Summary
Her præsenterer vi den molekylære karakterisering af dystrophin 38 udtryk ved hjælp af Sanger sekventering, RT-PCR, og vestlige blotting i det kliniske forsøg.
Abstract
Duchenne muskelsvind (DMD) er en degenerativ muskelsygdom, der forårsager progressiv tab af muskelmasse, fører til for tidlig død. Mutationerne forårsager ofte en forvrænget læseramme og for tidlig stop codons, hvilket resulterer i en næsten total mangel på dystrophinprotein. Læserammen kan korrigeres ved hjælp af antisense oligonukleotider (AION), der fremkalder exon springe. Den morpholino AON viltolarsen (kodenavn: NS-065/NCNP-01) har vist sig at fremkalde exon 53 springe, genoprette læserammen for patienter med exon 52 sletninger. Vi har for nylig administreret NS-065/NCNP-01 intravenøst til DMD patienter i en sonderende investigator-initieret, first-in-human forsøg med NS-065/NCNP-01. I denne artikel præsenterer vi den molekylære karakterisering af dystrophinudtryk ved hjælp af Sanger-sekvensering, RT-PCR og vestlig blotting i det kliniske forsøg. Karakteriseringen af dystrophinudtryk var grundlæggende i undersøgelsen for at vise effekten, da der ikke blev udført funktionelle resultattest.
Introduction
Duchenne muskelsvind (DMD) er en degenerativ muskelsygdom forårsager progressiv tab af muskelmasse, respirationssvigt, og kardiomyopati, og det fører til for tidlig død1. Sygdommen er forårsaget af en mangel på de store strukturelle muskel protein dystrophin2. Mutationer i DMD-genet på X-kromosomet er recessive, og sygdommen påvirker 1 ud af 3500-5000 nyfødte mænd3,4,5. Mutationerne er ofte store sletninger i et hotspot område mellem exons 44 og 55, der fører til en forvrænget læseramme og for tidlig stop codons, forårsager nonsens-medieret forfald og en næsten total mangel på dystrophin protein6,7,8. Læserammen kan korrigeres ved hjælp af antisense oligonukleotider (AION), der fremkalder exon springe og genoprette læserammen, delvist genoprette dystrophin udtryk og forsinke sygdomsprogression9,10,11. Den morpholino AON eteplirsen, som for nylig blev godkendt af Federal Drug Agency (FDA), inducerer springe exon 51 og kan genoprette læserammen hos patienter med exon 52 sletninger12,13. Men exon 53 springer genskaber læserammen for patienter med exon 52 sletninger, og det kan potentielt behandle ca 10% af DMD patienter14. Det har vist sig, at morolino AON-lægemidlet NS-065/NCNP-01 fremkalder exon 53, der springer over i humane celler, og vi har for nylig administreret NS-065/NCNP-01 til DMD patienter i en fase 1 åben dosis-eskalering kliniske forsøg (i det følgende benævnt "undersøgelsen") (registreret som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Undersøgelsen viste en dosisafhængig stigning i exon 53 springe baseret på RT-PCR og dystrophin protein niveauer baseret på vestlige blotting, og ingen alvorlige bivirkninger eller frafald blev observeret14.
I alle kliniske forsøg er analysen af resultaterne af afgørende betydning. For DMD kliniske forsøg, er en debat stadig i gang om den bedste metode til at vise en behandling fordel. Kliniske tests såsom 6-minutters gang test har visse ulemper. Molekylær karakterisering af dystrophinudtrykket kan udføres ved hjælp af flere metoder, såsom RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting og immunohistochemistry. Men omfanget af proteinudtryk restaurering, der er nødvendig for at give en klinisk fordel er fortsat uklart. I denne artikel beskriver vi i detaljer de RT-PCR og vestlige blotting metoder, der anvendes til at bestemme exon springe og protein niveauer, henholdsvis i fase 1 forsøg med AON springe stof NS-065/NCNP-0114.
Protocol
Den operationelle procedure for det investigator-initierede forsøg er blevet godkendt af NCNP's etiske udvalg (godkendelses-id: A2013-019).
1. Forberedelse af muskelprøver
BEMÆRK: Biceps brachii eller quadriceps muskler er ofte valgt som biopsi sites. Tibialis anterior blev dog anvendt i det kliniske forsøg.
-
Muskelbiopsi fra patienter
- Marker indsnitsstedet før hudpræparat.
- Forbered saltvandsdæmpet gaze til biopsiprøven. Klem gaze godt.
- Injicer lokalbedøvelse i huden og subkutant væv, men ikke i musklen. Sørg for dybden af anæstesi ved fraværet af kutane smerter.
BEMÆRK: Generel anæstesi anvendes normalt til pædiatriske patienter under 15 år. - Lav et snit fra huden til det subkutane væv. Brug små retraktorer til at åbne snittet og adskille det subkutane fedt.
BEMÆRK: På dette trin kan en del af huden skæres til fibroblast kultur. - Lav en anden lille snit i fascia og skær fascia yderligere. Fastspænd kanterne ved hjælp af myg snaft til at udsætte musklen.
- Brug en sutur til at trække op den valgte del af musklen. Lav en lille tunnel ved hjælp af Iris saks og indsæt myg scener i tunnelen.
- Adskaf muskelbundtet ved hjælp af scener og skær begge ender af måldelen.
BEMÆRK: Muskelbiopsiprøver skal være på størrelse med en blyant til voksne patienter (længde 1,0-1,5 cm, diameter 0,8-1,0 cm). Prøven skal være ca. 1 cm lang og 5 mm i diameter hos pædiatriske patienter. - Prøven ombrydes i saltdæmpet gaze, og den friske muskel ved stuetemperatur (RT) omkuld straks til et anlæg, hvor prøven kan fremstilles til yderligere analyse.
BEMÆRK: Prøverne skal transporteres ved 4 °C, hvis transportvarigheden overstiger 1 time.
2. Forberedelse af muskelprøve
- Bland lige store mængder tragacanth gummi og vand, indtil tyggegummi bliver blød og klæbrig. Blandingen læsses i 25 ml sprøjter. Sprøjterne kan opbevares i køleskab.
- Placer ca 0,5 til 1 cm tragacanth tyggegummi på kork skiver. Mærl diskene på den modsatte side.
- Placer en beholder med isopentan i flydende nitrogen, indtil noget af væsken fryser.
- Anse prøven i tragacanth gummi. Den langsgående akse af hver muskel skal være vinkelret på kork. Placer tyggegummi omkring bunden af hver muskel til at hjælpe korrekt placering.
- Ved hjælp af en pincet skal muskel-/korkprøven anvendes i kold isopentans, der er fremstillet i trin 2.3, for at fryse. Bevæg prøven konstant i 1 min eller indtil helt frosset, og placer på tøris midlertidigt.
- Prøven i glashætteglas og opbevares ved -80 °C.
3. Muskelsektion
- Der er 100 til trækning med en arbejdstemperatur på -25 °C.
- Monter kork/muskelblokken, og trim indtil der er opnået flade sektioner.
- Brug en sektionstykkelse på 10 μm til RT-PCR og vestlig blotting. Brug en tykkelse på henholdsvis 6-8 μm og 10-12 μm for immunhistokemi eller hæmatoxylin og eosinfarvning. Skåret sektioner i 2,0 ml rør og opbevares ved -80 °C for RT-PCR og vestlige blotting.
4. RNA-ekstraktion og omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-PCR)
- Uddrag ca. 10 skiver med 10 μm tykkelse fra frossen muskel af en kryostat. Opsaml det rensede totale RNA ved hjælp af rensesættet af total RNA i henhold til producentens anvisninger.
- Mål RNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kombiner de nødvendige reagenser til en RT-PCR-reaktion i PCR-rør i henhold til tabel 1. Se tabel 2 for primersekvenser.
BEMÆRK: Den forreste primer var 44F for patient NS-03 og 46F for patient NS-07. Den omvendte primer var 54/55R som standard. Hvis ikke-specifikke produkter var indlysende, blev 54R anvendt som et alternativ. - Placer PCR-rørene, der indeholder blandingen, i en termocyrker. Kør termocyren i henhold til tabel 3.
- Opbevar PCR-produktet ved 4 °C til korttidsopbevaring eller -20 °C til langtidsopbevaring.
5. Mikrochip elektroforese og exon springe beregning
BEMÆRK: En mikrochip elektroforese (MCE) system er ofte valgt til at analysere exon springe effektivitet. I denne protokol beskriver vi de trin, der er nødvendige for at analysere exon springe effektivitet ved hjælp af et MCE-system af producent A samt fra producent B, herefter kaldet system A og B. Under det kliniske forsøg blev exon skipping effektivitet analyseret på system A. Men, system A er ikke længere til salg, og vi anbefaler system B til at analysere exon springe effektivitet. Vi har medtaget protokoller for begge systemer (se afsnit 5.1 for system A og 5.2 for system B). Se Tabel over materialer for information om system A og B. Desuden kan dette trin også udføres med normal agarose gel elektroforese, men følsomheden markant falder.
- Mikrochip elektroforese ved hjælp af System A
BEMÆRK: System A har to typer af chips. Her beskriver vi trinene til DNA-chippen.- Equilibrate kit reagenser (pletbuffer, læssebuffer, stige og gelbuffer) til RT, vortex og drej ned.
- For at forberede gel-plet buffer (GS), tilsættes 12,5 μL plet buffer til 250 μL gel buffer og vortex til 10 s. Flyt opløsningen til et spinfilterrør og centrifuge ved 2.400 x g i 15 min. Kassér filteret.
BEMÆRK: Den filtrerede GS kan opbevares ved 4 °C i 1 måned. - Hvis prøverne er stærkt koncentrerede, fortyndes til ca. 50 ng/μL med TE-buffer eller DNase-frit vand.
BEMÆRK: Hvis prøverne er i en saltkoncentration ≥ 200 mM KCl (eller NaCl) og/eller 15 mM MgCl2, skal bufferen udskiftes. - Der tilsættes 12 μL GS-opløsning til gelprimingbænningen (fremhævet og mærket GS) af DNA-chippen, og chippen sættes i primingstationen.
BEMÆRK: For at undgå luftbobler skal pipettespidsen indsættes lodret og i bunden af brønden, når du dispenserer. Dispenser langsomt til det første stop på pipetten, og udstød ikke luft for enden af pipetteringstrinnet. - Vælg C3-tilstand, og tryk på knappen Start. Når priming er afsluttet, skal du fjerne chippen.
- Synd mikrokanalerne visuelt for fanget luftbobler eller ufuldstændig priming.
- Læg de forberedte prøver og stigen på chippen som nedenfor.
- Pipette 9 μL GS-opløsning i de andre 3 GS-brønde.
- Pipette 5 μL læssebuffer i L-brønden og hver prøvebæt (1-11).
- Pipette 1 μL stige ind i L brønden.
- Pipette 1 μL DNA-prøve i hver af de 11 prøvebeholdere.
- Pipette 1 μL TE eller DNase-frit vand i ubrugte brønde. Sættets hurtigguide viser en figur af chippens layout.
BEMÆRK: Undersøg alle brønde for luftbobler ved at holde chippen over en let farvet baggrund. Forkubm eventuelle fanget luftbobler i bunden af en brønd med en ren pipettespids eller ved at fjerne og genindlæse opløsningen.
- Placer chippen i vortex stationen og trykmix . Vortex stationen stopper automatisk efter 1 min.
- Kør chippen i elektroforesestationen inden for 5 minutter efter belastningen.
- Vælg Ny kørsel på værktøjslinjen software. På skærmen New Run skal du vælge DNA og DNA 1K på analysens rulleliste.
- Vælg enten en projektmappe til kørslen på rullelisten Projekt, eller opret en ny projektmappe ved at angive et navn i feltet Projekt.
- Angiv et navn til kørslen i feltet Kør præfiks, og klik på Start kørsel.
- Instrumentet bipper, når analysen er færdig, og der åbnes et vindue, der angiver slutningen af kørslen. Vælg OK, og fjern chippen fra chipplatformen.
- Vælg fil | Eksporter data for at eksportere dataene. Vælg de ønskede indstillinger i dialogboksen Eksportér.
- For at rengøre elektroderne skal du fylde en rengøringsmidlerschip med 800 μL deioniseret vand og placere den på spånplatformen, lukke låget og lade den være lukket i 1 min. Efter 1 min, åbne låget, fjerne rengøringschippen, og lad elektroderne tørre i 1 min.
- Mikrochip elektroforese ved hjælp af system B
- Åbn driftssoftwaren, og angiv eksempeloplysningerne. Når du har indtastet oplysningerne, beregner softwaren automatisk mængden af separatbuffer- og markørløsninger.
- Forbered den nødvendige mængde separatbuffer, der er beregnet af softwaren. Først forberedes 100x nukleinsyregelpletopløsning ved at fortynde 10.000x opløsning med den passende mængde TE-buffer. 100x opløsningen kan opbevares ved -20 °C.
- Bland en passende mængde 100x nukleinsyre gel plet medseparation buffer i det specifikke rør, som virksomheden til at forberede en 1x opløsning. Vortex løsningen.
- Forbered den nødvendige mængde markøropløsning i røret.
- Start sondevaskeprogrammet.
- Start mikrochipvask-programmet, når det er færdigt.
- Samtidig pipette prøverne til en PCR multiplate (96-godt, klar) og fortyndes 4 gange med deioniseret vand. Det mindste volumen, som maskinen kan håndtere, er 6 μL, og maksimum er 30 μL. Vi foreslår et samlet volumen på 10 μL (2,5 μL prøve og 7,5 μL vand/TE-buffer).
- Dæk pladerne med selvklæbende PCR-tætningsfolieplader og nedspinning af prøverne.
- Indstil pladen, markørløsningen og 1x separatbufferen i maskinen i overensstemmelse med den placering, der vises af maskinen. Tryk på knappen Start.
- Når kørslen er færdig, skal du eksportere resultatdataene som en .csv-fil fra softwaren og beregne exon-springeeffektiviteten ved hjælp af molære koncentration som følger:
Exon springe effektivitet (%) = (Sprunget band / (Sprunget band + Ikke-sprunget band) X 100
6. Komplementær DNA -sekvensering
-
Agarose gel forberedelse
- Mål 1,5 g agarosepulver, og pulveret blandes med 100 ml 1x TAE-buffer i en mikrowavbar kolbe (hvilket resulterer i en 1,5% agarosegel).
- Mikrobølgeovn i 1-3 min, indtil agarose er helt opløst.
BEMÆRK: Overboil ikke opløsningen, da nogle af bufferen vil fordampe og ændre den endelige agaroseprocent af gelen. - Agaroseopløsningen afkøles til ca. 50 °C.
- Der tilsættes 10 μL 10.000x fluorescerende nukleinsyrefarvestof til agaroseopløsningen.
- Hæld agarose i en gel bakke med godt kam på plads. Lad på RT i 20-30 min, indtil det er helt størknet.
-
Sekventering
- Bland 5 μL RT-PCR-produkt (fra trin 4.4) og 1 μL 6x læssebuffer. Læg dem i brøndene på 1,5% agarosegel.
- Kør gelen ved 135 V i 5 min og 120 V i 20 min.
- Visualiser båndene ved hjælp af en transilluminator i henhold til producentens protokol.
- Punktafgifter bånd af interesse fra gel og bruge en gel og PCR oprydning kit til at hente RT-PCR produkter.
- Mål koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Det rensede bånd kan sendes til sekvensering på en virksomhed eller sekventeringsanlæg, hvis der ikke er noget Sanger-sekvensudstyr til rådighed internt. - De nødvendige reagenser klargøres til et cyklussekventeringssæt og pipette til en PCR-plade med flere plader i henhold til tabel 4. Se tabel 2 for primersekvenser.
- Forsegle pladen med klar klæbende film.
- Vortex pladen i 2 til 3 s. Centrifuge kort i en svingende spand centrifuge, således at indholdet afregne til bunden af brøndene (5 til 10 s) på 1.000 x g.
BEMÆRK: Luftbobler kan være til stede i brøndene, men de påvirker ikke reaktionen negativt. - Blandingen i en termocykator og køres i overensstemmelse med tabel 5.
- Rensning af sekventeringsreaktionerne med plader i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Brug en DNA-analysator til at bestemme sekvenserne i henhold til producentens protokol.
- Sammenlign den opnåede sekvens med patientens forventede rækkefølge.
7. Vestlige blotting
- Forberedelse af prøver
- Forbered SDS prøve buffer (4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 70 mM Tris-HCl pH 6,4, 0,001% bromophenol blå, og proteasehæmmer).
- Placer omkring 100 skiver af de 10 μm muskelsektioner indsamlet fra kryosektion i 150 μL SDS-buffer.
- Kortvarigt homogenisere proteinprøverne på is i 30 s ved hjælp af en handy mikro homogenisator.
- Centrifuge ved 16.500 x g i 15 min. og overfør supernatanten til et frisk rør. Fortsætte med analyse eller opbevaring ved -80 °C.
- SDS-PAGE til måling af proteinkoncentration
BEMÆRK: En fluorescerende gelplet blev brugt til at bestemme proteinkoncentrationen.- Den normale sunde kontrolprøvevægt og koncentrationen bestemmes ved hjælp af BCA-proteinanalysesættet i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Forbered prøverne til gelelektrophoresis. Pipette 10 μg totalprotein af den sunde kontrol og 5 μL af patientprøverne, 5 μL 4x prøvebuffer, 2 μL 10x prøvereducerende middel. Når disse er blevet blandet, tilsættes deioniseret vand til et endeligt volumen på 20 μL i hver prøve.
- Varm prøver ved 70 °C i 10 min.
- Forbered 2.000 ml 1x SDS-løbebuffer ved hjælp af 50 ml 40x SDS-løbebuffer. Fortyndes med 1.950 ml deioniseret vand.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er 1.000 ml løbebuffer nok. Den resterende 1.000 mL-buffer bruges ved trin 7.3.1. - Bland grundigt og der er afsat 800 ml af 1x SDS løbebufferen til brug i gelboksens nederste (ydre) bufferkammer.
- Umiddelbart før elektroforese tilsættes 500 μL antioxidant buffer til 200 ml 1x SDS løbebuffer til brug i gelboksens øvre (indre) bufferkammer.
- Forbered dig på gelelektrophoresis ved at oprette en 3-8% Tris-acetatgel i henhold til producentens protokol. Der skal indlæst 20 μL af hver prøve på gelen.
- Udfør elektroforese ved 150 V i 75 min.
- Efter elektroforese, placere gelen direkte i en ren bakke, der indeholder 50 ml fluorescerende gel plet opløsning.
- Dæk bakken, placer den på en shaker, og agit uden at sprøjte væske eller beskadige gelen i 90 min.
- Gelen overføres til vand, før den aflyses i et fluorescenssystem ved 312 nm belysning med ethidiumbromidemissionsfilter for at detektere fluorescens.
- Patientprøverne måles på grundlag af en analysekurve, der er konstrueret ved hjælp af det normale kontrollysat med kendt koncentration.
- SDS-PAGE til vestlig blotting
- Gelboksen klargør gelboksen i henhold til trin 7.2.4-7.2.6.
- På grundlag af den koncentrationsmåling, der er opnået i trin 7.2.11, skal der indlæsts 100 μg pr. vognbane med sund kontrollyat og 300 μg pr. vognbane i patientprøven. Elektroforese ved hjælp af de samme indstillinger som trin 7.2.7.
- Proteinoverførsel
- Forbered overførselsbufferen. Læg en PVDF-membran i blød i 20 s i methanol. Flyt den til blotting buffer B, indtil den bruges.
- Læg et ekstra tykt blotting-papir i blotting buffer A, B og C i blød i mindst 30 min. pr. buffer.
- Efter elektroforese lægges gelen i blød i blotting buffer B i 5 min.
- Læg blottingpapirer, PVDF-membraner og gel på den halvtørre overførselsmaskine i henhold til tegningen i figur 1. Rul luftbobler ud mellem gelen og membranen med en rulle.
- Overfør ved 2 mA/cm2 membran i 1 time ved RT.
BEMÆRK: Efter overførsel anbefales det at udføre en total proteinplet svarende til Ponceau-farvning for at bekræfte en vellykket overførsel af de store molekylvægtproteiner.
- Blokering og antistof farvning
- Skyl membranen to gange med PBST (1x PBS med 0,1% Tween 20).
- Placer membranen i 1% blokeringsmiddel, og rock forsigtigt i 1 time på RT at blokere.
- Inkuber membranen med antidystrofiinantistof i blokerende opløsning (1:125) og antispektrinantistof (1:25.000) i 1 time ved RT eller natten over ved 4 °C.
- Membranen vaskes tre gange i 10 minutter hver med PBST ved RT.
- Inkuber membranen med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundært antimus/kaninantistof i PBST (1:100) i 40 min ved RT.
- Membranen vaskes igen tre gange i 10 min. med PBST ved RT.
- Påvisning
- Bland detektionsopløsninger A og B i et forhold på 1:1. Det endelige volumen af detektionsreagesage er 0,1 ml/cm2-membran.
- Fjern den overskydende PBST fra den vaskede membran og læg den med proteinsiden op på et ark plastfolie eller andre egnede rene overflader. Det blandede detektionsreage på membranen og inkuber i 5 minutter ved RT.
- Fjern det overskydende detektionsreage ved at holde membranen forsigtigt i snænder og røre kanten mod et væv.
- Placer skamplet proteinsiden op på en prøvebakke. Jen fluorescerende systemet i henhold til brugerdokumentationen. Sæt maskinen som følger. Eksponeringstype: Forøgelse, Intervaltid: 10 s, Følsomhed/opløsning: høj.
BEMÆRK: Målte områder blev bokset med et blåt rektangel (Figur 4a-b):BG: baggrund; D: dystrophin 427 kDa, SL: spectrin beta lang isoform (274 kDa); SS: kort isoform (253 kDa). Dystrophin/spectrin signalforhold blev beregnet som (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Forholdet mellem normal kontrol blev sat til 100%.
Representative Results
For at bruge RT-PCR til at detektere exon springe, primere på hver side af exon, der vil blive sprunget blev designet og evalueret til kun at give specifikke bånd (se Figur 2 for en skematisk diagram af exon springe og primer position). Primere bør generere produkter, der let kan skelnes efter størrelse på et MCE-system eller normal agarosegelelektroforese, hvis MCE ikke er tilgængelig. Figur 3a viser MCE-system A-gelbilleder af RT-PCR-reaktioner og sekvenseringsresultaterne af det oversprændede bånd fra patienterne NS-03 og NS-07 før og efter behandling med NS-065/NCNP-01 i dosiseskaleringsfasen 1-studiet. NS-03 og NS-07 havn sletninger, der spænder exons 45-52 og 48-52, hhv. NS-03 fik 5 mg/kg og NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 ugentligt i 12 uger. Som forventet før behandlingen, begge patienter viste ingen spring, og kun en ikke-sprunget band kunne visualiseres. Efter 12 ugers behandling blev et klart sprunget lavere bånd visualiseret til NS-07. Det var dog stadig vanskeligt at opdage nogen sprunget produkt til patienten NS-03. Sekvenseringsresultaterne viste en sammenkædning af exons 47 og 54 for NS-07, samt exons 44 og 54 for NS-03. Ifølge sekvensen, disse kunne teoretisk producere en funktionel, men forkortet dystrophin isoform. For at beregne den springende procentdel, der er vist i figur 3b, blev molærekoncentrationen for det overspråede bånd divideret med det overspr., og det ikke-oversprudte bånd blev divideret med det oversprukne og ikke-oversprævende bånd. For patient NS-07 var procentdelen efter behandling 72%, og det var 3,4% for NS-03. Western blot-data (i tre eksemplarer) fra patienterne NS-03, NS-07 og en sund kontrol er vist i figur 4a. Forventet, ingen dystrophin band blev opdaget før behandling. Efter behandling blev der påvist et bånd fra patient NS-07 med en lavere molekylvægt sammenlignet med sund kontrol (vilddystrophin har en molekylvægt på 427 kDa, og NS-07 dystrophin har en molekylvægt på 389 kDa). På grund af exon sletning og springe, dystrophin isoform fra patienten NS-07 manglede flere exons, og det forventedes at have en lavere molekylvægt. Patient NS-03 viste ingen påviselige niveauer af dystrophin efter behandling. I figur 4bvises mængden af dystrophin sammenlignet med en sund kontrol for patient NS-07. Det sted, hvor signalintensiteterne blev målt til beregning af dystrophingendannelse, er angivet med blå firkanter. Dystrophinspektrinforholdet blev anvendt til at beregne mængden af dystrophin sammenlignet med den sunde kontrol. Til dette formål blev signalet fra dystrophin minus baggrund divideret med summen af de to spectrin isoformer (lang og kort) minus baggrund (se trin 8.6.5). Forholdet for sund kontrol blev sat til 100%. Mængden af dystrophin sammenlignet med den sunde kontrol hos patienten NS-07 efter behandlingen var 9,1%. Procentdelen kunne dog ikke beregnes for patient NS-03 på grund af et svagt dystrophinbånd, som svarede til dem, der blev opnået for tidligere behandlingsprøver for begge patienter.
Figur 1: Skematisk diagram over overførselsstakken til western blot-analyse. Samling af den vestlige blot overførsel stak med blotting papir dyppet i blotting buffer A i bunden efterfulgt af blotting papir dyppet i blotting buffer B, PVDF membran, 3-8% Tris-Acetat Gel og på top 2 blotting papirer dyppet i blotting buffer C er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk tegning af exon springe exon 53 hos en patient med exon 45-52 sletning i DMD genet. For eksempel, patient NS-03 i dosis-eskalering kliniske forsøg havde denne sletning. Hvis exon 53 bevares, vil mRNA være ude af rammen, da exon-exon krydset mellem exon 44 og 53 forstyrrer læserammen, hvilket forårsager et stop codon i exon 53. Læserammen gendannes, når exon 53 springes over, og der produceres en kortere isoform af dystrophin. For at opdage exon 53-spring af RT-PCR, primere i exon 44 og 54 anvendes, således at PCR-produkt mellem sprunget og un-sprunget mRNA let kan detekteres. FWD: forward primer, REV: omvendt primer, PMO: phosphorodiamidate morpholino oligomer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Spring effektiviteten over for patienterne NS-03 og NS-07 fra tibialis forreste muskelbiopsiprøver. a)Gel-billede genereret af elektroforesesystem A af RT-PCR-prøver af ubehandlede og behandlede prøver fra patienterne NS-03 og NS-07. Øverste panel viser NS-03 og nederste panel NS-07 i tre eksemplarer. For NS-03 er det ikke-oversprændede bånd 422 bp, og det overspr.,bånd er 212 bp. For NS-07 er båndene henholdsvis 836 bp og 624 bp. Sekvensanalyse viste en sammenkædning af exon 44 og exon 54 for NS-03 og exon 47 til exon 54 for NS-07. b)Spring effektivitet før og efter behandling er vist for patienter NS-03 og NS-07, beregnet ud fra molar koncentrationen af de to bånd, som system A som sprunget band / (sprunget band + un-sprunget band) x 100. Springe effektivitet for NS-03 var meget lav efter behandling; for NS-07 var springende effektivitet over 70%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Protein kvantificering af Dystrophin isoforms før og efter exon springe terapi. a)Protein kvantificering af dystrophinisoformer før og efter exon springer terapi. Western blot af muskelbiopsi fra tibialis anterior fra patienter NS-03 og NS-07 før og efter behandling og fra sund kontrol i tre eksemplarer. Dystrophin kan ses ved 427 kDa for den sunde kontrol og ved 389 kDa for NS-07 efter behandling. Der kunne ikke påvises dystrophin for hverken patienten før behandlingen, eller der kunne heller ikke påvises nogen efter behandling for patient NS-03. Området i den sorte boks er vist i figur 4b. Til venstre i hver skamplet vises markøren. b)Mængden af dystrophin genoprettet efter behandling for patienten NS-07. Dystrophin restaurering blev beregnet på grundlag af intensiteten af båndene for dystrophin, baggrund, og den lange og korte isoform af spectrin i henhold til formlen: (dystrophin - baggrund)/(spectrin L -baggrund) + (spectrin S - baggrund), hvor forholdet for sund kontrol er sat til 100%. Intensiteten af hvert bånd blev målt inde i de blå bokse vist i figuren. Dystrophingenopretningen til NS-07 var 9,1% efter behandling. Dystrophinsignalet var for svagt til at måle i de ubehandlede prøver. Markør størrelser er vist i kilodaltons. Dys: Dystrophin, BG: baggrund, SL: Spectrin lang isoform, SS: Spectrin kort isoform, My: Myosin type 1. Markør størrelser er vist i kilodaltons. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Volumen/reaktion (μl) | Endelig koncentration |
| RNase-frit vand (medfølgende) | Variabel | - |
| 5x QIAGEN OneStep RT-PCR-buffer | 5.0 | kr. |
| dNTP Mix (indeholdende 10 mM af hver dNTP) | 1.0 | 400 μM af hver dNTP |
| Forward Primer (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| Omvendt primer (10 μM) | 1.5 | 0,6 μM |
| QIAGEN OneStep RT-PCR enzymblanding | 1.0 | - |
| RNase-hæmmer (valgfrit) | Variabel | 5–10 enheder/reaktion |
| Skabelon RNA | 50 ng | |
| Samlede | 25 |
Tabel 1: RT-PCR-reagenser. De nødvendige forbindelser til en reaktion af RT-PCR.
| Primer | Sekvens |
| kr. | 5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3' |
| kr. | 5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3' |
| kr. | 5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCGCTCACTCACCCTTT-3' |
| kr. | 5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3' |
Tabel 2: Primerliste. Sekvenser for de primere, der anvendes i denne undersøgelse. F: Fremad, R: Omvendt.
| 1 cyklus | Omvendt transskription | 30 min. | 50 °C |
| 1 cyklus | Indledende pcr-aktiveringstrin | 15 min. | 95 °C |
| 35 cyklusser | Denaturering | 1 min. | 94 °C |
| Udglødning | 1 min. | 60 °C | |
| Udvidelse | 1 min. | 72 °C | |
| 1 cyklus | Endelig forlængelse | 7 min. | 72 °C |
| Holde | ∞ | 4 °C |
Tabel 3: Anvendt PCR-konditioneret. Vis PCR-betingelser for RT-PCR-reaktionen.
| Løsning | Volumen/reaktion (μl) |
| RNase-frit vand | Variabel |
| BigDye Terminator 3.1 Klar reaktion mix | 3.5 |
| Forreste Primer/Omvendt Primer (3,2 μM) | 2.0 |
| Skabelon RNA | 20 ng |
| Samlede | 20 |
Tabel 4: Reagenser, der er nødvendige for sekvensreaktionen. Brug enten Fremad- eller Omvendt primer i opsætningen, ikke begge dele på samme tid.
| 1 cyklus | 1 min. | 96 °C |
| 25 cyklusser | 10 s | 96 °C |
| 5 kr. | 50 °C | |
| 4 min. | 60 °C | |
| Holde | ∞ | 4 °C |
Tabel 5: PCR-betingelser for sanger-sekvensering.
Discussion
Kliniske forsøg med DMD har produceret både succeser og fiaskoer i de sidste par år. Både RT-PCR og vestlige blotting er fælles teknikker til at vurdere springe effektivitet genereret af exon-springe forbindelser administreres til patienterne. RT-PCR er dog blevet rapporteret for at overvurdere springe effektiviteten sammenlignet med digital PCR15. Selv om dette skyldes en række årsager, er det primært forårsaget af den mere effektive forstærkning af de mindre sprunget fragmenter under PCR cykler. Det fremgår, at RT-PCR, der anvendes i dette kliniske forsøg også genereret højere springe effektivitet i forhold til protein udtryk anslået ved vestlige blotting. Ifølge FDA, Dette er en mere pålidelig måde at kvantificere dystrophin restaurering12. Derfor bør der udvises forsigtighed, når du fortolker RT-PCR springe resultater; prøverne kan dog stadig sammenlignes. Prøver, der viser højere springe effektivitet baseret på RT-PCR resultater almindeligvis exhbit højere proteinudtryk niveauer i vestlige blot analyser.
Da alle patienter i dmd kliniske forsøg ikke har det samme sletningsmønster, kan det være svært at designe primere og sonder, der er tilstrækkeligt specifikke til at udføre digital eller qPCR på alle prøver. Derfor rt-PCR er stadig et godt alternativ til en første vurdering af springe effektivitet. Før det kliniske forsøg med NS-065/NCNP-01 begyndte, var det kedeligt at vurdere springe effektivitet for hver patient in vitro, da enten en muskel eller hud biopsi var obligatorisk at generere patient-specifikke myoblaster. Men vi har for nylig offentliggjort en ny teknik til at generere patient-specifikke MYOD1-konverterede, urin-afledte celler (UDCs) som en ny DMD muskel celle model16. Således er kun urin indsamlet fra patienten er forpligtet til at generere myoblaster, og ingen invasiv procedure er nødvendig. Vi mener, at denne metode kan bruges til at screene forskellige AO'er i patientspecifikke celler. Desuden kan forskellige primere og sonder testes, før patienten starter et klinisk forsøg. Dette kan lette brugen af qPCR eller digital PCR til exon springe måling i DMD kliniske forsøg i fremtiden.
Til udførelse af western blot-analyse i dette kliniske forsøg blev der anvendt et enkelt antistof mod dystrophin, og kun én sund kontrol blev anvendt som referenceprøve. Antistoffets specificitet blev derfor ikke valideret korrekt. Dette er sammen med det faktum, at antistoffet kun anerkender dystrophins C-terminaldomæne, en begrænsning af protokollen. Mere sunde kontroller og antistoffer rettet mod forskellige domæner af dystrophin molekyle er tilrådeligt i fremtiden.
Her opsummerede vi de protokoller, der blev brugt i den seneste sonderende investigator-initierede, første-i-menneskelige forsøg med NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 kan muligvis anvendes til 10,1 % af patienterne med DMD.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi er dr. Takashi Saito, dr. Tetsuya Nagata, hr. Satoshi Masuda og dr. Eri Takeshita for videnskabelige drøftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
- Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
- Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
- Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
- Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
- Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
- Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
- Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
- Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).
