Summary

Sistema de cocultura multidimensional para modelar la progresión del carcinoma escamoso pulmonar

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

Se desarrolló un sistema modelo in vitro para capturar los cambios arquitectónicos del tejido durante la progresión del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) en un cocultivo tridimensional (3D) con fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Este sistema organoide proporciona una plataforma única para investigar las funciones de diversos cambios tumorales-intrínsecos y extrínsecos que modulan el fenotipo tumoral.

Abstract

Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel crítico en el desarrollo de carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). Sin embargo, entender cómo estas interacciones dinámicas contribuyen a los cambios arquitectónicos de tejido observados durante la tumorigenesis sigue siendo difícil debido a la falta de modelos apropiados. En este protocolo, se describe la generación de un modelo de cocultivo 3D mediante un cultivo de células primarias LUSC conocido como TUM622. Las células TUM622 se establecieron a partir de un xenoinjerto derivado del paciente LUSC (PDX) y tienen la propiedad única para formar estructuras similares a los acinares cuando se sembran en una matriz de membrana del sótano. Demostramos que TUM622 acini en la cocultura 3D recapitulan las características clave de la arquitectura de tejidos durante la progresión del LUSC, así como las interacciones dinámicas entre las células LUSC y los componentes del microambiente tumoral (TME), incluyendo el extracelular (ECM) y fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Adaptamos además nuestro protocolo principal de cultivo 3D para demostrar cómo se podría utilizar este sistema para diversos análisis posteriores. En general, este modelo organoide crea una plataforma biológicamente rica y adaptable que permite obtener información sobre los mecanismos celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la interrupción de las arquitecturas epiteliales durante la progresión del carcinoma y ayudarán a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores de diagnóstico.

Introduction

El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que es el segundo tipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y representa aproximadamente el 30% de todo el cáncer de pulmón, a menudo se diagnostica en etapas avanzadas y tiene un mal pronóstico1. Las opciones de tratamiento para los pacientes con LUSC son una necesidad importante no satisfecha que puede mejorarse mediante una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que impulsan la tumorigenesis de LUSC.

Al igual que con la mayoría de los cánceres humanos, la patogénesis de LUSC se caracteriza por la interrupción de la arquitectura intacta y bien ordenada del tejido epitelial2. Durante este proceso, se pierden los contactos adecuados de polaridad celular apical-basal, célula salcelular y matriz celular, lo que permite un crecimiento incontrolado y un comportamiento invasivo de las células tumorales. Ahora se aprecia ampliamente que las características malignas de las células cancerosas no pueden manifestarse sin una interacción importante entre las células cancerosas y su microambiente tumoral local (TME)3. Componentes clave en el TME, incluyendo la matriz extracelular (ECM), fibroblastos asociados al cáncer (CAP), así como células endoteliales e infiltración de células inmunitarias dan forma activa al TME y controla la tumorigenesis4. Sin embargo, nuestra comprensión actual de cómo las células tumorales y estos componentes clave en el TME interactúan para impulsar los cambios arquitectónicos de tejido durante la progresión de LUSC es muy limitada.

El cultivo tridimensional (3D) es una herramienta importante para estudiar las actividades biológicas de los cambios celulares-intrínsecos y extrínsecos en la regulación de los cambios arquitectónicos de tejidos en los tejidos normales y enfermos5. Las culturas 3D proporcionan el contexto estructural y funcional adecuado que generalmente falta en las culturas bidimensionales tradicionales (2D). Las dimensiones añadidas de estos sistemas imitan más de cerca el tejido in vivo en muchos aspectos de la fisiología celular y los comportamientos celulares, incluyendo la proliferación, diferenciación, migración, expresión de proteínas y respuesta al tratamiento farmacológico. En los últimos años, los esfuerzos de varios laboratorios han llevado al desarrollo de modelos 3D in vitro tanto para el pulmón normal como para NSCLC6,7,8. Sin embargo, no estaba disponible un modelo para el carcinoma escamoso pulmonar que puede recapitular tanto los cambios arquitectónicos de tejido dinámico durante la tumorigenesis como incorporar componentes estromales clave.

Aquí, describimos los métodos para establecer un nuevo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas de PDX primarias (llamadas TUM622) y CAFs9,10. Tanto TUM622 como CAFs se derivan de un paciente NSCLC con tumores mal diferenciados10. Cuando se incrustan como células individuales en ECM, una subpoblación rara de células TUM622 tiene la capacidad de formar organoides con estructuras similares a los acinares que muestran la polaridad celular apical-basal adecuada. Estas estructuras similares a los acinares son hiperplásticas, muestran una expresión heterogénea de marcadores similares a los tallos y diferenciación similares al tumor original, sin dejar de ser invasivos, y por lo tanto imitan la etapa más temprana del desarrollo de LUSC. Es importante destacar que mostramos que la arquitectura tisular de las estructuras similares a los acinares podría ser alterada por la inhibición de las vías de señalización intrínsecas celulares con inhibidores de moléculas pequeñas o la adición de componentes clave en el ECM como los CIF, el último de los cuales mejora la formación de acini y provoca aún más que el acini se vuelva invasivo cuando está cerca. En conjunto, estos datos sugieren que este sistema de cocultivo 3D de organoides LUSC proporciona una plataforma valiosa para la investigación de la reciprocidad dinámica entre las células LUSC y el TME y podría adaptarse para monitorear la respuesta de las células LUSC al tratamiento farmacológico11.

Protocol

1. Pasar y cultivar células TUM622 y CAFs en cultivos 2D Pasar y cultivar células TUM622 Reactivos cálidos de disociación de células y medios de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)para células TUM622 a 37oC. Pasaje de las células TUM622 al 80% de confluencia en matraces 2D. Por lo general, esto ocurre 1 semana después del passaging. Deseche el medio viejo de un matraz T75 y lave una vez con 6 ml de tampón HEPES. Evite pipetear directamente sobre las célu…

Representative Results

TUM622 y CAC en la cultura 2DLa Figura 1 presenta la morfología típica de las células TUM622 y los CAC en el cultivo 2D. Las células TUM622 se redondean con núcleos grandes, mientras que los CAC son planos y alargados. Las células TUM622 pueden alcanzar una confluencia del 80%-90% en el cultivo. Una mayor proliferación conduce a más, pero las células más pequeñas agregadas en colonias que no entran en contacto directo. Por el c…

Discussion

Los tumores son tejidos heterogéneos compuestos de células cancerosas que coexisten lado a lado con células estromales como fibroblastos asociados al cáncer, células endoteliales y células inmunitarias dentro del ECM. Juntos, estos diversos componentes hablan cruzadamente e influyen en el microambiente tumoral, desempeñando un papel activo en la conducción de la tumorigenesis, un proceso que implica cambios progresivos en la arquitectura tumoral. Idealmente, un modelo in vitro de desarrollo tumoral debe ser capaz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger y Stephani Bisulco del grupo Detopatología y Biomarcador de Pfizer-Oncología por su apoyo a la patología/histología y a Michael Arensman por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Programa Postdoctoral de Pfizer y al grupo de I+D oncológica, específicamente a Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin y Jennifer Tejeda por su apoyo al programa.

Materials

Bronchial Epithelial Growth Medium Lonza CC-3170 BEGM
Cell Strainer 40um ThermoFisher 352340 For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody Cell Signaling Technology 9661 (RRID:AB_2341188) Rabbit
CoolRack CFT30 Biocision BCS-138 For 3D culture
CoolSink XT96F Biocision BCS-536 For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit Bio-Techne 3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture) Bio-Techne 3443-005-01 For 3D culture
CXCR4 antibody Abcam Ab124824 (RRID:AB_10975635) Rabbit
E-cadherin antibody BD Biosciences 610182 (RRID:AB_397581) Mouse
GelCount Oxford Optronix For Acini counts and measurements
GM130 antibody BD Biosciences 610822 (RRID:AB_398141) Mouse
Goat Serum Vector Labs S1000 (RRID:AB_2336615) For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 For CAFs
Histology sample gel Richard Allan Scientific HG-4000-012 For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody Millipore Sigma Mab1378 (RRID:AB_2128317) Rat
Involucrin antibody Abcam Ab68 (RRID:AB_305656) Mouse
Ki67 antibody Abcam Ab15580 (RRID:AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155379 (2) For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System Nalge Nunc International 155409 (8) For 3D culture
L-Glutamine Gibco 25030-081 For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture) Corning 356231 For 3D culture
p63 antibody Cell Signaling Technology 13109 (SRRID:AB_2637091) Rabbit
Pen/Strep Gibco 15140-122 For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034 For TUM622 cell dissociation
RPMI ThermoFisher 11875-093 For CAFs
Sox2 antibody Cell Signaling Technology 3579 (RRID:AB_2195767) Rabbit
TrypLE Express Gibco 12604-021 For CAF dissociation
Vi-Cell Bechman Coulter Automatic cell counter
Vimentin antibody Abcam Ab92547 (RRID:AB_10562134) Rabbit
β-catenin antibody Cell Signaling Technology 2677s (RRID:AB_1030943) Mouse

References

  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).

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Cite This Article
Chen, S., Giannakou, A., Golas, J., Geles, K. G. Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression. J. Vis. Exp. (157), e60644, doi:10.3791/60644 (2020).

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