El presente manuscrito detalla cómo aislar las arterias y capilares del hipocampo del cerebro del ratón y cómo presurizarlas para miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.
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Artículo de método
Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional
En este artículo
Resumen
Resumen
Desde alteraciones conductuales sutiles hasta demencia en etapa sorpresa, el deterioro cognitivo vascular generalmente se desarrolla después de la isquemia cerebral. El accidente cerebrovascular y el paro cardíaco son enfermedades notablemente dimórficas sexualmente, y ambas inducen isquemia cerebral. Sin embargo, el progreso en la comprensión del deterioro cognitivo vascular, y luego el desarrollo de tratamientos específicos del sexo, se ha visto en parte limitado por los desafíos en la investigación de la microcirculación cerebral de los modelos de ratón en estudios funcionales. Aquí, presentamos un enfoque para examinar la señalización capilar-a-arteriola en una preparación ex vivo del arteriolo capilar-parenquimal del hipocampo (HiCaPA) del cerebro del ratón. Describimos cómo aislar, canalizar y presurizar la microcirculación para medir el diámetro arteriolar en respuesta a la estimulación capilar. Mostramos qué controles funcionales apropiados se pueden utilizar para validar la integridad de la preparación hiCaPA y mostrar resultados típicos, incluyendo la prueba de potasio como un agente de acoplamiento neurovascular y el efecto del inhibidor recientemente caracterizado de la familia de canales de potasio de retificación interna Kir2, ML133. Además, comparamos las respuestas en los preparados obtenidos de ratones machos y hembras. Si bien estos datos reflejan investigaciones funcionales, nuestro enfoque también se puede utilizar en estudios de biología molecular, inmunoquímica y electrofisiología.
Introducción
La circulación pial en la superficie del cerebro ha sido objeto de mucho estudio, en parte debido a su accesibilidad experimental. Sin embargo, la topología de la vasculatura cerebral crea regiones distintas. A diferencia de la robusta red pial rica en anastomosas con capacidad sustancial para redirigir el flujo sanguíneo, las arteriolas parénquimas intracerebrales (PA) presentan un suministro colateral limitado, cada uno de ellos perdiendo un volumen discreto de tejido nervioso1,2. Esto crea un efecto cuello de botella en el flujo sanguíneo que, combinado con características fisiológicas únicas
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Colorado, Anschutz Medical Campus y se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Soluciones
- Utilice la solución salina con búfer MOPS para la disección y para mantener las muestras a 4 oC antes de su utilización. No gasgaste la solución. Preparar solución salina tamponada MOPS con la siguiente composición: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM de glucosa, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM de piruva....
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Resultados
Los canales Endoteliales de pequeña conductancia (SK) e intermedio de conductividad (IK) Ca2+-sensibles K+ ejercen una influencia dilatoria sobre el diámetro de los PA. Aplicación de baño de 1 M NS309, un agonista sintético del canal IK y SK, causado cerca de la dilatación máxima(Figura 2A, B). Sin embargo, las células endoteliales capilares carecen de canales IK y SK y no hiperpolarizan en respuesta a NS309
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Discusión
La preparación presurizada HiCaPA (arteriola capilar-parénquimal del hipocampo) descrita en el presente manuscrito es una extensión de nuestro procedimiento bien establecido para aislar, presurizar y estudiar arteriolas parénquimas29. Recientemente informamos que los canales Kir2.1 en las células endoteliales capilares cerebrales detectan aumentos en [K+]o asociados con la activación neuronal, y generan una señal de hiperpolarización ascendente que dilata los arteriolas aguas.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Jules Morin por comentarios perspicaces sobre el manuscrito. Esta investigación fue financiada por premios de la organización sin fines de lucro CADASIL Together We Have Hope, el Center for Women's Health and Research y el NHLBI R01HL136636 (FD).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.22 y micro; m Filtros de jeringa | CELLTREAT Productos Científicos | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Negro | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Controlador de temperatura automático | Instruments | TC-324B | |
| Vidrio de borosilicato Diámetro exterior: 1,2 mm, diámetro interior: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihidrato | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Osciloscopio de disección | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — bomba completa con accionamiento y cabezal MS/CA 4-12 | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Tijeras finas - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Calentador de agua en línea | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex&comercio; Pinza de tejido | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhidro | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulador | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 clorhidrato | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Sistemas de Dispensación de Microinyección Intracelular, 2 canales | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Servocontrolador de Presión con Bomba Peristáltica Living Systems | Instrumentación | PS-200 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Pinzas | SuperfinasFine Science Tools | 11252-20 | |
| Tijeras quirúrgicas - afiladas-romas | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Extractor de micropipetas vertical | Narishige | PP-83 |
Referencias
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al.
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Reimpresiones y permisos
