 독특한 특성을 갖는다. 우리는 3D 공동 배양에 있는 TUM622 acini가 LUSC 진행 도중 조직 건축의 중요한 특징뿐만 아니라 LUSC 세포와 종양 미세 환경의 분대 (TME) 사이 동적 상호 작용을, 세포 외를 포함하여 재입증합니다 매트릭스 (ECM) 및 암 관련 섬유 아세포 (CAFs). 또한 주요 3D 배양 프로토콜을 적용하여 이 시스템이 다양한 다운스트림 분석에 어떻게 활용될 수 있는지 보여줍니다. 전반적으로,이 organoid 모델은 암진행 동안 상피 아키텍처의 중단을 촉진하고 도움이 될 세포 내재 및 외인성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수있는 생물학적으로 풍부하고 적응 가능한 플랫폼을 만듭니다. 새로운 치료 표적 및 진단 마커에 대한 검색.
Introduction
폐암은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC), 비 소세포 폐암의 두 번째로 일반적인 유형입니다 (NSCLC) 모든 폐암의 약 30 %를 차지, 종종 고급 단계에서 진단하고 가난한 예후를 가지고1. LUSC 환자를 위한 처리 선택권은 LUSC 종양 발생을 구동하는 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 더 나은 이해에 의해 향상될 수 있는 중요한 충족되지 않은 필요입니다.
대부분의 인간 암과 마찬가지로, LUSC의 병인은 손상되지 않은, 잘 정렬 된 상피 조직 아키텍처의 붕괴를특징으로한다 2. 이 과정에서 적절한 정점 기저 세포 극성, 세포 세포 및 세포 매트릭스 접촉이 손실되어 종양 세포의 통제되지 않은 성장과 침습적 행동을 허용합니다. 암세포와 이들의 국소 종양 미세환경(TME)3사이의 중요한 상호 작용 없이는 암세포의 악성 특징이 나타날 수 없다는 것이 널리 평가되고 있다. 세포외 매트릭스(ECM), 암 관련 섬유아세포(CAFs) 뿐만 아니라 내피 세포및 침투면역세포를 포함하는 TME의 주요 성분은 TME를 능동적으로 형성하고 종양발생을 유도한다4. 그럼에도 불구하고, 종양 세포와 TME에 있는 이 중요한 분대가 LUSC 진행 도중 조직 건축 변경을 몰기 위하여 상호 작용하는 방법의 우리의 현재 이해는 아주 제한됩니다.
3차원(3D) 배양은 정상 및 병이 있는 조직 모두에서 조직 건축적 변화 조절에 있어 세포 내재 및 외인성 변화의 생물학적 활동을 연구하는 중요한 도구5. 3D 문화권은 전통적인 2차원(2D) 문화권에서 일반적으로 부족한 적절한 구조적 및 기능적 컨텍스트를 제공합니다. 이러한 시스템의 추가된 치수는 증식, 분화, 이동, 단백질 발현 및 약물 치료에 대한 반응을 포함하는 세포 생리학 및 세포 행동의 많은 양상에서 생체 내 조직을 보다 밀접하게 모방한다. 최근 몇 년 동안, 다양한 실험실의 노력은 정상 폐뿐만 아니라 NSCLC6,,7,,8모두에 대한 시험관 내 3D 모델의 개발로 이어졌다. 그러나, 종양 발생 동안 동적 조직 건축 적 변화를 모두 재현할 수 있을 뿐만 아니라 주요 기질 성분을 통합할 수 있는 폐 편평암종에 대한 모델은 사용할 수 없었다.
여기서, 우리는 1차 PDX 유래 LUSC 세포(TUM622)와 CAFs9,,10을사용하여 새로운 3차원(3D) 동문화 시스템을 확립하는 방법을 설명한다. TUM622 및 CAF는 모두 제대로 분화된종양(10)을가진 NSCLC 환자로부터 유래된다. ECM에 단 하나 세포로 매립될 때, TUM622 세포의 희소한 소집단은 적당한 정점 기초 세포 극성을 표시하는 acinar 같이 구조물을 가진 오르가노이드를 형성하는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 acinar 같은 구조는 비침습적 남아있는 동안 본래 종양과 유사한 줄기 유사 및 분화 마커의 이질적인 발현을 표시하고, 따라서 LUSC 발달의 초기 단계를 모방한다. 중요한 것은, 우리는 acinar 같이 구조물의 조직 건축이 작은 분자 억제제와 세포 본질적인 신호 통로의 억제에 의해 변경될 수 있었다는 것을 보여주었습니다 또는 CAFs와 같은 ECM에 있는 중요한 분대의 추가, 후자는 acini 대형을 강화하고 더 가까운 근접에 있을 때 침략적이 되기 위하여 acini를 자극합니다. 함께, 이러한 데이터는 LUSC 오르가노이드의 이러한 3D 공동 배양 시스템이 LUSC 세포와 TME 사이의 동적 상호주의의 조사를 위한 귀중한 플랫폼을 제공하고 약물 치료에 대한 LUSC 세포의 반응을 모니터링하기 위해 적응될 수 있음을 시사한다11.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양은 ECM 내의 암 관련 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 기질 세포와 나란히 존재하는 암세포로 구성된 이기종 조직이다. 함께, 이러한 다양한 구성 요소는 교차 이야기와 종양 미세 환경에 영향을, 종양 발생을 구동에 적극적인 역할을, 종양 아키텍처에 있는 점진적인 변화를 수반하는 프로세스. 이상적으로, 종양 발달의 시험관내 모델은 생체 내에서 인간 종양에서 관찰되는 동적 조…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 병리학/조직학 지원을 위한 화이자-종양학 조직 병리학 및 Biomarker 그룹의 Magali Guffroy, 존 Kreeger 및 스테파니 비술코에게 감사하고 원고의 비판적인 검토를 위한 마이클 아렌스만. 우리는 또한 화이자 박사 후 프로그램과 종양학 R & D 그룹, 특히 로버트 아브라함, 푸자 사프라, 카렌 위드빈과 제니퍼 테제다 프로그램의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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