Summary
Ett in vitro-modellsystem utvecklades för att fånga vävnadarkitektoniska förändringar under lungskivepiteli (LUSC) progression i en 3-dimensionell (3D) co-kultur med cancer-associerade fibroblaster (CAFs). Detta organoidsystem ger en unik plattform för att undersöka rollerna av olika tumör cell-inneboende och extrinsic förändringar som modulerar tumör fenotyp.
Abstract
Tumor-stroma interaktioner spelar en avgörande roll i utvecklingen av lungskivepitelcancer (LUSC). Att förstå hur dessa dynamiska interaktioner bidrar till vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats under tumorigenesis är dock fortfarande utmanande på grund av bristen på lämpliga modeller. I det här protokollet beskriver vi genereringen av en 3D-coculturemodell med hjälp av en LUSC primärcellkultur som kallas TUM622. TUM622 celler etablerades från en LUSC patient-härledda xenograft (PDX) och har den unika egenskapen att bilda acinar-liknande strukturer när sådd i en källare membran matris. Vi visar att TUM622 acini i 3D coculture rekapitulera viktiga funktioner i vävnadarkitektur under LUSC progression samt dynamiska interaktioner mellan LUSC celler och komponenter i tumör mikromiljö (TME), inklusive extracellulära (ECM) och cancerrelaterade fibroblaster (CAFs). Vi anpassar vidare vårt huvudsakliga 3D-odlingsprotokoll för att visa hur detta system skulle kunna användas för olika nedströmsanalyser. Sammantaget skapar denna organoidmodell en biologiskt rik och anpassningsbar plattform som gör det möjligt för en att få insikt i de cellinneboende och yttre mekanismerna som främjar störningar av epitelialarkitekturer under carcinom progression och kommer att hjälpa sökandet efter nya terapeutiska mål och diagnostiska markörer.
Introduction
Lungcancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet i hela världen. Lung skivepitelcancer (LUSC), som är den näst vanligaste typen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och står för cirka 30% av all lungcancer, diagnostiseras ofta i avancerade stadier och har en dålig prognos1. Behandlingsalternativ för LUSC patienter är ett stort otillfredsställt behov som kan förbättras genom en bättre förståelse av de underliggande cellulära och molekylära mekanismer som driver LUSC tumorigenesis.
Som med de flesta mänskliga cancerformer kännetecknas patogenesen vid LUSC av störningar na i den intakta, välordnade epitelialvävnadsarkitekturen2. Under denna process, korrekt apikala-basalcell polaritet, cell-cell och cell-matris kontakter går förlorade, vilket möjliggör okontrollerad tillväxt och invasivt beteende av tumörcellerna. Det är nu allmänt uppskattat att de maligna funktionerna i cancerceller inte kan manifesteras utan ett viktigt samspel mellan cancerceller och deras lokala tumör mikromiljö (TME)3. Viktiga komponenter i TME inklusive extracellulär matris (ECM), cancer-associerade fibroblaster (CAFs) samt endotelceller och infiltrera immunceller aktivt forma TME och driver tumorigenesis4. Ändå är vår nuvarande förståelse av hur tumörcellerna och dessa nyckelkomponenter i TME interagerar för att driva vävnadsarkitektoniska förändringar under LUSC-progression en mycket begränsad.
Tredimensionell (3D) kultur är ett viktigt verktyg för att studera biologiska aktiviteter av cellinneboende och intrinsiska förändringar i regleringen av vävnad arkitektoniska förändringar i både normala och sjuka vävnader5. 3D-kulturer ger lämpligt strukturellt och funktionellt sammanhang som vanligtvis saknas i traditionella tvådimensionella (2D) kulturer. De extra dimensionerna av sådana system mer närmare efterlikna vävnad in vivo i många aspekter av cellfysiologi och cellulära beteenden, inklusive spridning, differentiering, migration, protein uttryck och svar på läkemedelsbehandling. Under de senaste åren har insatser från olika laboratorier lett till utvecklingen av in vitro 3D-modeller för både den normala lungan samt NSCLC6,7,8. Men en modell för lungskivepitelcancer som kan rekapitulera både den dynamiska vävnaden arkitektoniska förändringar under tumorigenesis samt införliva viktiga stromal komponenter var inte tillgänglig.
Här beskriver vi metoderna för att upprätta ett nytt 3-dimensionellt (3D) coculturesystem med hjälp av primära PDX-härledda LUSC-celler (kallas TUM622) och CAFs9,10. Både TUM622 och CAFs kommer från NSCLC patienten med dåligt differentierade tumörer10. När inbäddade som enstaka celler i ECM, en sällsynt subpopulation av TUM622 celler har kapacitet att bilda organoider med acinar-liknande strukturer som visar korrekt apikala-basalcell polaritet. Dessa acinar-liknande strukturer är hyperplastiska, visa heterogena uttryck för stam-liknande och differentiering markörer som liknar den ursprungliga tumören samtidigt som de förblir icke-invasiva, och därmed efterlikna det tidigaste skedet av LUSC utveckling. Viktigt, Vi visade att vävnadsarkitekturen i acinar-liknande strukturer kan ändras genom hämning av cellinneboende signalering vägar med små molekylhämmare eller tillägg av viktiga komponenter i ECM såsom CAFs, varav den senare förbättrar acini bildning och ytterligare provocerar acini att bli invasiv när i närheten. Tillsammans tyder dessa uppgifter på att detta 3D-co-culture system av LUSC organoider ger en värdefull plattform för undersökning av den dynamiska ömsesidighet mellan LUSC celler och TME och skulle kunna anpassas för övervakning av svaret från LUSC celler till läkemedelsbehandling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Översättning och odling AV TUM622 Celler och CAFs i 2D-kulturer
- Genom att övervälta och odla TUM622-celler
- Varm 3D-odling medium och cell dissociation reagenser (se Tabell över material)för TUM622 celler vid 37 °C.
- Passage TUM622 celler vid 80% confluency i 2D-flaskor. Vanligtvis inträffar detta 1 vecka efter översättningar.
- Kassera gammalt medium från en T75-kolv och tvätta en gång med 6 ml HEPES-buffert. Undvik att pipettera direkt på cellerna.
- Aspirera hepes buffert. Tillsätt 4 ml trypsin/EDTA (0,25 mg/ml, se Materialtabell)för en snabb sköljning och kassera trypsin/EDTA.
- Tillsätt 2 ml trypsin/EDTA och inkubera vid 37 °C i 5 min. Ta bort kolvar från inkubatorn och knacka på kolvarna för att lossa cellerna utan att skapa luftbubblor och returnera kolvar till inkubatorn i ytterligare 5 minuter.
OBS: Långvarig exponering för trypsin kommer oåterkalleligen skada cellerna och ändra deras fenotyp, vilket rekommenderas att begränsa den tid celler utsätts för trypsin. - Bekräfta att celler har lossnat och separerat under ett lätt mikroskop (4x eller 10x). Lägg till 4 ml neutraliseringsbuffert (TNS-buffert) (se information om omagens i subkultur i materialtabellen)följt av 10 ml 3D-odlingsmedium (se materialtabell).
- Pipette upp-och-ner försiktigt för att ytterligare separera cellerna med hjälp av en 10 mL pipett. Överför suspensionen genom en 40 μm cellsil till ett 50 mL koniskt rör.
- Räkna cellnummer med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
- Utsäde 0,8 x 106 celler/T75 kolv i 20 ml 3D-odlingsmedium (se materialtabell).
- Mata cellerna varannan dag genom att ersätta hälften av det använda mediet med färskt medium.
- Godkänd och odling av CAFs
- Passage CAFs när celler når sammanflödet. Vanligtvis inträffar detta efter 5 dagars odling från en 1:2 split.
- Förbered CAF medium med RPMI basal medium med 20% värme-inaktiverade fetala nötkreatur serum, 1% L-glutamin och 1% Penicillin/Streptomycin. Värm mediet till 37 °C.
- I en T75-kolv ska du skölja CAFs med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång och tillsätt sedan 2 ml trypsin/EDTA och inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Observera under ett lätt mikroskop för att säkerställa att cellerna har separerat i kolven (4x eller 10x). Om inte, förlänga inkubationen i ytterligare 2-3 min.
- När cellerna har lossnat och separerat, lägga till 10 ml 3D-odling medium för att neutralisera trypsin / EDTA och pipett upp och ner flera gånger för att ytterligare skilja CAFs.
- Överför cellfjädringen till ett 50 mL koniskt rör och snurra ner på 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i en lämplig volym 3D-odlingsmedium (se materialtabell)och passage till två nya T75-kolvar.
2. Plätering TUM622 Celler i extracellulär matris för 3D-odling
- Dagen före experimentet, tina injektionsflaskor av källaren membran matris i en 4 °C kylskåp över natten. Cooldown plast pipetter (2 mL) och tips på -20 °C över natten.
OBS: Inte alla massor av källaren membran matris har samma kapacitet att stödja 3D-tillväxten av TUM622 celler. Därför är det nödvändigt att förvärva och testa flera partier av källaren membran matris för att identifiera de som stöder robust acini bildning. Vanligtvis kräver detta en högre proteinkoncentration (16-18 mg/ml) i matrisen. - På experimentdagen, varm 3D-odling medium, HEPES buffert, trypsin / EDTA och trypsin neutralisering buffert (TNS) i en 37 ° C vattenbad. Omedelbart innan du ställer in kulturen, ta ut den tinade källarmembranmatrisen ur kylskåpet och lägg flaskan på is.
- Kyl ner vävnadsodlingsplattorna på en metallplattformskylare placerad på is. Placera centrifugrör på ett metallkylställ på is.
- Beräkna önskat antal celler som behövs för plätering med TUM622-celler från steg 1.1.7. Vanligtvis behövs 15 000-30 0000 celler per brunn på en 24-brunnsplatta. Lägre densitet är mer lämpad för avbildning och kvantifiering, medan högre densitet är att föredra vid insamling av celler för RNA-extraktion eller västra blotting.
- Överför cellfjädring till ett kylt centrifugrör (varje rör som innehåller celler för treplikatplätering) och snurra ner vid 300 x g i en hängande hinkcentrifug vid 4 °C i 5 min.
- Aspirera försiktigt över supernatanten med en aspirerad pipett fäst vid en ofiltrerad spets (20 μL), vilket ger cirka 100 μl medium i röret (använd markeringar på röret som en guide).
- Knacka försiktigt på sidan av röret för att lossa och ta loss pelleten innan du återför den till kylstället.
- Använd de 2 ml förkylda pipetterna, blanda försiktigt matrisen genom att pipetting upp och ner några gånger samtidigt som flaskan i kontakt med isen. Pipette med en jämn och måttlig hastighet så att inga bubblor införs i matrisen under detta förfarande.
- Överför matrisens lämpliga volym till varje centrifugrör. För plätering triplikatar i en 24-brunnsplatta, tillsätt 1,1 ml källarmembranmatris till varje rör.
- Med hjälp av förkylda spetsar, pipette matrisen i varje rör upp och ner ca 10 gånger för att göra en enhetlig cell fjädring.
- Överför 310 μL cell/matrissuspension i varje brunn på en förkyld 24-brunnsplatta. Pipetten placeras i 90° vinkel mot plattans yta och fjädringen tillsätts till brunnens mitt. Fjädringen ska spridas och täcka hela brunnen utan att behöva luta plattan.
- För att underlätta immunofluorescensanalys nedströms, platta cellen/matrissuspensionen parallellt med 2-brunnskammarediabilder. Överför 100 μL cell/matrissuspension till mitten av en brunn i 2-brunnskammarebild (se Materialtabell). Detta gör att matrisen kan bilda en kupol-liknande struktur med mycket mindre volym.
- Tillbaka plattan och kammaren glida tillbaka till en vävnad kultur inkubator och inkubera i 30 min så att matrisen stelnar. Undersök plattan/skjut under ett ljusmikroskop för att säkerställa att enskilda celler fördelas jämnt inom matrisen (4x eller 10x).
- Lägg till 1 ml förvärmd 3D-kultur komplett medium i varje brunn och 1,5 ml 3D-odling medium till varje brunn i kammaren bilden sedan tillbaka dem till inkubatorn.
3. 3D-kokulering av TUM622-celler och CAF:er i extracellulär matris
- Förbered cellsuspensioner av TUM622 och CAFenligt avsnitt 2.
- Räkna CAF-celltätheten genom att ta 10 μL cellfjädring och blanda den med 10 μL trypanblått.
- Tillsätt 10 μL av blandningen till var och en av de två kamrarna på en hemacytometer för att räkna och beräkna celltäthet.
CAF:er har oregelbundna former och kanske inte räknas korrekt på en automatisk cellräknare. - Co-inbäddning TUM622 celler och CAFs i källaren membran matris
- Baserat på information om celldensitet beräknar du önskat antal celler som används för plätering. CAFs är seedade med ett 2:1 förhållande av TUM622 celler. För 30 000 TUM622-celler som sås är 60 000 CAF-celler till exempel inbäddade.
- Överför lämplig volym TUM622 samt CAFs cellfjädring till samma centrifugrör och följ steg 2.5-2.11 för plätering i 24-brunnsplattor. För immunfluorescens, överför 60 μL TUM622/CAFs blandning till kammaren diabilder enligt beskrivningen i steg 2.12).
- Kokulera TUM622 med överdragna CAFs i källarmembranmatris (se Materialtabell)
- Ställ in TUM622 monoodling enligt steg 2,5-2,13.
- Överför dubbelt så många CAF:er fjädring (jämfört med antalet TUM622-celler som sås) till ett centrifugrör och snurra ner vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och återsuspend era cafs i 1 ml 3D-odlingsmedium.
- Överför 1 ml cafs suspension till brunnen som innehåller de inbäddade TUM622-cellerna.
4. Skörd TUM622 Acini för RNA/Protein Utvinning och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
- Förbered tvättbuffert och cellskördbuffert enligt 3D-cellskördssatsen föregående dag och kyl över natten vid 4 °C.
- Förvara plattorna på en plåtkylare och andra reagenser på is innan extraktionsprocessen påbörjas.
- Sug upp media från 3D-odlingsbrunnar utan att vidröra matrisen och tvätta försiktigt brunnen 3 gånger med 1 ml tvättbuffert.
- Aspirera den slutliga tvätten och tillsätt 1 ml cellskörd buffert till varje brunn.
- Använd en p1000 pipett spets för att skrapa matrisen bort av varje brunn.
- Pipette upp och ner för att ytterligare separera matrisen.
- Överför 1 ml av blandningen till ett förkylt 15 mL koniskt rör. Tillsätt ytterligare 1 ml skörd buffert till samma brunn.
- Upprepa steg 4,5-4,7, och överföra alla blandningar av samma brunn till en 15 ml konisk slang.
- Täck rören och berget vid 4 °C i 30 min.
- Fyll varje rör med iskalla PBS upp till 10 ml och centrifugera sedan vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten utan att röra pelleten. Supernatanten bör innehålla matrisfragment, men sfäroiderna bör alla samlas in längst ner i röret.
- Tillsätt iskall PBS för en andra tvätt. Vänd röret några gånger för att ta avstånd från pelleten. Snurra ner på 300 x g i 5 min.
- Under spinning, förbered lysbuffert för protein och RNA-kollektion.
- Sug försiktigt in supernatanten och tillsätt lysisbufferten för nedströmsbearbetning för att samla in protein eller RNA. Alternativt kan celler återsuspenderas för flödesanalys/FACS-sortering eller seriell överlysning.
5. Immunfluorescens av TUM622 Acini
- Förbered immunofluorescensbuffert (OM buffert: PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 0,2% Triton X-100 och 0,05% Tween-20), primär blockeringsbuffert (IF-buffert med 10% getserum), sekundär blockeringsbuffert (primär blockeringsbuffert med 20 μg/mL get anti-mus F(ab')2)
- Sugmedel från 2-brunnskammare diabilder, skölj en gång med PBS och ställ in bilden på metallplåtskylare på is. Kammaren sslide bör finnas kvar på metallplattan kylare för resten av protokollet.
- Tillsätt förkyld 4% PFA för att fixa acini och inkubera på is i 20 min.
- Ta bort 4% PFA och tvätta tre gånger med 2 ml förkyld PBS vardera i 5 min med mild gunga på en rocker.
- Aspirate PBS och permeabilize med 1,5 ml på 0,5% Triton X-100 i PBS (förkyld) i 20 min. I slutet av detta förfarande kommer kupolliknande struktur att lossna.
- Sug försiktigt upp permeabiliseringsbufferten från kammarens glidning för att undvika provförlust. Detta uppnås genom att lägga till en fin spets (20 μL) till aspirating pipetten och trycka spetsen mot hörnet av kammaren.
- Tvätta tre gånger med 2 ml förkyld PBS vardera i 5 min med mild gungning på en rocker.
- Blockera provet med den primära blockeringsbufferten på is i 1 h.
- Ta bort primär blockeringsbuffert och lägg till sekundär blockeringsbuffert och block i 30 min.
- Lägg till primära antikroppar i primär blockeringsbuffert och inkubera över natten vid 4 °C.
OBS: Koncentrationen av de antikroppar som används här bör vara högre än normalt används för färgning av celler i 2D-odling. De flesta av de primära antikroppar som används i denna studie späds ut vid 1:100 utspädning (se tabell över material). - Ta bort primära antikroppar och tvätta provet 3 gånger med 2 ml kall IF-buffert.
OBS: Proverna kan vara lösa, var extra försiktig när aspirerar. - Inkubera proverna i sekundära antikroppar som spädts ut i primär blockeringsbuffert i 1 h vid RT. De föredragna sekundära antikropparna bör vara mycket korsadsorbed för att minska bakgrundsfärgning. De flesta sekundära antikroppar som används i denna studie späds ut vid 1:200 utspädning.
- Ta bort sekundära antikroppar och tvätta provet 3 gånger med 2 ml kall IF-buffert.
OBS: Proverna kan vara lösa, var extra försiktig när aspirerar. - Tillsätt PBS med DAPI (1:1 000 utspädning) under den sista tvätten för att färga kärnan. Utföra ytterligare 2 tvättar i PBS.
- Bild av proverna på ett confokalmikroskop inom 3 dagar.
OBS: På grund av storleken på organoider och gränser i målets arbetsavstånd, prover na vanligtvis avvisas vid 10x eller 20x förstoring.
6. Förbereda 3D-odlingsprover för immunohistokemi
- Sugmedel från 2-brunnskammare glider och skölj en gång med PBS.
- Fixa 3D-kulturer i 4% PFA vid 37 °C över natten.
- Ta bort 4% PFA, omge kulturer med 2,5 ml histologi provgel (se tabell över material)och placera bilden vid 4 °C för att stelna i minst 1 h.
- Överför prover omgivna med histologisk provgel till vävnadskassetter och bearbetas i en automatiserad vävnadsprovprocessor över natten.
- Bädda in prover i paraffin vax och förbereda för snittning12.
7. 3D cytotoxicitet analys för sammansatta Screening (T.ex. för en 96-brunnsplatta)
- Ställ en 96-brunnsplatta på en plåtkylare, en 25 ml reservoar på en reservoarkylare och 15 ml koniska rör på is innan experimentet påbörjas.
- Förbered cellmatrissuspensioner av TUM622-celler i ett förkylt 15 ml polypropylenkoniskt rör genom att lägga till lämplig volym källarmembranmatris till celler. Önskad densitet för TUM622 celler är 10.000 celler per 70-75 μL av källaren membran matris. Pipette upp och ner några gånger för att tillåta även blandning av celler i matrisen.
- Flytta plattan med plåtkylare och behållare med en reservoarkylare bort från isen till en torr yta för att undvika kontakt med källarmembranmatris med is under överföringen.
- Överför matriscellblandningen till kylbehållaren utan att skapa bubblor.
- Med hjälp av en mekanisk flerkanalig pipett (10-300 μL) överför du 70-75 μL av blandningscellerna i varje lämplig brunn på en 96-brunnsplatta.
- Inkubera plattan vid 37 °C och 5% CO2 i 30 min för källaren membran matrisen stelna.
- Tillsätt 100 μL av media i alla rader och återför plattan till inkubatorn.
- Börja sammansatt dosering nästa dag eller senare beroende på målet för experimentet.
- Sfäroider kan återmatas och åter dosed var 2-3 dagar i upp till 10 dagar, genom att ta bort använt media med en 8- eller 12-brunn vakuum grenrör och ersätta med färska medier med eller utan önskade föreningar.
- Antalet TUM622 sfäroider kan kvantifieras med hjälp av 3D-bildare enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TUM622 och CAFs i 2D-kultur
Figur 1 presenterar den typiska morfologi av TUM622 celler och CAFs i 2D-kultur. TUM622 celler avrundas med stora kärnor medan CAFs är platta och långsträckta. TUM622 celler kan nå 80%-90% samfluens i kulturen. Ytterligare spridning leder till mer, men mindre celler aggregerade i kolonier som inte kommer i direkt kontakt. Däremot CAFs föredrar att växa vid högre celltäthet och kommer att hålla välstånd vid full sammanflödet om tillräckliga näringsämnen tillhandahålls.
Tillväxt och morfologi av TUM622 acini i 3D ECM
Figur 2 presenterar ett tidskursexperiment av TUM622-celler som är seedade i 3D-kultur. Data visar att enstaka TUM622-celler kan bilda organoider med acinarliknande morfoologier när de bäddas in. Mellan dag 5 och 7 blir en lumen uppenbar i acinarliknande strukturer och förblir ihålig därefter (figur 2A). Varje acinus, som består av ett monolager celler som omger den ihåliga lumen, visar korrekt apikal-basal polaritet liknande den i lungepitel in vivo(figur 2B). Dessa acinar-liknande strukturer är hyperplastiska och fortsätter att växa så länge tillräckliga näringsämnen tillhandahålls. Kulturen kan bibehållas i upp till 24 dagar innan ECM helt sönderfaller (figur 2C). Genom att begränsa utspädningsanalysen (LDA) (data som inte visas) uppskattas det att endast en sällsynt delpopulation av TUM622-celler (<0,02%) har kapacitet att bilda acinar-liknande strukturer9.
Tillväxt och morfologi av TUM622-CAFs coculture
Figur 3 visar inställningoch representativa resultat av TUM622-CAF cokulturer. CAFs kan integreras i coculture genom att antingen överlagra ovanpå matrisen eller sambäddsbäddas med TUM622-cellerna. Oavsett installationen, förekomsten av CAFs kraftigt ökat antalet och storleken på sfäroider bildas(figur 3B). Intressant, när TUM622 acini komma i närheten med CAFs, de inducerar acini att bli invasiva och migrera mot CAFs, bildar "tår-drop" som strukturer(figur 3C). Observera att TUM622 acini i monokultur inte uppvisar invasivt beteende och bildar bara "tårdropp" som strukturer när de ligger nära CAFs.
Representativa immunofluorescerande och immunohistochemistry färgning resultat
Figur 4 visar representativa resultat från immunofluorescens och immunohistochemistry färgning av TUM622 acini efter 10 dagars odling. Konfokalbilder togs vid det ekvatorialplan av immunofluorescerande färgade TUM622 acini (figur 4A). Varje avsnitt från immunohistokemiprovet kan däremot fånga acini vid olika plan (figur 4B). Båda resultaten visade heterogena uttryck för stamceller-liknande och differentierade celler inom varje acinus.
TUM622 3D cytotoxicitet analys med hjälp av en Wnt väghämmare
Figur 5 visar dossvaret från TUM622 acini som behandlats med XAV939, en tankyrashämmare (figur 5A,B). XAV939 lades till kulturen 1 dag efter plätering och uppdateras varannan dag för totalt 10 dagar. I slutet av experimentet kvantifierades antalet acini av en bildare. Brightfield bilder vid högre förstoring förvärvades också för att fånga morfologi sfäroider i kontroll kontra XAV939-behandlade brunnar (Figur 5C). Sammantaget visar XAV939 dosberoende hämning på acini-bildning och förändrar vävnadsarkitekturen hos de sfäroider som bildas. Dessa resultat tyder på att aktivering av den kanoniska Wnt vägen krävs under TUM622 acinar morfogenes.
Figur 1: TUM622 och CAFs i 2D-kultur. Representativa ljusfältsbilder av TUM622-celler och CAFs odlade i 2D. Skalstång = 100 μm. Denna siffra har ändrats från Chen et al.9 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillväxt och morfologi av TUM622 acini i 3D ECM. (A) Tidskursbilder av TUM622 celler odlade i källarmembranmatris under en 10-dagarsperiod. Skalstång = 100 μm. (B)Immunofluorescens av TUM622 acini färgat med apical-basalcellpolaritetmarkörer, Golgi-enzym (GM-130, grön, atisk) och Integrinalfa 6 (CD49f, basal, röd). C)Kvantifiering av acininummer (höger y-axel, röd) och den genomsnittliga storleken på acini (vänster y-axel, blå) pläterad i treexemplar i en 24-brunnsplatta under 24 dagar i kultur. Felstaplar representerar SD. Denna siffra har ändrats från Chen et al.9 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillväxt och morfologi av TUM622-CAFs coculture. (A)Schematisk ritning av installationen av TUM622-CAFs coculture. CAFs är överlagrade eller co-inbäddade med TUM62 celler i ECM. Efter 6-12 dagar i coculture, TUM622 celler kan bilda mer och större acini jämfört med mono-kultur och invadera ECM när i närheten och direkt kontakt med CAFs. Observera att den invasiva fenotypen endast kunde observeras i samkulturen. (B)Brightfield bild av TUM622 3D kulturer i närvaro eller avsaknad av överlagrade CAFs efter 8 dagar. Skalstänger = 200 μm. (C)Brightfield-bilder som visar tårdroppsformade acini som bildas i kokulturer oavsett CAFs är överlagrade eller saminbäddade i ECM. Vågar = 200 μm. Denna siffra har ändrats från Chen et al.9 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa immunofluorescerande och immunohistochemistry färgning resultat. (A)Antikroppsfärgning av acini med markörer för stam-/stamstamceller (CXCR4 och SOX2), mesenkyme (Vimentin), epitelialdifferentiering (Involucrin), apoptos (Cleaved-Caspase-3) och spridning (Ki67) i grönt, DAPI i blått, E-cadherin och Phalloidin i rött. Skalstång = 50 μm. (B) Immunohistochemistry på FFPE-sektioner i TUM622 acini. Skalstång = 100 μm (överst) och 50 μm (botten). Denna siffra har ändrats från Chen et al.9 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: TUM622 3D cytotoxicitetsanalys med hjälp av en Wnt-väghämmare. a)Kvantifiering av sfäroidnummer i en 96-brunnsplatta där TUM622-celler behandlades med dimetylsulfoxid (Kontroll) eller XAV939. Varje villkor är analyserat i triplikator. Felstaplar representerar SD. (B) Hela brunnsbilder från en 24-brunnsplatta tagen med en bildare som visar de hämmande effekterna av XAV939 på acini-bildning. (C)Representativa ljusfältsbilder från kontrollen kontra behandlade brunnar som visar de morfologiska förändringar som orsakas av Behandling med XAV939. Vågar = 100 μm. Denna siffra har ändrats från Chen et al.9 och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumörer är heterogena vävnader som består av cancerceller som samexisterar sida vid sida med stromalceller såsom cancerassocierade fibroblaster, endotelceller och immunceller inom ECM. Tillsammans, dessa olika komponenter cross-talk och påverka tumör mikromiljön, spelar en aktiv roll i körning tumorigenesis, en process som innebär progressiva förändringar i tumör arkitektur. Helst bör en in vitro-modell av tumörutveckling kunna fånga de dynamiska vävnadsarkitektoniska förändringar som observerats i mänskliga tumörer in vivo, det komplexa samspelet mellan olika celltyper inom tumörmikromiljön och samtidigt tillåta experimentell manipulering på både tumörceller och komponenter i TME. Även om stora framsteg har gjorts i 3D-cancer modeller under de senaste åren, har sådana modeller inte varit lätt för LUSC. De flesta modeller som hittills rapporterats innehåller bara några aspekter av dessa viktiga funktioner. Här rapporterar vi metoderna för ett 3D-coculture system av LUSC som samtidigt fångar viktiga vävnad arkitektoniska förändringar observerats under LUSC utveckling samt dynamiska interaktioner mellan tumörceller och viktiga komponenter i TME, inklusive ECM och CAFs.
Förmågan hos detta system att mer exakt modellera vävnad arkitektoniska förändringar är baserad på den unika egenskapen hos TUM622 celler att bilda organoider med acinär-liknande morfosologier när inbäddade i 3D EG. Varje acinus bildas från en självförnyande encell och består av en monolayer av celler som omger en ihålig lumen. Denna monolayer av celler uppvisar apikala-basalcell polaritet och förblir icke-invasiv, liknar vävnadarkitektur en lungepitel. Medan TUM622 som en 3D mono-kultur visar hyperplastisk tillväxt, ökar tillsatsen av CAFs ytterligare acinar morfogenes och inducerar mer och större acini att bilda. Viktigt, CAFs åberopa dynamiska vävnad arkitektoniska förändringar i TUM622 celler när de två celltyperna kommer i närheten, vilket gör att TUM622 cellerna att förlora sin apikala-basal polaritet och invadera matrisen mot CAFs. Dessa fenotypiska förändringar rekapitulera både tidig hyperplasi samt sena invasiva stadier av LUSC.
Till skillnad från många tumör sfäroidmodeller där varje sfäroid bildas genom aggregering av många celler, varje TUM622 acinus härleds från en enda cell9. Genom in vitro LDA beräknas endast en mindre delpopulation (≤0,02 %) tum622 celler har sådan kapacitet9. Även om sällsynta, dessa celler kan själv förnya som framgår av deras förmåga att genomgå seriella passaging i 3D samt skilja till en heterogen population av celler som liknar den ursprungliga tumören. På grund av denna unika egenskap hos TUM622-celler är det viktigt att säkerställa jämn fördelning av enstaka TUM622-celler inom ECM vid tidpunkten för plätering för framgångsrik odling och nedströmsanalys. För att uppnå detta mål måste flera viktiga punkter följas noggrant i protokollet, inklusive bestämning av lämplig sådddensitet, hålla alla verktyg och reagenser svala under blandning av celler och matris för att förhindra för tidig stelning, undvika införandet av bubblor under blandningsprocessen och ge tillräckligt med tid för matris en helt stelna innan odlingsmedium tillsätts. Tillsammans kommer dessa försiktighetsåtgärder att bidra till att uppnå ett mer enhetligt matrissubstrat och kulturtillstånd för alla inbäddade celler.
När framgångsrikt etablerade, denna kultur kan användas för en mängd olika nedströms analyser för att dissekera cellen och biokemiska processen som reglerar tumorigenesis. Antalet och storleken på acini bildas i varje brunn kan övervakas med tiden med ljusa fält bildare och användas som en avläsning för proliferative och självförnyelse kapacitet TUM622 celler. Mer detaljerad dynamik i morfogenesen för varje acinus kan observeras med live-imaging på ett confokalmikroskop, med eller utan olika märkning färgämnen. Det konditionerade mediet kan samlas in vid flera tidpunkter under kulturperioden för att analysera lösliga faktorer som kan medla i cellcell- eller cellmatriskorssamtal. TUM622 celler som utvinns direkt från ECM med protokoll 4 är lämpliga för RNA- och proteinutvinning för genuttrycksanalys, flödescytometrikvantifiering eller FACS-sortering baserat på cellytmarkörer. Alternativt kan kulturerna fastställas för in situ immunofluorescens eller immunohistochemistry studier för att förstå de rumsliga-temporala fördelningarna av olika markörer. Även om det är liknande kompletterar immunohistochemistry immunofluorescensmetoder genom att det gör det möjligt att ta en hel acini som kanske inte är möjlig på grund av de begränsande bildframställningsdjupet i konfokalmålen. För båda dessa metoder är den tid och temperatur vid vilken fixering och permeabilisering utförs kritiska, särskilt med tanke på att TUM622-celler är inbäddade i en tät matris (>90% källarmembranmatris) i motsats till många andra 3D-kulturer där matrisdensiteten är mycket lägre. Därför är uppmärksamhet på standardiserade och konsekventa fixering och bearbetning nödvändigt för att få repliktive resultat.
Med hjälp av detta system som en plattform kan man sedan undersöka hur cellinneboende förändringar i tumörcellerna, liksom cell-extrinsic förändringar i tumörmikromiljön, påverka epitelial arkitektur och modell tidiga händelser som deltar i carcinom bildning. Till exempel kan rollerna av onkogener eller tumörsuppressorgener i reglering en tumörvävnadsarkitektur studeras genom vinst- eller förlust-of-function-experiment som riktar sig till genen av intresse för tumörcellerna. I själva verket visade vi att över-uttryck för SOX2, som ofta observeras i LUSC, ändrar fenotyp av TUM622 celler som framgår av en förlust av hyperplasi i 3D och progression mot dysplastisk tillväxt9. Å andra sidan, Man kan jämföra normala kontra cancer-associerade fibroblaster i coculture inställningar, avgöra hur matriskomponenter eller dess styvhet inverkan acini tillväxt / morfologi / invasion, och om blockera vissa cytokiner kan störa cell-cell kommunikation och i sin tur påverka vävnad arkitektur och tumör progression. Viktigt, alla dessa analyser kan utföras i närvaro eller frånvaro av vissa terapeutiska medel och användas som ett verktyg för att bestämma läkemedlet svar av LUSC celler med en flerdimensionell avläsning11. Det är också viktigt att notera att detta system är begränsat när det gäller de vägar det skulle kunna användas för att förhöra, eftersom endast vissa men inte alla större signalvägar reglerar tillväxten och morfologi av TUM622 organoider i kultur (dvs. hämning av Wnt men inte Notch signalering påverkar acinar mophogenesis av TUM622 celler)9.
Sammanfattningsvis visar vi att detta organoidsystem ger en unik plattform för att generera nya insikter i det dynamiska samspelet mellan LUSC-celler och tumörmikromiljön under tumörprogression. Vi räknar med att vårt modellsystem kommer att vara en värdefull plattform för läkemedelsupptäckt och utveckling. I detta avseende, screening nya anti-cancer therapeutics i en infödd tumör vävnad sammanhang bör stöd i valet och utvecklingen av effektivare therapeutics inriktning LUSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är anställda och aktieägare i Pfizer Inc.
Acknowledgments
Vi tackar Magali Guffroy, John Kreeger och Stephani Bisulco från Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker group for pathology/histology support and Michael Arensman for critical review of the manuscript. Vi tackar också Pfizer postdoktorala programmet och Oncology R & D-gruppen, särskilt Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin och Jennifer Tejeda för deras stöd för programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
