Summary

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Abstract

De alterações comportamentais sutis à demência em estágio avançado, o comprometimento cognitivo vascular geralmente se desenvolve após a isquemia cerebral. Acidente vascular cerebral e parada cardíaca são doenças extremamente sexualmente dimórficas, e ambos induzem isquemia cerebral. No entanto, o progresso na compreensão do comprometimento cognitivo vascular e, em seguida, o desenvolvimento de tratamentos específicos para o sexo, tem sido parcialmente limitado por desafios na investigação da microcirculação cerebral de modelos de camundongos em estudos funcionais. Aqui, apresentamos uma abordagem para examinar a sinalização capilar-a-arteriole em uma preparação de arteriole capilar-parenchymal hipvivo (HiCaPA) do cérebro do rato. Descrevemos como isolar, cannuar e pressurizar a microcirculação para medir o diâmetro arteriolar em resposta à estimulação capilar. Mostramos quais controles funcionais apropriados podem ser usados para validar a integridade de preparação hicapa e exibir resultados típicos, incluindo testar o potássio como um agente de acoplamento neurovascular e o efeito do inibidor recentemente caracterizado da família do canal de potássio retificada kir2, ML133. Além disso, comparamos as respostas nos preparativos obtidos de camundongos machos e fêmeas. Embora esses dados reflitam investigações funcionais, nossa abordagem também pode ser usada em biologia molecular, imunoquímica e estudos de eletrofisiologia.

Introduction

A circulação pial na superfície do cérebro tem sido objeto de muito estudo, em parte por causa de sua acessibilidade experimental. No entanto, a topologia da vasculatura cerebral cria regiões distintas. Em contraste com a robusta rede pial rica em anastomoisés com capacidade substancial para redirecionar o fluxo sanguíneo, as artérias parenchymal intracerebrais (PAs) apresentam fornecimento colateral limitado, cada um deles perfusando um volume discreto de tecido nervoso1,2. Isso cria um efeito de gargalo sobre o fluxo sanguíneo que, combinado com características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, faz das artérias intracerebrais um local crucial para o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) regulamento9,10. Apesar dos desafios técnicos inerentes ao isolamento e à cannulação das As, a última década tem visto um aumento do interesse em estudos funcionais ex vivo usando embarcações pressurizadas11,12,14,15,16, 17. Uma das razões para esse aumento do interesse é o considerável esforço de pesquisa realizado sobre o acoplamento neurovascular (NVC), o mecanismo que sustenta a hiperemia funcional cerebral18.

Regionalmente, a CBF pode aumentar rapidamente após a ativação neural local19. Os mecanismos celulares e as propriedades de sinalização que controlam o NVC são incompletamente compreendidos. No entanto, identificamos um papel previamente inesperado para os capilares cerebrais durante o NVC na detecção de atividade neural e traduzi-lo em um sinal elétrico hiperpolarizante para dilatar artérias a montante20,21,22. Os potenciais de ação23,24 e a abertura dos canais K+ (BK) ativados por grande conduta Ca2+(BK) nos pés arrumados ascíticos25,26 aumentam a concentração interstitial de íons de potássio [K+]o, o que resulta na ativação de canais retrógrados fortes K+ (Kir) no endotelium vascular dos capilares. Este canal é ativado por Kexterno + mas também pela própria hiperpolarização. Espalhando-se através de junções gap, a corrente hiperpolarizadora, em seguida, regenera em células endotélias capilares adjacentes até a arteriole, onde causa relaxamento miócito e aumento cbf20,21. O estudo deste mecanismo nos levou a desenvolver uma preparação pressurizada de arteriole capilar-parenchymal (CaPA) para medir o diâmetro arteriolar durante a estimulação capilar com agentes vasoativos. A preparação do CaPA é composta por um segmento de arteriole intracerebral cannulado com uma ramificação capilar intacta a jusante. As extremidades capilares são comprimidas contra o fundo de vidro de câmara por uma micropipette, o que oclude e estabiliza toda a formação vascular20,21.

Anteriormente fizemos inovações instrumentais por imagem capa preparações do córtex do rato20,21 e arterioles da amígdala de rato13 e hipocampo16,17. Como a vasculatura hipocampal recebe mais atenção devido à sua suscetibilidade a condições patológicas, aqui fornecemos um método passo a passo para a preparação da CaPA do hipocampo do camundongo (HiCaPA) que não só pode ser usado em estudos funcionais de NVC, mas também em biologia molecular, imunoquímica e eletrofisiologia.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus e foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde. 1. Soluções Use solha-tampão de MOPS para a dissecação e para manter amostras em 4 °C antes de sua utilização. Não gaseie a solução. Prepare MOPS soro fisiológico amortecida com seguinte composição: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO…

Representative Results

A pequena condução endotelial (SK) e a condução intermediária (IK) Ca2+sensíveis aos canais K+ exercem uma influência dilatória sobre o diâmetro das PAs. Aplicação de banho de 1 μM NS309, um agonista sintético do canal IK e SK, causou quase dilatação máxima (Figura 2A,B). No entanto, as células endotélias capilares não possuem canais IK e SK e não hiperpolarizam em resposta ao NS3092…

Discussion

A preparação pressurizada hicapa (hipocampal capilar-parenchymal arteriole) descrita no presente manuscrito é uma extensão do nosso procedimento bem estabelecido para isolar, pressurizar e estudar as artérias parenchymal29. Recentemente, relatou que os canais Kir2.1 em células endotélias capilares cerebrais sentido aumenta em [K+]o associado com a ativação neural, e gerar um sinal hiperpolarizante ascendente que dilata artérias rioacima 20. R…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Jules Morin por comentários perspicazes sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi financiada por prêmios da organização sem fins lucrativos CADASIL Together We Have Hope, do Center for Women’s Health and Research e do NHLBI R01HL136636 (FD).

Materials

0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83

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Cite This Article
Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).

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