Sistema de cocultura multidimensional para modelar la progresión del carcinoma escamoso pulmonar
Summary
Se desarrolló un sistema modelo in vitro para capturar los cambios arquitectónicos del tejido durante la progresión del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) en un cocultivo tridimensional (3D) con fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Este sistema organoide proporciona una plataforma única para investigar las funciones de diversos cambios tumorales-intrínsecos y extrínsecos que modulan el fenotipo tumoral.
Abstract
Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel crítico en el desarrollo de carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). Sin embargo, entender cómo estas interacciones dinámicas contribuyen a los cambios arquitectónicos de tejido observados durante la tumorigenesis sigue siendo difícil debido a la falta de modelos apropiados. En este protocolo, se describe la generación de un modelo de cocultivo 3D mediante un cultivo de células primarias LUSC conocido como TUM622. Las células TUM622 se establecieron a partir de un xenoinjerto derivado del paciente LUSC (PDX) y tienen la propiedad única para formar estructuras similares a los acinares cuando se sembran en una matriz de membrana del sótano. Demostramos que TUM622 acini en la cocultura 3D recapitulan las características clave de la arquitectura de tejidos durante la progresión del LUSC, así como las interacciones dinámicas entre las células LUSC y los componentes del microambiente tumoral (TME), incluyendo el extracelular (ECM) y fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Adaptamos además nuestro protocolo principal de cultivo 3D para demostrar cómo se podría utilizar este sistema para diversos análisis posteriores. En general, este modelo organoide crea una plataforma biológicamente rica y adaptable que permite obtener información sobre los mecanismos celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la interrupción de las arquitecturas epiteliales durante la progresión del carcinoma y ayudarán a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores de diagnóstico.
Introduction
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que es el segundo tipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y representa aproximadamente el 30% de todo el cáncer de pulmón, a menudo se diagnostica en etapas avanzadas y tiene un mal pronóstico1. Las opciones de tratamiento para los pacientes con LUSC son una necesidad importante no satisfecha que puede mejorarse mediante una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que impulsan la tumorigenesis de LUSC.
Al igual que con la mayoría de los cánceres humanos, la patogénesis de LUSC se caracteriza por la interrupción de la arquitectura intacta y bien ordenada del tejido epitelial2. Durante este proceso, se pierden los contactos adecuados de polaridad celular apical-basal, célula salcelular y matriz celular, lo que permite un crecimiento incontrolado y un comportamiento invasivo de las células tumorales. Ahora se aprecia ampliamente que las características malignas de las células cancerosas no pueden manifestarse sin una interacción importante entre las células cancerosas y su microambiente tumoral local (TME)3. Componentes clave en el TME, incluyendo la matriz extracelular (ECM), fibroblastos asociados al cáncer (CAP), así como células endoteliales e infiltración de células inmunitarias dan forma activa al TME y controla la tumorigenesis4. Sin embargo, nuestra comprensión actual de cómo las células tumorales y estos componentes clave en el TME interactúan para impulsar los cambios arquitectónicos de tejido durante la progresión de LUSC es muy limitada.
El cultivo tridimensional (3D) es una herramienta importante para estudiar las actividades biológicas de los cambios celulares-intrínsecos y extrínsecos en la regulación de los cambios arquitectónicos de tejidos en los tejidos normales y enfermos5. Las culturas 3D proporcionan el contexto estructural y funcional adecuado que generalmente falta en las culturas bidimensionales tradicionales (2D). Las dimensiones añadidas de estos sistemas imitan más de cerca el tejido in vivo en muchos aspectos de la fisiología celular y los comportamientos celulares, incluyendo la proliferación, diferenciación, migración, expresión de proteínas y respuesta al tratamiento farmacológico. En los últimos años, los esfuerzos de varios laboratorios han llevado al desarrollo de modelos 3D in vitro tanto para el pulmón normal como para NSCLC6,7,8. Sin embargo, no estaba disponible un modelo para el carcinoma escamoso pulmonar que puede recapitular tanto los cambios arquitectónicos de tejido dinámico durante la tumorigenesis como incorporar componentes estromales clave.
Aquí, describimos los métodos para establecer un nuevo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas de PDX primarias (llamadas TUM622) y CAFs9,10. Tanto TUM622 como CAFs se derivan de un paciente NSCLC con tumores mal diferenciados10. Cuando se incrustan como células individuales en ECM, una subpoblación rara de células TUM622 tiene la capacidad de formar organoides con estructuras similares a los acinares que muestran la polaridad celular apical-basal adecuada. Estas estructuras similares a los acinares son hiperplásticas, muestran una expresión heterogénea de marcadores similares a los tallos y diferenciación similares al tumor original, sin dejar de ser invasivos, y por lo tanto imitan la etapa más temprana del desarrollo de LUSC. Es importante destacar que mostramos que la arquitectura tisular de las estructuras similares a los acinares podría ser alterada por la inhibición de las vías de señalización intrínsecas celulares con inhibidores de moléculas pequeñas o la adición de componentes clave en el ECM como los CIF, el último de los cuales mejora la formación de acini y provoca aún más que el acini se vuelva invasivo cuando está cerca. En conjunto, estos datos sugieren que este sistema de cocultivo 3D de organoides LUSC proporciona una plataforma valiosa para la investigación de la reciprocidad dinámica entre las células LUSC y el TME y podría adaptarse para monitorear la respuesta de las células LUSC al tratamiento farmacológico11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los tumores son tejidos heterogéneos compuestos de células cancerosas que coexisten lado a lado con células estromales como fibroblastos asociados al cáncer, células endoteliales y células inmunitarias dentro del ECM. Juntos, estos diversos componentes hablan cruzadamente e influyen en el microambiente tumoral, desempeñando un papel activo en la conducción de la tumorigenesis, un proceso que implica cambios progresivos en la arquitectura tumoral. Idealmente, un modelo in vitro de desarrollo tumoral debe ser capaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger y Stephani Bisulco del grupo Detopatología y Biomarcador de Pfizer-Oncología por su apoyo a la patología/histología y a Michael Arensman por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Programa Postdoctoral de Pfizer y al grupo de I+D oncológica, específicamente a Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin y Jennifer Tejeda por su apoyo al programa.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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