Summary
Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.
Abstract
Van subtiele gedragsveranderingen tot laattijdige dementie ontwikkelt vasculaire cognitieve stoornissen zich meestal na cerebrale ischemie. Beroerte en hartstilstand zijn opmerkelijk seksueel dimorfe ziekten, en beide induceren cerebrale ischemie. Echter, vooruitgang in het begrijpen van de vasculaire cognitieve stoornissen, en vervolgens het ontwikkelen van seks-specifieke behandelingen, is deels beperkt door uitdagingen bij het onderzoeken van de hersenen microcirculatie van Muismodellen in functionele studies. Hier presenteren we een benadering om de capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken in een ex vivo hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole (hicapa) voorbereiding van muizenhersenen. We beschrijven hoe de microcirculatie te isoleren, te cannuleren en onder druk te zetten om de arteriolaire diameter te meten als reactie op capillaire stimulatie. We laten zien welke geschikte functionele controles kunnen worden gebruikt om de integriteit van de voorbereiding van de HiCaPA te valideren en typische resultaten weer te geven, waaronder het testen van kalium als een neurovasculaire koppelings agent en het effect van de recentelijk gekarakteriseerde remmer van de Kir2 actieve gelijkrichter kaliumkanaal familie, ML133. Verder vergelijken we de reacties in preparaten die zijn verkregen van mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel deze gegevens functioneel onderzoek weerspiegelen, kan onze aanpak ook worden gebruikt in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie studies.
Introduction
De Piale circulatie op het oppervlak van de hersenen is het voorwerp geweest van veel studie, deels vanwege de experimentele toegankelijkheid. Echter, de topologie van de cerebrale vasculatuur creëert verschillende regio's. In tegenstelling tot het robuuste pial-netwerk dat rijk is aan anastomosen met aanzienlijke capaciteit voor het omleiden van de bloedstroom, presenteren de intracerebrale parenchymale arteriolen (PAs) beperkte onderpand toevoer, elk met een discrete hoeveelheid zenuwweefsel1,2. Dit creëert een knelpunt effect op de bloedstroom die, in combinatie met unieke fysiologische kenmerken3,4,5,6,7,8, maakt intracerebrale arteriolen een cruciale plaats voor de cerebrale doorbloeding (CBF) voorschrift9,10. Ondanks de technische uitdagingen die inherent zijn aan de isolatie en de cannulatie van PAs, heeft de laatste tien jaar een toegenomen belangstelling voor ex-vivo -functionele studies met onder druk staande schepen11,12,13,14,15,16,17. Een van de redenen voor deze toegenomen belangstelling is de aanzienlijke onderzoeksinspanningen uitgevoerd op neurovasculaire koppeling (NVC), het mechanisme ondersteunen van de hersenen functionele hyperemie18.
Regionaal, CBF kan snel toenemen na lokale neurale activering19. De cellulaire mechanismen en signalering eigenschappen die NVC beheersen zijn niet volledig begrepen. Echter, we identificeerden een eerder onverwachte rol voor de hersen capillairen tijdens NVC in sensing neurale activiteit en vertalen in een hyperpolariserende elektrische signaal te verwijden stroomopwaarts arteriolen20,21,22. Actie potentialen23,24 en opening van grote-conductance CA2 +-geactiveerde K+ (BK) kanalen op de astrocytische endfeet25,26 Verhoog de concentratie van de interstitiële kalium ionen [K+]o, wat resulteert in de activering van sterke inkomende gelijkrichter K+ (KIR) kanalen in het vasculaire endotheel van de capillairen. Dit kanaal wordt geactiveerd door externe K+ , maar ook door hyperpolarisatie zelf. De hyperpolariserende stroom verspreidt zich door tussenruimte kruisingen en regenereert vervolgens in aangrenzende capillaire endotheliale cellen tot aan de Arteriole, waar het myocyten ontspanning en CBF verhoogt20,21. De studie van dit mechanisme leidde ons tot het ontwikkelen van een onder druk staande capillaire-parenchymale Arteriole (CaPA) voorbereiding voor het meten van de arteriollaire diameter tijdens capillaire stimulatie met vasoactieve agentia. De capa preparaat is samengesteld uit een gecanuleerde intracerebrale Arteriole segment met een intact, downstream capillaire vertachting. De capillaire uiteinden worden gecomprimeerd tegen de kamer glazen bodem door een micro Pipet, die de gehele vasculaire vorming20,21occludeert en stabiliseert.
Eerder maakten we instrumentale innovaties door Imaging Capa-preparaten uit de muis cortex20,21 en arteriolen van de rat amygdala13 en Hippocampus16,17. Aangezien de hippocampal therapieën meer aandacht krijgt vanwege de gevoeligheid voor pathologische omstandigheden, bieden we hier een stapsgewijze methode voor Capa-bereiding van de muis Hippocampus (hicapa) die niet alleen kan worden gebruikt in functionele NVC-studies, maar ook in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical campus en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. oplossingen
- Gebruik MOPS-gebufferde zoutoplossing voor de dissectie en om monsters bij 4 °C te houden vóór het gebruik ervan. Gas de oplossing niet. Bereid MOPS gebufferde zoutoplossing met volgende samenstelling: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2po4, 1 mm mgso4, 2,5 mm CACL2,5mm glucose, 3 mm Mops, 0,02 mm EDTA, 2 mm Pyruvate, 10 mg/ml boviene serumalbumine, pH 7,3 bij 4 °c.
- Gebruik kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) als de badoplossing en pipet oplossing. Gas zowel aCSF en CA2 +-gratis acsf met 5% Co2, 20% O2, en N2 balans. Bereid de oplossing voor met de volgende samenstelling: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mm Nah2po4, 1 mM MgCl2, 4 mm glucose, 2 mm CACL2, pH 7,3 (met beluchting met 5% Co2, 20% O2en N2 balans).
- Verkrijg de maximale verwijding in nominaal CA2 +-vrije acsf (0 mm [CA2 +]o, 5 mm EGTA).
2. bereiding van de orgaan kamer
- Steek de capillairen van borosilicaatglas (buitendiameter = 1,2 mm; binnendiameter = 0,69 mm; lengte = 10 cm) in een glazen trekker. Trek het capillair aan om een lange, dunne punt aan de ene kant te maken.
- Aan één kant van de kamer, voeg een canule die kan aansluiten op een miniatuur peristaltische pomp om luminally druk het vat. Breek de punt van de canule onder een dissectie Microscoop, zodat het klein genoeg is om het vat van belang te passen, maar groot genoeg om oplossingen door de tip te laten stromen. Zorg ervoor dat de punt ongeveer 10-15 μm in diameter is.
- Vul de canule met behulp van een injectiespuit met een bijgevoegde 0,22 μm filter met zuurstof zuur aCSF. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen of vuil in de canule aanwezig zijn.
- Voeg nog twee canules toe aan de andere kant van de kamer. Breek hun tips niet.
3. Hippocampus dissectie en isolatie
- Euthanize en onthapitate een muis. Gebruik voor dit experiment een 8 weken oude C57BL6/J-muis om verschillen tussen mannetjes en vrouwtjes te vergelijken. Injecteer de muis met pentobarbital en onthoofden met chirurgische schaar.
- Met behulp van kleine dissectie schaar, snijd de huid langs de middenlijn aan de bovenkant van het hoofd. Beweeg de huid naar de zijkanten.
- Begin aan de caudale kant van de schedel en snijd de schedel langs de middenlijn tot de olfactorische bollen zijn bereikt. Verwijder delen van de schedel totdat de hersenen zichtbaar zijn.
- Verwijder langzaam de hersenen, beginnend bij de neus van de muis. Scheid de hersenen van de olfactorische bollen, craniale zenuwen en het ruggenmerg door de structuren te snijden met de kleine dissectie schaar.
- Plaats de hersenen in een dissectie plaat met voldoende MOPS-oplossing om het volledig te laten onderdompelen. Met behulp van een dissectie Microscoop, plaats de hersenen in het midden van de dissectie plaat met de ventrale zijde naar beneden gericht.
- Met behulp van een scheermesje, snijd je de hersenen in tweeën langs de longitudinale spleet. Houd het mesje zo dat de scherpe rand evenwijdig is aan de onderkant van de dissectie plaat. Druk het mes in één slag door de hersenen. Beweeg een halve bol naar de zijkant van de plaat.
- Voer de volgende stappen voor elke halve bol afzonderlijk of parallel uit.
- Plaats een halve bol in het midden van de plaat zodat de middenlijn naar beneden is gericht. Gebruik vervolgens het scheermesje om langs de dwars spleet te snijden om de cerebellum en de hersenstam te verwijderen. Duw het blad recht door het weefsel.
- Draai de hemisfeer zodanig dat de mediale zijde naar boven is gericht (Figuur 1A). Gebruik één spatel om de hersenen op zijn plaats te houden. Met behulp van een tweede spatel, steek de punt onder het corpus callosum en schep eronder om de thalamus, septum en hypothalamus te verwijderen, bedekt de Hippocampus (Figuur 1B).
- Zorg ervoor dat de hippocampus is nu zichtbaar als een gebogen structuur in de buurt van de achterste kant van de cerebrum. Met behulp van één spatel te houden van de hersenen op zijn plaats, gebruik maken van de tweede spatel te Scoop de Hippocampus uit de hersenen (Figuur 1C).
- Breng de hippocampi over naar een nieuwe dissectie plaat gevuld ongeveer halverwege met MOPS-oplossing. Gooi de rest van de hersenen weg.
4. hippocampal Arteriole isolatie
- Voltooi de volgende stappen voor elke Hippocampus.
- Speld een van de hippocampi met behulp van kleine pinnen aan elk uiteinde van de sectie. De hippocampal slagader is naar boven gericht.
- Met behulp van zeer scherpe Tang, voorzichtig rekken kleine delen van de hippocampus. Dit zal het weefsel rond de arteriolen losmaken, waardoor het gemakkelijker is om ze te ontleden.
- Zoek door het rugweefsel van hippocampal om de uitwendige dwarse slagader te identificeren (Figuur 1C)16,27.
- Pak voorzichtig de uitwendige dwarse slagader en trek hem langzaam weg van het weefsel om de arteriolen en haarvaten te verzamelen die de CA3-regio van de Hippocampus perfectiongebruiken.
- Zodra er geen vaten meer uit het weefsel verwijderd worden, gooi de hippocampi weg. Houd de vaten op het ijs in de platen terwijl ze niet in gebruik zijn.
5. hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole cannulatie
- Vind een Arteriole met een tak die eindigt met haarvaten. Breng het over naar de orgaan kamer. Zorg ervoor dat de Arteriole is ongeveer 15-30 μm wanneer volledig verwijd (Figuur 1D).
- Monteer het bloedvat voorzichtig door de canule Tip door de Arteriole Wall onder het doelgebied te duwen. Schuif het vat voorzichtig op de canule totdat er voldoende weefsel is om de stropdas op te plaatsen.
- Maak een losse knoop met 12-0 nylon hechtingen zodat deze over het bloedvat en de canule past. Gebruik een half-Hitch knoop om banden te beveiligen. Trek vervolgens aan de uiteinden om de knoop aan te spannen en de Arteriole aan de canule te beveiligen. Verwijder alle externe takken van het vaartuig onder de stropdas door ze zachtjes met een tang te trekken.
- Maak een andere stropdas en Beveilig het aan de andere kant van de Arteriole om het te verzegelen.
- Verlaag de canule met het bijgevoegde vat totdat deze plat is tegen de afdekplaat aan de onderkant van de kamer. Wees voorzichtig om de canule niet te veel te verlagen of het zal breken.
- Met behulp van een canule aan de andere kant van de kamer, verlaag het zo dat het punt van het pinnen van de stropdas op het einde van de Arteriole.
- Gebruik de derde canule om de capillaire tak aan de dekslip te vastmaken. Plaats het uiteinde dicht bij het uiteinde van de tak en laat de uiteinden van de haarvaten bloot (niet onder de canule).
6. myografie van de druk
- Verplaats de kamer van het dissectie bereik naar de microscoop met de opname software.
- Sluit de toevoer-en uitstroom slang aan op de kamer voor perfusie. Start de perfusie met verwarmde aCSF (37 °C) met een debiet van 4 mL/min.
- Bevestig de druk canule aan een peristaltische pomp in combinatie met een druk transducer en breng de inwendige druk op 20 mm Hg.
- Start de opname software. Pas de Microscoop-en beeldvormings instellingen aan om het duidelijkste beeld te bereiken. Start de opname zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd voor de detectie software.
- Verhoog de druk van het vat tot 40 mm Hg tijdens het opnemen van de arteriële diameter met een randdetectie software.
- Laat ~ 15-20 min om MOPS-oplossing uit de kamer te spoelen met aCSF, en om de HiCaPA-bereiding te laten equilibreren en myogene Toon te ontwikkelen.
- Om de levensvatbaarheid van een vat te testen, breng 1 μM NS309 oplossing aan op de badperfusie (Zie Figuur 2a, B en de sectie representatieve resultaten). Het arteriollaire segment moet verwijden, waarbij ongeveer 30-40% myogene Toon wordt aangetoond zoals eerder beschreven3,14,20.
7. focale stimulatie van capillaire uiteinden
- Zodra de basislijn Toon voor de Arteriole is vastgesteld en de endotheliale functie is beoordeeld, test de respons van capillaire stimulatie.
- Met behulp van een glazen trekker, maken canules zodat er een fijne punt aan de ene kant. Breek de tip van een canule zodat het geteste medicijn door de tip soepel kan stromen bij 5 psi.
- Vul de canule met de drug-oplossing van belang en voeg deze toe aan een 3-assige micro manipulator bevestigd aan de Microscoop. Sluit de slang van het drukejectiesysteem aan op de canule.
- Verlaag de canule langzaam in het bad in de buurt van de haarvaten, en zorg ervoor dat u geen enkel deel van het vat of de hardware in de kamer raakt. Manoeuvreren de punt van de canule naast de uiteinden van de haarvaten zonder ze aan te raken. Houd de punt van de canule net buiten de dekslip om te voorkomen dat het vat wordt gestimuleerd als de canule lekt.
- Wanneer klaar om de haarvaten te stimuleren, verlaagt u de canule naar de dekslip en net naast de haarvaten. Activeer het drukejectiesysteem met de gewenste ejectietijd (hier 20 s). Zodra de stimulatie is voltooid, verhoogt u de canule iets om verdere stimulatie te voorkomen.
- Herhaal de stimulatie indien nodig. Verander het drukejectiesysteem canule om verschillende geneesmiddel verbindingen te testen.
- Om te bevestigen dat alleen de capillairen worden gestimuleerd, vult u de canule met 1 μM NS309 oplossing en herhaalt u de bovenstaande stappen.
Opmerking: capillaire endotheliale cellen niet uitdrukken K+ kanalen geactiveerd door NS309, zodat de Arteriole mag niet reageren op de stimulatie. Als de Arteriole verwijde, dan zal de canule moeten worden verplaatst of de diameter van het gat moet kleiner zijn (Zie Figuur 2A, B en de representatieve resultaten sectie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotheliale Small-conductance (SK) en intermediaire-conductance (IK) CA2 +-gevoelige K+ kanalen oefenen een dilatorische invloed uit op de diameter van de PAs. Bad toepassing van 1 μM NS309, een synthetische IK en SK kanaal agonist, veroorzaakt in de buurt van maximale verwijding (Figuur 2a, B). Echter, capillaire endotheliale cellen missen IK en SK kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op NS30920. Als gevolg daarvan, stimulerende capillaire uiteinden met 1 μM NS309 door focale druk ejectie (20 s, 5 psi) veroorzaakt geen upstream arteriollaire verwijding (Figuur 2a, B). Dit resultaat geeft aan dat NS309 de Arteriole niet in de HiCaPA-preparaten heeft bereikt en als controle kan worden gebruikt om de ruimtelijke beperking van de samengestelde stof op de capillairen te beoordelen door middel van druk uitwerpen.
Dit preparaat was fundamenteel ontworpen voor de meting van binnenstebuiten elektrische signalering van haarvaten naar PAs. Met behulp van de hicapa voorbereiding, we toegepast acsf met 10 mm K+ op de capillaire uiteinden en gemeten een upstream tortuositeit verwijding (Figuur 2A, C) zoals we eerder deden in Capa preparaten van de corticale therapieën20. Vervolgens onderzochten we, voor de eerste keer naar onze kennis, capillaire-aan-Arteriole elektrische signalering in vrouwelijke muizen met behulp van HiCaPA preparaten. Arteriollaire verwijding, opgeroepen door een capillaire stimulatie met 10 mM K+ , verschilt niet tussen de preparaten van mannelijke en vrouwelijke muizen (Figuur 2A, C).
Ten slotte is een ander fundamenteel voordeel van deze aanpak de mogelijkheid om farmacologisch gereedschap in het bad toe te passen voor capillaire stimulatie. Hier testten we het effect van ML133, een recent ontwikkelde Kir2 remmer28. Toevoeging van 10 μM ML133 aan het bad perfusie vrijwel afgeschaft capillaire-geïnduceerde arteriollaire verwijding in reactie op 10 mM K+ in hicapa preparaten van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen (Figuur 2A, C). Dit laatste resultaat suggereert dat de Kir 2.1 kanaal bemiddelt elektrische signalering in vrouwelijke cerebrale vasculatuur zoals we eerder beschreven in de corticale microcirculatie van de mannelijke hersenen.
Figuur 1: methodologie voor isolatie en druk van hippocampal capillaire-parenchymale arteriolen (HiCaPA) voorbereiding van de muis. A) vers geïsoleerd brein wordt gehalveerd in het sagittale vlak na de interhemiferische spleet en geplaatst met de mediale zijde naar boven gericht. (B) de thalamus, septum, en hypothalamus worden voorzichtig verwijderd om de Hippocampus onthullen. (C) de Hippocampus wordt zorgvuldig verwijderd. D) arteriolen met capillaire bomen zijn geïsoleerd van de hippocampus en één uiteinde van het arteriollaire segment wordt gecanuleerd met een micro pipet die is aangesloten op een druk systeem, en het andere uiteinde wordt afgesloten. Capillaire uiteinden worden verzegeld en tegen de afdekplaat gehouden met de punt van een glazen pipet. Inwendige diameter wordt bewaakt met een randdetectie systeem in een of meerdere gebieden van de Arteriole. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: focale stimulatie van capillairen met 1 μM NS309 heeft geen effect op de upstream arteriolaire diameter, in tegenstelling tot stimulatie met aCSF met 10 mM K+. A) representatieve registratie van de stroomopwaartse arteriollaire diameter die het effect van de badtoepassing van 1 μM NS309 gevolgd door opeenvolgende capillaire uiteinden stimulatie (20 s, 5 psi) met 1 μm NS309 en met acsf met 10 mm K+ bij afwezigheid of aanwezigheid van de Kir2 kanaal remmer ML133. Toepassing van 10 mM K+ op capillairen produceerde een snelle stroomopwaarts arteriollaire verwijding die werd geblokkeerd door 10 μM ML133. NS309 veroorzaakt geen verwijding. De afwezigheid van stroomopwaarts arteriollaire verwijding in reactie op capillaire stimulatie met NS309 illustreert dat drukuitgeworpen verbindingen de Arteriole niet bereiken. B) samenvattende gegevens met diameter veranderingen die worden veroorzaakt door 1 μM NS309 toegepast in het bad of op de capillaire uiteinden (n = 14; * * * *p < 0,0001, gepaarde t-toets). C) samenvatting van de door de arteriolaire diameter aangebrachte veranderingen met 10 mm K+ die rechtstreeks op de haarvaten worden aangebracht in hicapa preparaten van mannelijke (n = 6) of vrouwelijke (n = 8) muizen voor en na 10 μM ML133 werd in het bad aangebracht (* * *p < 0,0005, n.s. = niet-significante, ongepaarde t-toets) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De onder druk staande hicapa (hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole) voorbereiding beschreven in het huidige manuscript is een Verleng teken van onze gevestigde procedure om parenchymale arteriolen29te isoleren, onder druk te zetten en te bestuderen. We onlangs gemeld dat Kir 2.1 kanalen in hersen capillaire endotheliale cellen Sense toeneemt in [K+]o geassocieerd met neurale activering, en het genereren van een stijgende hyperpolariserende signaal dat stroomopwaarts arteriolen verdunt20. Het onthullen van deze eerder onverwachte rol voor de capillairen is gedeeltelijk mogelijk geweest door het ontwikkelen van de capa preparaat uit corticale microcirculatie20,21. Dit manuscript presenteert een soortgelijke experimentele benadering, maar van een diepere en meer beperkte structuur van de muis hersenen om een eenvoudige en reproduceerbare benadering te beschrijven om capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken tijdens neurovasculaire koppeling.
De microcirculatie van de hersenen is prachtig fragiel en bepaalde praktijken, met name het minimaliseren van het strekken en hanteren van de vaten, moeten worden gebruikt om het voortbestaan van de arteriolen en de capillairen te garanderen. De spontane ontwikkeling van de myogene klank is de eerste indicator van de levensvatbaarheid van een preparaat30. De endotheliale functie kan vervolgens worden beoordeeld door het toevoegen van de SK en IK kanalen ' agonist NS309 aan de badoplossing, die moet leiden tot een maximale verwijding. In het geval van het niet ontwikkelen van Toon of reactie op de bad toepassing van NS309, de voorbereiding moet worden vervangen door een andere. NS309 wordt ook gebruikt om de verspreiding van de focale capillaire stimulatie te testen. Omdat capillaire endotheliale cellen SK en ik kanalen niet20, lokale levering van NS309 op capillairen door druk uitwerpen moet geen effect hebben op de upstream tortuositeit diameter zoals weergegeven in Figuur 2, illustreren dat verbindingen niet per ongeluk de Arteriole stimuleren. Zodra deze stappen zijn gevalideerd, kan capillaire-naar-Arteriole signalering worden getest.
Hier onderzochten we elektrische signalering door stimulerende capillairen met aCSF met 10 mM K+. Echter, verschillende signalering modaliteiten kunnen worden verkend met behulp van de huidige aanpak door stimulerende capillairen met verschillende bekende vasoactieve agenten of neurotransmitters. Een ander voordeel van deze voorbereiding is de mogelijkheid om NVC te onderzoeken en uiteindelijk te vergelijken tussen verschillende dieren en tussen verschillende hersengebieden. Dit is vooral interessant omdat de hersenen is niet uniform doelwit van cerebrovasculaire pathologieën31,32. Een algemene beperking van de aanpak die hier wordt gepresenteerd, is dat door het isoleren van de microcirculatie, cruciale componenten van de neurovasculaire eenheid, zoals neuronen en astrocyten, verloren gaan. Andere preparaten, zoals het craniale venster voor in vivo CBF-beeldvorming, behouden de structuur van de intacte neurovasculaire eenheid en zijn geschikter om NVC te bestuderen in een intact systeem. Echter, in de craniale raam voorbereiding, parenchymale arteriolen zijn moeilijk te beeld zonder specifieke apparatuur, zoals een multiphoton Microscoop, en diepere gebieden, zoals de hippocampus, blijven moeilijk te beeld. In dit verband, de aanpak ontwikkeld in het Filosa laboratorium met behulp van luminal flow voor het opwekken van myogene Toon in hersen segmenten vertegenwoordigt een elegante verbinding tussen brain slice en in vivo benaderingen33. Echter, het omringende zenuwweefsel kan beperken de penetratie van een drug topisch toegepast, het verhogen van haar off-target potentieel en het maken van interpretaties moeilijk, omdat verschillende celtypen worden blootgesteld aan de drugs. We ontwikkelden in de eerste plaats onze ex vivo -aanpak om deze potentiële problemen aan te pakken. Concluderend, meerdere benaderingen moeten worden gebruikt in combinatie om NVC volledig te bestuderen.
Samenvattend, dit verslag beschrijft een ex vivo intacte bereiding van onder druk staande hippocampal arteriolen en haarvaten waardoor de effecten van farmacologische en biologische agentia kunnen worden getest op functionele parameters op discrete posities langs het capillaire-Arteriole continuüm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Jules Morin bedanken voor de inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door Awards van de CADASIL samen hebben we hoop non-profit organisatie, het centrum voor de gezondheid van vrouwen en onderzoek, en de NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S.
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
