Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Van subtiele gedragsveranderingen tot laattijdige dementie ontwikkelt vasculaire cognitieve stoornissen zich meestal na cerebrale ischemie. Beroerte en hartstilstand zijn opmerkelijk seksueel dimorfe ziekten, en beide induceren cerebrale ischemie. Echter, vooruitgang in het begrijpen van de vasculaire cognitieve stoornissen, en vervolgens het ontwikkelen van seks-specifieke behandelingen, is deels beperkt door uitdagingen bij het onderzoeken van de hersenen microcirculatie van Muismodellen in functionele studies. Hier presenteren we een benadering om de capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken in een ex vivo hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole (hicapa) voorbereiding van muizenhersenen. We beschrijven hoe de microcirculatie te isoleren, te cannuleren en onder druk te zetten om de arteriolaire diameter te meten als reactie op capillaire stimulatie. We laten zien welke geschikte functionele controles kunnen worden gebruikt om de integriteit van de voorbereiding van de HiCaPA te valideren en typische resultaten weer te geven, waaronder het testen van kalium als een neurovasculaire koppelings agent en het effect van de recentelijk gekarakteriseerde remmer van de Kir2 actieve gelijkrichter kaliumkanaal familie, ML133. Verder vergelijken we de reacties in preparaten die zijn verkregen van mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel deze gegevens functioneel onderzoek weerspiegelen, kan onze aanpak ook worden gebruikt in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie studies.
Inleiding
De Piale circulatie op het oppervlak van de hersenen is het voorwerp geweest van veel studie, deels vanwege de experimentele toegankelijkheid. Echter, de topologie van de cerebrale vasculatuur creëert verschillende regio's. In tegenstelling tot het robuuste pial-netwerk dat rijk is aan anastomosen met aanzienlijke capaciteit voor het omleiden van de bloedstroom, presenteren de intracerebrale parenchymale arteriolen (PAs) beperkte onderpand toevoer, elk met een discrete hoeveelheid zenuwweefsel1,2. Dit creëert een knelpunt effect op de bloedstroom die, in combinatie met unieke fysiologische kenmerken
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical campus en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. oplossingen
- Gebruik MOPS-gebufferde zoutoplossing voor de dissectie en om monsters bij 4 °C te houden vóór het gebruik ervan. Gas de oplossing niet. Bereid MOPS gebufferde zoutoplossing met volgende samenstelling: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2po4, 1 mm mgso4, 2,5 mm CACL2,5mm glucose, 3 mm Mops, 0,02 mm EDTA, 2 mm Pyruvate, 10 mg/ml boviene serumal....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Endotheliale Small-conductance (SK) en intermediaire-conductance (IK) CA2 +-gevoelige K+ kanalen oefenen een dilatorische invloed uit op de diameter van de PAs. Bad toepassing van 1 μM NS309, een synthetische IK en SK kanaal agonist, veroorzaakt in de buurt van maximale verwijding (Figuur 2a, B). Echter, capillaire endotheliale cellen missen IK en SK kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op NS3092.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De onder druk staande hicapa (hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole) voorbereiding beschreven in het huidige manuscript is een Verleng teken van onze gevestigde procedure om parenchymale arteriolen29te isoleren, onder druk te zetten en te bestuderen. We onlangs gemeld dat Kir 2.1 kanalen in hersen capillaire endotheliale cellen Sense toeneemt in [K+]o geassocieerd met neurale activering, en het genereren van een stijgende hyperpolariserende signaal dat stroomopwaarts .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Jules Morin bedanken voor de inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door Awards van de CADASIL samen hebben we hoop non-profit organisatie, het centrum voor de gezondheid van vrouwen en onderzoek, en de NHLBI R01HL136636 (FD).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,22µm Spuitfilters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Zwart | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatische temperatuurregelaar | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicaatglas O.D.: 1,2 mm, I.D.: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Rund serum albumine | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydraat | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissectie Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pomp met Drive en MS/CA 4-12 pomp-kop | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fijne schaar - scherp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Waterverwarming | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™ weefseltang | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesiumsulfaat heptahydraat | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellulaire Micro-injectie Dispenser Systemen, 2-kanaals | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Druk Servo Controller met Peristaltische Pomp | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fijne Pincet | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Chirurgische schaar - Scherp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Verticale Micropipet Puller | Narishige | PP-83 |
Referenties
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
