Summary
En ny tredimensionell sfäroid modell baserad på heterotypic interaktion av tumörceller och stromal fibroblaster är etablerad. Här presenterar vi samodling av tumörceller och stromal fibroblaster, time-lapse imaging, och confocal mikroskopi för att visualisera bildandet av sfäroider. Denna tredimensionella modell erbjuder en pertinent plattform för att studera tumör-stroma interaktioner och testa cancer therapeutics.
Abstract
Tumor-stroma interaktioner spelar en viktig roll i cancer progression. Tredimensionella (3D) tumör sfäroidmodeller är de mest använda in vitro-modellen i studien av cancerstamceller/initierande celler, preklinisk cancerforskning och läkemedelsscreening. 3D sfäroidmodeller är överlägsna konventionell tumör cell kultur och återge några viktiga tecken på verkliga fasta tumörer. Emellertid, konventionella 3D tumör sfäroider består uteslutande av tumörceller. De saknar deltagande av tumör stromal celler och har otillräcklig extracellulär matris (ECM) nedfall, alltså endast delvis härma in vivo villkor tumörvävnader. Vi etablerade en ny multicellulär 3D sfäroid modell bestående av tumörceller och stromal fibroblaster som bättre härmar in vivo heterogen tumör mikromiljö och dess inhemska desmoplasia. Bildandet av sfäroider regleras strängt av tumörstromal fibroblaster och bestäms av aktiviteten av bestämda avgörande intracellular signaleringvägar (e.g., Notch signalering) i stromal fibroblaster. I den här artikeln presenterar vi tekniker för samodling av tumörceller-stromal fibroblaster, time-lapse imaging att visualisera cellceller interaktioner, och confocal mikroskopi för att visa 3D arkitektoniska funktioner i sfäroider. Vi visar också två exempel på den praktiska tillämpningen av denna 3D-sfäroidmodell. Denna nya multicellulära 3D-sfäroida modell erbjuder en användbar plattform för att studera tumör-stroma interaktion, klargöra hur stromal fibroblaster reglera cancer stam / initiera celler, som bestämmer tumör progression och aggressivitet, och utforska inblandning av stromal reaktion i cancer läkemedelskänslighet och resistens. Denna plattform kan också vara en pertinent in vitro modell för läkemedelsupptäckt.
Introduction
Solida tumörer representerar komplexa vävnader som består av neoplastiska celler och ett stort utbud av stromalceller1,2,3,4. Stromal fibroblaster, eller cancer-associerade fibroblaster (CAF), är en av de framstående stromal cell populationer i de flesta typer av fasta tumörer. De är kritiskt involverade i reglering en tumörtillväxt, stemness, metastasering, angiogenes och läkemedelsresistens genom produktion av tillväxtfaktorer, cytokiner/kemokineser, syntes av ECM och remodeling enzymer (t.ex. kollagen, fibronectin och matris metalloproteases), frisättning av exosomer, och direkta heterotypic cell-cell interaktion5,6,7,8,9,10,11 . CAF deltar också i fastställandet av cancer organ-specifika metastasering genom att förvälja en delmängd av tumör kloner från heterogena tumör cell populationer i den primära lesion och främja dessa utvalda kloner som ska primas för metastasering till en specifik avlägsen organ vars mikromiljö är optimal för rekolonisering av utvalda kloner12. Dessutom fibroblaster och deras utsöndrade lösliga faktorer och ECM delta i modulering av tumör angiogenesis13,14, anti-tumör immunsvar15, och är även inblandade i läkemedelsresistens och tumör återkommande16,17.
In vitro 3D tumör sfäroidmodeller har utvecklats och använts i cancerforskning som en mellanliggande modell mellan in vitro cancer cellkulturer och in vivo tumör modeller18,19,20,21. Den 3D tumör sfäroidmodeller har vunnit popularitet i cancer stamceller forskning, preklinisk cancer forskning, och drogscreening eftersom dessa modeller reproducera några viktiga funktioner i verkliga tumörer som saknas i traditionella 2D monolayers22. Många befintliga 3D tumör sfäroidmodeller är enbart består av tumörceller och saknar deltagande av tumör stromal celler. Detta resulterar ofta i tumör sfäroider har otillräcklig ECM nedfall och avsaknad av heterotypic cell-cell interaktioner. Konventionella 3D-sfäroider som uteslutande bildas av cancerceller och homotypic cell-cell vidhäftning kan endast delvis efterlikna in vivo villkor tumörvävnader. För att övervinna några av dessa begränsningar, utredare har föreslagit att införliva flera typer av stromal celler i 3D-kokulturer och utvecklat flera heterotyp 3D tumör sfäroid modeller23,24,25,26,27. Dessutom har utredare använt exogena 3D-matriser, inklusive naturliga hydrogeler eller syntetiska polymerer såsom polyetenglykol, poly(laktids- co-glykolid), och poly (N-isopropylacrylamide), för att bädda in monocellulära och multicellulära sfäroida modeller, skapa en cellstödjande miljö och reproducera cellmatrisinteraktioner28,29, vilket gör dessa system mer biologiskt relevanta30. Införlivande av vissa typer av stromalceller, såsom endotelceller, i 3D-kokulturer leder dock till ytterligare komplexitet för ett in vitro-system och gör det svårt att studera heterotypiska cellceller interaktioner mellan två specifika typer av celler, såsom cancer cell-fibroblast interaktioner. Dessutom, endotelceller i verkliga vävnader inte alltid direkt interagerar med cancerceller och andra stromal celler eftersom det finns ett lager av källaren membran insvept utanför kapillärer som förhindrar endotelceller från att direkt interagera med cancerceller och andra stromal celler. I dessa 3D sfäroida modeller, införlivade endotelceller faktiskt inte bildar blodkärl, men interagerar direkt med cancerceller och andra stromal celler, något som sällan förekommer in vivo. På samma sätt är exogena matriser som används i några av de 3D-sfäroida modellerna inte identiska med ECM i verkliga tumörvävnader när det gäller struktur och sammansättning. Alla dessa artificiella förhållanden kan leda till vilseledande uppgifter.
Vi har nyligen skapat en ny multicellulär 3D sfäroid modell bestående av tumörceller och CAF. I vår modell bestäms bildandet av 3D-tumörsfäroider helt av CAF. CAF inducerar och reglerar fenotypen av tumörstamceller/initierande celler. ECM produceras av CAF är naturligt och gör det möjligt för desmoplastic struktur att bättre efterlikna in vivo tumör mikromiljö. Denna nya 3D-modell kan vara ett användbart verktyg för cancer drog screening och erbjuder en unik plattform för att studera tumör-stroma interaktion, belysa hur CAF reglera cancer stam / initiera celler, och utforska medverkan av stromal interaktioner i cancer läkemedelskänslighet och resistens.
Protocol
1. Odling melanomceller och hudfibroblaster
- Odling av mänskliga melanomceller
- Kultur mänskliga melanomceller, C816131 under konventionella anhängare cell odling villkor i komplett W489 medium (se steg 1,2) i en 37 ° C inkubator levereras med 5% CO2 som beskrivs tidigare32. Dela cellerna på en 1:5 förhållande när de når ~ 90% confluency.
- Melanom cell odling medium (W489)
- För komplett W489 medium, använd 80% MCDB153 medium, 20% L-15 medium (se Table of Materials), 2% fetala nötkreatur serum (FBS), 5 μg /mL insulin, 1,68 mM CaCl2, och 0,11% natriumbikarbonat. För samkultur, tillsätt inte FBS, insulin och CaCl2.
- Mus hud fibroblast isolering
- Skär ett 1 cm x 1 cm hudfragment från en mus i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från institutionens djurvårds- och användningskommitté (IACUC).
- Smält huden genom dispase (se Materialbord)vid 4 °C över natten. Ta bort dermis från epidermis och smälta ytterligare med kollagenas (1 mg/ml i DMEM, se Materialbord)vid rumstemperatur (RT) över natten.
- Mus hud fibroblast odling
- Tvätta vävnadspellets en PBS och odla dem i DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin i 37 °C/5% CO2. Dela cellerna på en 1:2 förhållande när de når ~ 90% confluency.
- Transduce huden fibroblaster med GFP / lentivirus med hjälp av standardmetoder före samodling.
- Karakterisering av mushudfibroblaster genom immunfärgning
- Cellberedning för färgning
- Frö huden fibroblaster i 24 väl plattan med en densitet av 2 x 104 celler / väl. På dag 2, tvätta cellerna med PBS 2x och fixa dem i 2% neutral buffrad formalin i 10 min. Ta bort formalin och tvätta de fasta cellerna med PBS två gånger.
- Immunfärgning
- Tillsätt 200 μl blockeringslösning till varje brunn och inkubera plattan i 30 min på RT, tillsätt sedan musanti-α-SMA utspädd vid 1:200 och inkubera vid 37 °C för 1 h. Tvätta med PBS 3x, 5 min vardera.
- Lägg Alex Fluor 488 get anti-mus IgG vid 1:400 utspädning och inkubera på RT för 1 h. Tvätta ut antikropparna 3x med PBS, 5 min vardera.
- Tillsätt 1 μg/ml DAPI och inkubera på RT i 2 min. Ta bort DAPI-lösning och tillsätt 500 μl PBS i varje brunn.
- Observera cellerna och ta bilder med hjälp av ett inverterat mikroskop i fluorescens.
- Cellberedning för färgning
- Förmärkning fibroblaster och melanomceller
- Frö fibroblaster i en 100 mm maträtt på dag 1 så att cellen confluency når ~ 60% nästa dag. Dag 2, ta bort odlingsmediet och tillsätt GFP/lentivirus (~1:3–1:5 utspädd från lager) till vanligt odlingsmedium med 4 μg/ml polybrene. Inkubera celler i en 37 °C-inkubator för 6 h, ta bort mediet och byt ut med färskt vanligt odlingsmedium. Efter 2 dagar observera GFP-signalen från cellerna med ett fluorescensmikroskop. Transduce C8161 celler med DsRed / lentivirus under liknande förhållanden. Protokoll för beredning av GFP/lentivirus och DsRed/lentivirus har beskrivits tidigare14,34.
2. Cell Coculture
- Frö C8161-fibroblast coculture.
- På dag 0 av spheroid bildning analys, lossa både C8161 och huden fibroblaster med 0,25% trypsin-EDTA. Snurra ner cellerna på 250 g i 5 min på RT och tvätta en gång med PBS.
- Resuspend cellerna i cellens coculture medium (serumfri, insulinfri och kalciumfri W489 medium blandat med serumfri DMEM på en 1:1 förhållande). Justera cellkoncentrationen till 2 x 104 celler/ml.
- Blanda C8161-cellerna med fibroblasterna vid ett 1:1-förhållande och tillsätt 2 ml av cellblandningarna till varje brunn på en 24 brunnsplatta. Varje brunn bör innehålla 2 x 104 av varje typ av celler. Varje villkor bör göras i tre exemplar.
OBS: Det är viktigt att använda en icke-vävnad kultur behandlad tallrik (se Table of Materials). Annars kommer cellerna starkt att fästa på en platta och inte kan från att hänga sfäroider.
- Inkubera celler vid 37 °C för 4 h tills cellerna fäster på plattan och utför sedan time-lapse imaging eller confocal scanning vid de angivna tidspunkterna för varje analys.
3. Live Cell Time-lapse Imaging
- Före samodling, slå på time-lapse imaging system (se Table of Materials)enligt tillverkarens instruktioner och låt inkubatorn nå 37 °C och 5% CO2. Det tar vanligtvis 1 h för systemet att nå jämvikt. Placera försiktigt odlingsplattan på mikroskopets stadium inuti inkubatorn och lås dörren ordentligt.
- Öppna programvaran för time-lapse imaging system (se Table of Materials)och välj skylttyp och tillverkare så mikroskopet kan hitta skanningsområdet korrekt. Välj brunnar av intresse och en 10x objektiv lins. Välj inställningar för skanningsområdet, intervalltiden mellan skanningarna och en startsamt sluttid. I det här protokollet är det maximala formatnumret för skanningsområdet för 1 brunn 36 och intervalltiden är 1 h.
- Rekordtidsfördröjning från 4–52 h.
Starttid, sluttid och varaktighet bör optimeras efter celltyp och syftet med experimentet. - När du slutför bildinspelningen använder du programvaran timelapse-bildsystem för att hämta data och exportera videor eller bilduppsättningar.
4. Confocal Mikroskopi och 3D-filmer
- Placera cellkokulturplattan på scenen i ett inverterat mikroskop i fluorescens (se Materials tabell)och använd röda och gröna laserstrålar. Observera cellerna under en 5x eller 10x objektiv och välj en sfäroid att börja skanna.
- Använd ett 1 μm z-steg för att skanna från botten till toppen av spheroid. Bearbeta data med hjälp av programvara för bildbearbetning (se Tabell över material)för att rekonstruera en 3D-bild som kan roteras ytterligare och sparas som en 3D-film.
5. Solo kultur melanomceller och bildandet av 2D-kluster / aggregat
- Frö 2 x 104 C8161 melanomceller i varje brunn av en 24 brunn sett enligt beskrivningen i avsnitt 2.1. Odla cellerna i 7–10 dagar och fotografera dem med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop.
6. Kontroll av om 3D-sfäroider och 2D-cellkluster/aggregat är upphängda i mediet eller fäst på plattorna
- För cellkokultur, kontrollera 3D-sfäroider bildas på dag 7. För encellig kultur kontrollerar du de 2D-kluster/aggregat som bildas dag 10.
- Ställ in cellodlingsplattor på plattformen av ett inverterat mikroskop i fluorescens. Sätt en böjd nål med en spruta i en brunn och försiktigt aspirera kulturmediet in och ut för att störa odlingsmediet i brunnarna. Spela in den här processen med filmläget i filmprogrammet (se Materials tabell). 3D-sfäroiderna kommer att vara mobila, men 2D-cellkluster/aggregat förblir ståndaktiga.
7. Confocal Bild av 3D Sfäroider
OBS: Kokulturerade celler börjar bilda sfäroider från 48 till 72 h beroende på vilken typ av fibroblaster som används. Generellt, sfäroider förstora gradvis med tiden. Små sfäroider kan smälta för att bilda större sfäroider fram till dag 7. Efter sfäroider stabiliseras i storlek, kan de pågå mer än 10 dagar. Efter det avtar sfäroiderna ofta från botten av kulturplattan och samlas i mitten av brunnarna. Under utvidgningen av sfäroiderna dör cellerna i centrum vanligtvis på grund av otillräcklig näring och/eller en giftig mikromiljö. Därför bör toppen av 3D-sfäroidbildning och timing för att avbilda de mognade sfäroiderna optimeras med hjälp av pilotexperiment. För detta protokoll utfördes konfokal mikroskopi runt dag 7 när sfäroiderna var mogna och cellerna i mitten av sfäroider levde fortfarande enligt fluorescens och morfologi av cellerna i mitten.
- För att göra konfokal mikroskopi, använd en grön och röd laser för att skanna sfäroider. Bestäm skanningsområdet under ett 10x-mål och flytta från botten till toppen av spheroiden med ett 1 μm z-steg.
- Generera 3D-sfäroidbildnings- och rotationsvideor med hjälp av bildbehandlingsprogrammets 3D-projektionsfunktion (t.ex. ImageJ).
8. Intracellular Notch1 Signalering Pathway Aktivitet vid fastställande stromal reglering av cancer stem / initieraceller
- Isolering och karakterisering av hudfibroblaster från vinst- och funktionsförlust Notch1 möss
- Isolera hudfibroblaster från två par genetiskt modifierade möss: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) möss kontra deras motpartskontroll (GOFctrl: FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) möss och Funktionsförlust Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) möss kontra deras motpartskontroll (LOFctrl: FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) möss31,respektive. Isolera och karakterisera hudfibroblaster med hjälp av protokollet som beskrivs i avsnitten 1.3-1.5.
- Transduce musen huden fibroblaster med GFP / lentivirus.
- Se avsnitt 1 för metoden för att transduce cellerna med den lentivirala vektorn.
- Samodling av fibroblaster och melanomceller
- Genomföra cellkokulturexperimentet enligt beskrivningen i avsnitt 2.
- Bedöma effekten av intracellulära Notch1-spridningsvägar aktivitet i fibroblaster på att bestämma stromal reglering av cancer stam / initiera celler genom att mäta storleken på 3D-sfäroider
- Utför kvantifieringen av sfäroidbildning under varje villkor genom att fotografera sfäroiderna vid den tidpunkt då sfäroider är mogna (indikeras av tillväxtstoppet runt dag 5–7 beroende på vilka typer av fibroblaster). Mät storleken på 3D-sfäroiderna med hjälp av bildbehandlingsprogrammet.
9. Testa läkemedelssvaret från cancer stamceller / initieraceller med hjälp av 3D Spheroid Assay
OBS: CAF kan reglera cancer heterogenicitet och inducera fenotyp av cancer stam / initiera celler. CAF stöder också cancer stam / initiera celler för att uthärda kliniska behandlingar. Cancerceller har visat sig vara ansvarig för läkemedelsresistens. Därför använde vi denna 3D-sfäroida modell för att utvärdera läkemedelssvaret från cancer stamceller / initiera celler. Resultatet kan bedöma potentiell klinisk effekt av anti-cancer medicinering väl.
- Läkemedelsadministrering
- Direkt efter kokulering cellerna i en 24 brunn tallrik, förbereda droger i en seriell utspädning i kulturmedium för att nå 5x av ett önskat utbud av koncentrationer baserat på pilotexperiment (dvs. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM och 25 nM).
Tillsätt 0,5 ml motsvarande läkemedelslösningar till varje brunn av de odlade cellerna. Behandla kontrollgruppen med regelbundna samkulturmedier som nämnts ovan. - MEK-hämmare är löslig i cellodlingsmedier. Därför är tomma kontroller 2,5 ml cellodlingsmedium. Om läkemedlet inte är lösligt i vattenlösning och kräver lösningsmedel som DMSO, bör cellodlingsmedier med samma koncentration av DMSO tillämpas på kontrollgruppen.
- Direkt efter kokulering cellerna i en 24 brunn tallrik, förbereda droger i en seriell utspädning i kulturmedium för att nå 5x av ett önskat utbud av koncentrationer baserat på pilotexperiment (dvs. 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM och 25 nM).
- Kvantifiering av läkemedelsrespons genom att räkna sfäroider
- Observera de behandlade cellerna och obehandlade celler med ett fluorescensmikroskop och fotografera cellerna varje dag. Kvantifiera sfäroidbildningen i de olika experimentella grupperna och jämför cellkulturernas sfäriska bildande förmåga under olika läkemedelskoncentrationer.
OBS: Sfäroiderna tenderar att visas ~ 5−7 dagar efter samkulturen. Läkemedelseffekterna kommer att bli märkbara vid den tidpunkten. - Använd fluorescensmikroskop för att avbilda/fotografera sfäroider och celler i brunnarna och använd sedan bildprogramvaran för att beräkna den genomsnittliga storleken på sfäroiderna och antalet sfäroider som bildas per lågeffektfält (LPF x 4) i varje behandlingsgrupp över tiden.
OBS: Celler som får effektiv läkemedelsbehandling bör bilda färre eller inga sfäroider jämfört med kontrollgruppen. Detta är en indikation på det testade läkemedlets effektivitet vid undertryckacancerceller.
- Observera de behandlade cellerna och obehandlade celler med ett fluorescensmikroskop och fotografera cellerna varje dag. Kvantifiera sfäroidbildningen i de olika experimentella grupperna och jämför cellkulturernas sfäriska bildande förmåga under olika läkemedelskoncentrationer.
Representative Results
Vi utvecklade en ny metod för att generera 3D-sfäroider med en in vitro heterotypic cell kokkultur system som efterliknar in vivo tumör mikromiljö. Fibroblaster kommer från mushud fibroblaster. Hudfibroblaster genererades enligt beskrivningen ovan och karakteriserades som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler. Mänskliga metastaserande melanomceller (C8161) odlades i W489 medium enligt beskrivningen32. Att visualisera och skilja fibroblaster från tumörceller, fibroblaster och melanomceller var förtransduced med GFP / lentivirus och DsRed / lentivirus, respektive34,36, före cellen samodling.
Figur 1 visar ett exempel på multicellulära 3D-sfäroider som bildas genom kokulerande melanomceller och fibroblaster. Melanomceller odlade i avsaknad av fibroblaster utgjorde inte typiska 3D-sfäroider, även om vissa melanomceller bildar 2D-kluster/aggregat med den utökade kulturen. Den genomsnittliga storleken på sfäroiderna var cirka 170–360 μm i diameter (medelvärde = 275, SD = 37) dag ~5−7. Med hjälp av time-lapse imaging, observerade vi att fibroblaster och tumörceller interagerade i samodling och började bilda 3D sfäroider på cirka 36 h av samodling som visas i Video 1. Time-lapse imaging registreras den dynamiska processen för cell-cell interaktion och den inledande fasen av sfäroidbildning på ~ 4-52 h av samkultur. Toppen av 3D-sfäroidbildning inträffade runt dag ~5−7. De bildade 3D-sfäroiderna bestod av fibroblaster och melanomceller, där majoriteten (~80%) var tumörceller. Video 2 visar den dynamiska processen för enstaka odlade melanomceller (DsRed+/C8161) i bildandet av cellkluster/aggregat från ~4–52 h i en kultur. Bildandet av 2D-kluster/aggregat nådde en topp runt dag ~7–10. Video 3 och Video 4 visar strukturerna i en 3D-sfäroid och en 2D tumör cell kluster visualiseras av konfokal mikroskopi, respektive. 3D-sfäroiden och 2D-tumörcellklustren undersöktes genom confocal mikroskopi på dag 7 i cellkokultur. Video 5 visar att 3D-sfäroiderna avbröts i kulturmediet och mobilen, medan Video 6 visar att 2D-tumörcellklustret var fäst vid kulturplattan och orörliga. Suspension i mediet är ett inslag i 3D-sfäroider som skiljer dem från 2D-kluster. När mediet i cellodlingsskålen eller brunnen störs av att antingen släppa eller försiktigt pipetting odlingsmediet, flyttas de suspenderade 3D-sfäroiderna, medan 2D-cellkluster är orörliga. Endast ett fåtal enstaka döda celler är mobila.
Figur 2A visar ett exempel på denna 3D-modell som fungerar som en unik plattform för att studera tumörstroma interaktioner och att belysa hur intracellular Notch1 signalering väg aktivitet i CAF reglerar cancer stam / initiera celler och sfäroidbildning. Två par fibroblaster (Fb) isolerade från huden på Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) möss kontra deras motpartskontroll (GOFctrl: FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) möss och Funktionsförlust Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) möss kontra deras motpartskontroll (LOFctrl: FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) möss35,respektive. Alla fibroblaster transduced av GFP / lentivirus och samodlade med C8161 melanom celler förtransduced med DsRed / lentivirus. Time-lapse imaging visar att Fb-GOFNotch1 stoppade C8161 melanom celler från att bilda 3D sfäroider jämfört med Fb-GOFctrl under den första ~ 4-52 h av cell enkultur. Däremot främjas Fb-LOFNotch1 bildandet av 3D-sfäroider av C8161 melanomceller jämfört med Fb-LOFctrl. Figur 2B, topp, visar representativa bilder av 3D-sfäroider som bildas på dag 7 av cellens samkultur med olika fibroblaster som utför varierade Notch utbildningsavsnitt. Figur 2B, botten, visar kvantitativa data om den genomsnittliga storleken på 3D-sfäroider som bildas på dag 7 av cellens samkultur med olika fibroblaster som bär varierade Notch utbildningsavsnitt aktiviteter.
Figur 3 visar ett exempel på denna 3D-modell som används för att testa läkemedelssvaret från cancer stamceller / initiera celler. Cancer stamceller /initierande celler har visat sig vara ansvarig för läkemedelsresistens och cancer återkommande. Därför, utvärdera läkemedelssvar med hjälp av denna 3D-modell kan bättre avslöja en potentiell läkemedels kliniska effekt för cancerbehandling. C8161 melanom celler förlitar sig på aktiva MAPK signalering för celltillväxt och invasion. De uttrycker också höga nivåer av CDK4 /Kit, men bär inte en BRAF mutation. För att testa läkemedelssvaret från cancerstamceller/initiera celler mot MAPK-hämmaren med hjälp av denna 3D-modell samodlade vi C8161 melanomceller och fibroblaster i 24 brunnsplattor. PD0325901 (se Materialtabell), en MAPK-hämmare, har bereds i en seriell utspädning vid en rad koncentrationer från 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM och 25 nM. PD0325901 lades till cellkokulturerna när cellblandningar var pläterade. Obehandlade odlade celler användes som kontroll. Vi utvärderade de sfäroidbildande förmågan hos cellkokulturerna under olika läkemedelskoncentrationer och jämförde den med den obehandlade kontrollen. Figur 3A visar representativa bilder av 3D-sfäroider som bildas på dag 5 av cellens samkultur under olika läkemedelskoncentrationer. Figur 3B är kvantitativa data av den genomsnittliga storleken per sfäroid och antalet 3D-sfäroider som bildas per låg effekt fält (LPF x 4) på dag 5 av cellens samkultur under olika läkemedelskoncentrationer.
Bild 1: Bildande av 3D-sfäroider och 2D-kluster. (A)Representativ bild av 3D-sfäroider som bildas av samkultur av mänskliga C8161 melanomceller och mus hud fibroblaster. 3D-sfäroiderna fotograferades dag 7 i samkulturen av melanomceller och fibroblaster. De genomsnittliga storlekarna på sfäroiderna var ~170–360 μm i diameter (medelvärde = 275, SD = 37) på dag ~5−7. Det genomsnittliga antalet sfäroider var 18–26 (20,5 ± 3,6) per lågeffektfält (LPF x4). (B)Representativ bild av 2D tumörcellkluster som bildas av en kultur av C8161 melanomceller. 2D melanom cell kluster fotograferades på dag 7 av enda kultur av melanomceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Klarsynt av rollen av intracellulära Notch1 signalering väg aktivitet i CAF att reglera cancer stam / initiera celler med hjälp av 3D sfäroid modell. (A)Intracellular Notch1 signalering väg aktivitet i CAF bestäms bildandet av sfäroider av melanomceller i cellen sandodling. Time-lapse video visar att Fb-GOFNotch1 stoppade bildandet av 3D-sfäroider av C8161 melanom celler, medan Fb-LOFNotch1 främjas bildandet av mer 3D sfäroider av C8161 melanom celler under de första 4-52 h av cell enkultur. (B)Topp: Representativa bilder av 3D-sfäroider bildas på dag 7 av cellens samkultur med olika fibroblaster som bär varierande Notch utbildningsfunktioner. Botten: De kvantitativa uppgifterna i den genomsnittliga storleken (diameter [μm]/spheroid) av 3D-sfäroider som bildas på dag 7 av cellens samodling med olika fibroblaster som transporterar varierade Notch vägaktiviteter. Två-tail studentens t-test användes för statistisk analys. Uppgifterna uttrycks som genomsnittlig ± standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bedömning av läkemedelsrespons från cancerstamceller/initierande celler med hjälp av 3D-sfäroidmodellen. (A)Representativa bilder av 3D-sfäroider som bildas på dag 5 av cellens samodling under olika läkemedelskoncentrationer. (B)De kvantitativa uppgifterna i den genomsnittliga storleken (diameter [μm]/spheroid) och antalet 3D-sfäroider per lågeffektfält (LPF x 4) som bildas dag 5 i cellens samodling under olika läkemedelskoncentrationer. Kvantitativa uppgifter uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Dynamisk process för bildning av 3D-sfäroider i den tidiga fasen av cellens samkultur. Time-lapse imaging visar dynamiska cellceller interaktioner mellan fibroblaster och tumörceller i samodling och bildandet av 3D-sfäroider under den första ~ 4-52 h av cell ensamkultur. Cellerna började bilda 3D-sfäroider runt 48 h efter starten av samodling. Toppen av 3D-sfäroidbildning inträffade på dag ~5−7 (visas inte här). 3D-sfäroiderna bestod av fibroblaster och melanomceller, där majoriteten (~80%) var tumörceller. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Dynamisk process för bildning av 2D-kluster i den tidiga fasen av cellens samkultur. Time-lapse imaging visar den dynamiska processen för 2D-kluster som bildas av C8161melanomceller i en kultur. Bildandet av 2D-kluster inträffade runt dag ~7–10. Time-lapse imaging registrerar perioden ~4–52 h i en kultur av DsRed+/C8161 melanomceller. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Arkitektur och rotation av en 3D-sfäroid som visualiseras genom konfokal mikroskopi. Arkitektur och rotation av en 3D-sfäroid. Gröna och röda lasrar användes för att skanna sfäroider bildas på dag 7 i cellen sandodling. Skanningsområdet fastställdes enligt ett 10x-mål. Skanningen börjar från botten till toppen av spheroid en 1 μm z-steg. 3D-sfäroidrotationsfilmen skapades med fijiansk programvara. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Arkitektur och rotation en 2D tumör cell kluster som visualiseras genom konfokal mikroskopi. Arkitektur och rotation av ett 2D-kluster. Confocal bilder av cellkluster togs på dag 7 av melanom cell enda kultur. Skanningsområdet fastställdes enligt ett 10x-mål. Skanningen börjar från botten till toppen av spheroid en 1 μm z-steg. 2D-klusterrotationsfilmen skapades med fijiansk programvara. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 5: Förflyttning av 3D-sfäroider. 3D-sfäroiderna avbröts i kulturmediet och följde inte kulturrätten/brunnen. När fortfarande medium i cellkulturen väl stördes av milda pipetting, flyttade den suspenderade 3D-sfäroider. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 6: Ståndaktighet av 2D tumör cell kluster. 2D-tumörcellklustret var förankrat på kulturplattan och orörlig trots störningar i kulturmediet. Några enstaka döda celler var mobila. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
In vitro 3D-cellkulturtekniker har varit allmänt anställda i årtionden inom cancerforskning. Jämfört med konventionella 2D-cellodlingssystem rekapitulerar 3D-mikromiljön cellcell- och/eller cellmatrisinteraktionerna och möjliggör att de verkliga förhållanden som observerats i tumörvävnader efterliknars. Men ett 3D-system som endast bildas av cancerceller och homotypiska cellceller interaktioner tar inte hänsyn till vikten av heterotypic cross talk och kan ge felaktiga resultat i forskning. Vi har nyligen utvecklat ett nytt 3D-system som kombinerar cancerceller och CAF för att bättre efterlikna in vivo heterogen tumör mikromiljö och dess inhemska och stela desmoplastic reaktion.
Fibroblaster är viktiga komponenter i tumör stroma. CAF är involverade i regleringen av tumörprogression genom att framkalla lösliga faktorer, ECM/remodeling enzymer10,11, och exosomer. Dessutom, CAF spela en roll i läkemedelsresistens och tumör återkommande16,17. Vårt multicellulära 3D-sfäroidsystem kan användas för att utforska molekylära mekanismer för tumörstromal interaktioner och för att ta itu med läkemedelsresistens och tumör återkommande. CAF är främst härrör från aktiverade lokala quiescent fibroblaster och rekryteras cirkulerande benmärg MSC, som genomgår in situ differentiering i CAF i tumörvävnad37,38,39. I den aktuella studien använde vi hudfibroblaster för att skapa en multicellulär 3D-sfäroid modell. Emellertid, annan typ av fibroblaster (t.ex. MSC-DF), fungerar också på ett mycket liknande sätt som hud fibroblaster för att reglera tumörcell 3D sfäroid bildning34. MSC-DF kan genereras från murine benmärg MSC, som berikas av odling benmärg mononukleära celler i MSC cell odling medium i ca 10 dagar med periodiska medelstora förändringar var 3 dagar. Dessa MSC kännetecknas som CD73+/ CD105+/ Lin-. För att differentiera MSC i fibroblaster, MSC är därefter odlade med komplett DMEM för ytterligare 2 veckor. MSC-DF kännetecknas som α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celler36. MSC-DF kan vara viktiga tumör regulatorer. Eftersom en bråkdel av CAF i många typer av fasta tumörer skiljer sig från rekryterade cirkulerande MSC frigörs från benmärg36,MSC-DF kan vara lovande behandlingsmål. De är också mycket lättare terapeutiskt manipulerade eller riktade innan de rekryteras till tumörvävnader och differentieras till CAF. Således erbjuder vår 3D-modell ett idealiskt system för att studera och testa inte bara cancerceller, men också olika fraktioner eller subpopulationer av CAF. Metoden för 3D-sfäroidbildning är enkel. De kritiska stegen inkluderar att använda serumfritt medium för samodling, tillämpa rätt förhållande av fibroblaster till tumörceller, och använda rätt kulturplattor för samkultur. Den potentiella begränsningen av vår metod är att bildandet av 3D-sfäroider till stor del är cancercell linjeberoende. Vårt spheroid bildningprotokoll kan kräva optimering av förhållandet mellan fibroblaster och cancerceller om olika cancercellinjer används. Det bör noteras att vi använde en human melanom cell och mus fibroblast cell koliemodell för bildandet av 3D sfäroider, eftersom det är mycket lättare att skapa GOF eller LOF celler i mus fibroblaster för studier av rollen som en molekyl eller signalering väg att reglera tumör sfäroidbildning. Förmågan hos mänskliga melanomceller och musfibroblaster att bilda sfäroider indikerar att molekyler som krävs för cell-cell kommunikation arbete korsarter. Vi har nyligen testat samodling av mänskliga fibroblaster med mänskliga melanomceller och fann att mänskliga fibroblaster kan också reglera mänskliga melanomceller för att bilda 3D-sfäroider.
Vi använde mänskliga metastaserande melanomceller, C8161, i vår flercelliga 3D-sfäroida modell. Vi testade också andra mänskliga melanomceller, till exempel 1205Lu32, som bär BRAFV600E mutation, och MeWo, som uttrycker höga nivåer av CDK4 /Kit (ATCC HTB-65), och fann att de också kan bilda 3D-sfäroider i samkultur. Detta tyder på att bildandet av 3D-sfäroider av tumörceller är oberoende av de typer av onkogena mutationer. Även om vi inte har testat om andra typer av icke-melanom tumörceller kan bilda 3D-sfäroider med fibroblaster, våra resultat tyder på att bildandet av 3D-sfäroider inte är begränsad till ett melanom cellinje och kanske inte beror på en viss cancercellinje.
Vi visade två exempel på praktiska tillämpningar av vår 3D-sfäroidmodell. Ett exempel var att belysa intracellulära Notch signalering utbildningsavsnitt aktivitet i regleringen av cancer stammen / initiera cell fenotyp och 3D sfäroid bildning. Vi visade att intracellular Notch signalering väg i CAF är en molekylär switch som styr fenotyp av cancer stam / initieraceller med hjälp av denna 3D sfäroid modell. Våra resultat inte bara avslöja en molekylär mekanism bakom stromal reglering av cancer stam / initiera celler och cancer heterogenicitet, men också belysa att Notch vägen i CAF är ett kritiskt mål för melanom therapeutics. Detta exempel visar att vår 3D-sfäroida modell är mycket användbar för att studera mekanismerna för cancer cell-stromal fibroblast interaktioner och identifiera potentiella terapeutiska mål. Ett annat exempel var att testa läkemedelssvaret från cancerstam/initierande celler i närvaro av CAF. Det är väl känt att läkemedelssvaret från cancerceller, inklusive cancer stamceller / initieraceller, varierar i närvaro och frånvaro av CAF. Förekomst av CAF i detta in vitro-system gör denna modell mer kliniskt relevant och genererade testresultat mer tillförlitliga. Dessutom är vårt 3D-sfäroidsystem mångsidigt. Det kan användas för olika ändamål. Till exempel, om läkemedelsresistenta cancerceller används i denna 3D-modell, Det kan ändras för att ta itu med läkemedelsresistens och kanske tumör återkommande. Det kan också ändras för att testa eller screenläkemedel som främst riktar CAF för cancerbehandling. CAF har nyligen blivit lovande terapeutiska mål. Det finns fördelar med att rikta CAF. Först, jämfört med tumörceller som är onormala (ofta med genetiska förändringar) och smart (lätt få resistens mot cellgifter- och radioterapier), CAF i tumörvävnad är normala celler och genetiskt stabilare, så de är mindre benägna att utveckla resistens mot behandlingarna. För det andra, inriktning CAF beror inte på vilken typ av onkogena mutationer i tumörcellerna. Tredje, inriktning CAF kan uppnå flera träffeffekter genom fibroblaster-beroende anti-tumör, anti-angiogenes, och / eller modulerande cancer immunsvar. Vår 3D-sfäroida modell är ett kraftfullt verktyg för att upptäcka olika uppsättningar av cancer terapeutiska strategier.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Omaida C. Velazquez (University of Miami) för hjälpsamma samarbete, samråd och diskussion; Dr Jie Li (University of Miami) för att tillhandahålla MeWo celler; och Dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) för att tillhandahålla alla andra melanomceller. Vi tackar också Dr Marcia Boulina, chef för Analytical Imaging Core Facility, University of Miami, för bildbehandling analys. Zhao-Jun Liu stöddes av bidrag från Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award# 09BN-11), Women's Cancer Association (den53: e årliga bidrag) och interna medel från University of Miami.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-253-CI | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid |
| Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technology | A21202 | |
| CaCl2 1.5 M | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Collagenase, Type 1A | Sigma-Aldrich | C-2674 | 500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM. |
| DakoCytomation | Dako | x0909 | |
| DAPI | |||
| Dispase Grade II | Roche Diagnostics | 165859 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | VMR | 97068-085 | Premium Grade |
| Fiji (ImageJ) | NIH | Free for downloading, no license needed. | |
| IncuCyte Zoom 2016A | Essen Bioscience | ||
| IncuCyte Zoom System | Essen Bioscience | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | |
| Leica SP5 Inverted Confocal Microscope | Leica | ||
| MCDB 153 Medium | Sigma-Aldrich | M7403-10X1L | |
| Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monoclone | Abcam | ab18640 | |
| Olympus IX51 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX51 | |
| Olymupus CellSens | Olympus | ||
| PD0325901 | Selleckchem Chemicals | S1036 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Corning | 30-002- CI | 100 X |
| Sodium Bicarbonate 7.5% | Corning | 25-035-CI |
References
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).
- Anton, K., Glod, J. Targeting the tumor stroma in cancer therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Lynch, C. C., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation. 70, 561-573 (2002).
- Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).
- Olumi, A. F., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Luga, V., et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell. 151, 1542-1556 (2012).
- Zhang, X. H., et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell. 154, 1060-1073 (2013).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Shao, H., et al. Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1. Oncogene. 30, 4316 (2011).
- Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontier in Immunology. 9, 414 (2018).
- Kraman, M., et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha. Science. 330, 827-830 (2010).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).
- Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. Melanocytes: from morphology to application. Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling melanoma in vitro and in vivo. Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17, 1-15 (2015).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).
- Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids. Scientific Reports. 7, 16645 (2017).
- Lazzari, G., et al. Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity. Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Gu, L., Mooney, D. J. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).
- Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment. Advanced Biosystems. 1, (2017).
- Welch, D. R., et al. Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line. International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).
- Balint, K., et al. Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression. Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).
- Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).
- Du, Y., et al. Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells. Stem Cells. 37, 865-875 (2019).
- Shao, H., et al. Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion. PLoS One. 10, 0142815 (2015).
- Shao, H., et al. Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis. Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).
- Kalluri, R., Neilson, E. G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).
- Price, J. E. Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models. Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).
- Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4, 4992 (2009).
