Summary
本手稿详细介绍了如何从小鼠大脑中分离海马动脉和毛细血管,以及如何为压力的焦疗、免疫荧光、生物化学和分子研究加压它们。
Abstract
从微妙的行为改变到晚期痴呆症,血管认知障碍通常在脑缺血后发展。中风和心脏骤停是显性畸形疾病,都诱发脑缺血。然而,在理解血管认知障碍,然后开发性别特异性治疗方面的进展,在功能研究中受到研究小鼠模型大脑微循环的挑战部分限制。在这里,我们提出一种方法,以检查毛细管到动脉信号在从小鼠大脑前体海马毛细管毛细管动脉(HiCaPA)制备。我们描述了如何分离、增射和加压微循环,以测量动脉直径以响应毛细管刺激。我们展示了哪些适当的功能控制可用于验证HiCaPA制备的完整性,并显示典型结果,包括测试钾作为神经血管耦合剂和最近具有特征的抑制剂Kir2内矫正钾通道系列,ML133的效果。此外,我们比较了从雄性小鼠和雌性小鼠获得制剂的反应。虽然这些数据反映了功能调查,但我们的方法也可用于分子生物学、免疫化学和电生理学研究。
Introduction
大脑表面的皮环流一直是许多研究的对象,部分原因是它的实验可及性。然而,脑血管的拓扑结构创造了不同的区域。与富含麻醉剂的强健的皮球网络相比,脑内腹腔动脉(PAs)存在有限的辅助供应,每个细胞都渗透神经组织1、2的离散体积。这造成了对血流的瓶颈效应,结合独特的生理特征3,4,5,6,7,8,使脑动脉成为脑血流(CBF)调节9,10的关键部位。尽管PA的隔离和分离技术挑战固有的,但在过去十年中,使用加压容器11、12、13、14、15、16、17的体外功能研究的兴趣日益浓厚。引起这种兴趣增加的原因之一是,对神经血管耦合(NVC)进行了大量研究,这种机制支撑着大脑功能性高血症18。
区域方面,CBF在局部神经激活19后可迅速增加。控制NVC的蜂窝机制和信令特性尚未完全了解。然而,我们在NVC期间发现了一个以前未预料到的脑毛细血管作用,在感知神经活动并将其转化为超极化电信信号以稀释上游动脉20、21、22。作用电位23、24和大导导 Ca2+激活 K+ (BK) 通道在星形端脚25、26上增加间隙钾电浓度 [K]o,导致在毛细血管内膜中激活强的内整整流器 K+ (Kir) 通道。此通道由外部 K+激活,但也由超极化本身激活。通过间隙结扩散,超极化电流然后在相邻的毛细管内皮细胞中再生,并持续到动脉,导致肌细胞放松和CBF增加20,21。对该机制的研究导致我们开发出一种加压毛细管-皮伦皮毛毛(CaPA)制剂,以测量血管刺激期间用血管活性剂的动脉直径。CaPA 制剂由可口的脑内动脉段组成,具有完好的下游毛细管冲压。毛细管末端被微移液器压缩在室玻璃底部,从而遮挡并稳定整个血管形成20,21。
我们之前通过成像CaPA制剂从小鼠皮层20,21和动脉从大鼠杏仁核13和海马16,17进行仪器创新。由于海马血管因其对病理条件的易感性而受到更多的关注,因此,我们在此提供了一种从小鼠海马场(HiCaPA)制备CaPA的分步方法,该方法不仅可用于功能性NVC研究,还可用于分子生物学、免疫化学和电生理学。
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Protocol
所有实验均获得科罗拉多大学安舒茨医学院机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准,并根据国家卫生研究院的指南进行。
1. 解决方案
- 使用MOPS缓冲盐水进行解剖,并在样品使用前保持4°C。不要为溶液加气。制备具有以下成分的 MOPS 缓冲盐水: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2,5 mM 葡萄糖, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM 丙酸酯, 10 mg/mL 牛血清白蛋白, pH 7.3 在 4 °C.
- 使用人工脑脊液(aCSF)作为沐浴溶液和移液器溶液。气体ACSF和Ca2+无ACSF与5%CO2,20%O2和N2平衡。用以下组合物制备溶液:125 mM NaCl,3 mM KCl,26 mM NaHCO 3,1.25 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2,4 mM 葡萄糖, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (与 5% CO2,20% O2和 N2平衡) 。
- 在名义上的 Ca2+-无 ACSF (0 mM [Ca2] o,5 mM EGTA) 中获得最大扩张。
2. 器官室准备
- 将硼硅酸盐玻璃毛细管(外径 = 1.2 mm;内径 = 0.69 mm;长度 = 10 厘米)插入玻璃拉拔器中。拉动毛细管,在一端做一个细长的尖端。
- 在造型室的一侧,添加一个可连接到微型蠕动泵的导管,以对容器进行发光加压。在解剖显微镜下,打破导管的尖端,使其足够小,足以容纳感兴趣的容器,但足够大,使溶液流过尖端。确保尖端直径约为 10-15 μm。
- 使用带有0.22 μm过滤器的注射器将管状物与含氧aCSF填充。确保管内没有气泡或碎屑。
- 在造型室的另一侧再添加两个套管。不要打破他们的提示。
3. 海马解剖和隔离
- 对老鼠实施安乐死并斩首。对于这个实验,使用8周大的C57BL6/J小鼠来比较男性和女性之间的差异。用五巴比妥注射小鼠,用手术剪刀斩首。
- 使用小解剖剪刀,沿着头部顶部的中线切割皮肤。将皮肤移到两侧。
- 从头骨的牛头侧开始,沿着中线切割头骨,直到达到嗅觉球茎。取出部分头骨,直到大脑暴露。
- 慢慢去除大脑,从靠近老鼠的鼻子开始。用小解剖剪刀切开结构,将大脑与嗅球、颅神经和脊髓分开。
- 将大脑放入解剖板中,并提供足够的 MOPS 溶液,使其完全浸没。使用解剖显微镜,将大脑置于解剖板的中心,腹腔侧朝下。
- 使用剃刀刀片,沿着纵向裂缝将大脑切成两半。握住刀片,使锋利边缘与解剖板底部平行。一次按刀片通过大脑。将一个半球移到板的一侧。
- 单独或并行地为每个半球执行以下步骤。
- 将一个半球放在板块的中心,使中线朝下。然后使用剃刀刀片沿横向裂缝切割,以去除小脑和脑干。将刀片直接穿过组织。
- 旋转半球,使中侧朝上(图1A)。用一把铲子把大脑抱在原位。使用第二个铲子,将脚尖插入血库的正下方,并在下方铲取,以去除覆盖海马的丘脑、隔膜和下丘脑(图1B)。
- 确保海马现在作为大脑后侧附近的弯曲结构可见。使用一个铲子将大脑保持原位,使用第二个铲子将海马从脑中挖出(图1C)。
- 将海马转移到一个新的解剖板填充约半与MOPS溶液。丢弃大脑的其余部分。
4. 希波坎帕动脉隔离
- 完成每个海马的以下步骤。
- 使用部分两端的小针固定其中一个海马。海马动脉朝上。
- 使用非常锋利的钳子,轻轻伸展海马的小部分。这将放松动脉周围的组织,使其更容易解剖它们。
- 通过背海马组织搜索,识别外部横动脉(图1C)16,27。
- 轻轻抓住外部横向动脉,慢慢将其从组织中拉出,以收集注入海马区CA3区域的动脉和毛细血管。
- 一旦没有更多的血管从组织中取出,丢弃海马。在不使用时,将容器放在冰板上。
5. 希波坎帕毛细管-眼皮动脉管
- 找到一条用毛细血管结束的分支的动脉。转移到器官室完全扩张时,确保动脉约为15-30 μm(图1D)。
- 小心地安装血管,将导管尖推入目标区域下方的动脉壁。小心地将容器滑到管上,直到有足够的组织将领带系上。
- 用12-0尼龙缝合线打一个松结,使其适合血管和管状。使用半结来固定领带。然后拉两端,收紧结,并将动脉固定到管上。用钳子轻轻拉取领带下方的任何外在容器分支。
- 再打领带,固定在动脉的另一端,将其密封。
- 用连接的容器放下导管,直到与造型室底部的盖玻片平平。小心不要降低管塞太多,否则它会断裂。
- 使用造型室另一侧的一根圆管,将其放下,使其点在动脉末端的领带上固定下来。
- 使用第三根管条将毛细管分支固定到盖玻片上。将尖端靠近分支末端,同时使毛细血管末端露出(不在管件下方)。
6. 压力的断层
- 使用记录软件将腔室从解剖范围移到显微镜上。
- 将流入和流出管连接到腔室进行灌注。以 4 mL/min 的流速使用加热的 ACSF (37 °C) 开始灌注。
- 将加压管连接到与压力传感器配对的蠕动泵,并将内部压力降至 20 mm Hg。
- 启动录制软件。调整显微镜和成像设置,以尽可能清晰地显示图像。针对检测软件优化设置后开始录制。
- 使用边缘检测软件记录动脉直径时,将容器的压力增加到 40 mm Hg。
- 允许+15-20分钟用CSF将MOPS溶液从腔室中洗出,让HiCaPA制备平衡并发展出致幻音。
- 要测试容器的可行性,请对浴灌注应用 1 μM NS309 溶液(参见图 2A、B和代表性结果部分)。动脉部分必须分片,如前所述3、14、20所述,表现出约30-40%的致幻音。
7. 毛细管末端的焦距刺激
- 一旦确定动脉的基线音调并评估内皮功能,测试毛细管刺激的反应。
- 使用玻璃拉拔器,制作圆锥,使一端有一个细点。切断一个管状的尖端,以便测试的药物可以在5 psi时顺利流过尖端。
- 用感兴趣的药物溶液填充导管,并将其添加到附着在显微镜上的3轴微操作器中。将管从压力喷射系统连接到管。
- 慢慢将管状液放入毛细血管附近的浴缸中,小心不要撞到容器或腔室中硬件的任何部位。在不接触毛细血管末端的情况下操纵管的尖端。将导管的尖端放在盖玻片上,以防止在导管泄漏时刺激容器。
- 当准备刺激毛细血管时,将导管降至盖玻片,然后就在毛细血管旁边。用所需的喷射时间(此处为 20 s)激活压力喷射系统。一旦刺激完成,稍微抬起导管,以避免进一步的刺激。
- 必要时重复刺激。改变压力喷射系统管,以测试不同的药物化合物。
- 要确认只有毛细血管被刺激,请用 1 μM NS309 溶液填充管状,然后重复上述步骤。
注:毛细管内皮细胞不表达由NS309激活的K+通道,因此动脉不能对刺激做出反应。如果动脉胶的分部,则需要重新定位管状,或者孔的直径需要更小(参见图 2A、B和代表性结果部分)。
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Representative Results
内皮小电导 (SK) 和中间导电 (IK) Ca2+- 敏感 K+通道对 PA 的直径产生拖延影响。浴液应用1μM NS309,一种合成IK和SK通道激动剂,引起接近最大扩张(图2A,B)。然而,毛细管内皮细胞缺乏IK和SK通道,没有超极化响应NS30920。因此,通过焦压喷射(20 s,5 psi)以1μM NS309刺激毛细管结束不会导致上游动脉扩张(图2A,B)。该结果表明,NS309没有达到HiCaPA制剂中的动脉,可作为控制,以评估通过压力喷射应用于毛细血管的化合物的空间限制。
这种制备从根本上设计用于测量从毛细血管到PA的内向外电信号。使用HiCaPA制剂,我们在毛细管末端应用了含有10 mMK+的CSF,并测量了上游动脉扩张(图2A,C),正如我们以前在皮质血管20的CaPA制剂中所做的那样。然后,我们首次使用HiCaPA制剂对雌性小鼠的毛细管到动脉电信信号进行了研究。10 mM K+由毛细管刺激引起的动脉扩张与雄性小鼠和雌性小鼠的制剂没有区别(图2A,C)。
最后,这种方法的另一个基本好处是,在毛细血管刺激之前,可以在沐浴中应用药理工具。在这里,我们测试了ML133的效果,一种最近开发的Kir2抑制剂28。在沐浴灌注中加入10μM ML133,几乎废除了毛细管引起的动脉扩张,以响应雄鼠和雌性小鼠的HiCaPA制剂中的10 mMK(图2A,C)。最后一个结果表明,Kir2.1通道在女性脑血管中介导电信信号,正如我们之前在男性大脑皮质微循环中描述的那样。
图1:小鼠海马毛细血管-皮毛毛蛋白(HiCaPA)制备的分离和加压方法。(A) 新鲜分离的大脑在半球裂隙后,在下垂平面上切成两半,并置于中侧朝上。(B) 丘脑、隔膜和下丘脑被轻轻去除,以揭示海马。(C) 海马被小心地去除.(D) 带毛细管树的动脉与海马分离,动脉部分的一端与连接到加压系统的微管器分离,另一端被遮挡。毛细管端用玻璃移液器的尖端密封并针对盖玻片进行维护。内径在动脉的一个或多个区域使用边缘检测系统进行监控。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:1μM NS309毛细血管的焦距刺激对上游动脉直径没有影响,与含有10 mM K=的CSF刺激不同。(A) 上游动脉直径的代表性记录,显示浴液应用效果 1 μM NS309,然后是连续毛细血管末端刺激 (20 s, 5 psi) 与 1 μM NS309 和 aCSF 包含 10 mM K=在没有或存在 Kir2 通道抑制剂 ML133 时。在毛细血管上应用 10 mM K=产生了快速的上游动脉扩张,被 10 μM ML133 阻断。NS309 没有导致扩张。NS309对毛细管刺激缺乏上游动脉扩张,这表明压力喷射化合物不会到达动脉。(B) 显示在浴缸或毛细管端(n = 14;=p < 0.0001,成对 t 测试)上应用的 1 μM NS309 引起的直径变化的汇总数据。(C) 显示由 10 mM K引起的动脉径变化的汇总数据 , 直接应用于 HiCaPA 制剂中的毛细血管,在 10 μM ML133 之前和之后,雄(n = 6) 或雌性 (n = 8) 小鼠在浴缸中应用(=p <0.0005, n.s. = 不显著、未配对的 t-测试)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本手稿中描述的加压 HiCaPA(海马毛细血管-皮毛动脉)制备是我们隔离、加压和研究眼皮动脉29的既定程序的延伸。我们最近报告说,脑毛细管内皮细胞中的Kir2.1通道感觉增加[K]o与神经激活相关,并产生一个上升的超极化信号,以向上动脉20。通过从皮质微循环20、21开发CaPA制剂,部分地揭示了毛细血管的这种以前未预料到的作用。本手稿提出了类似的实验方法,但从小鼠大脑的更深和更受限的结构来描述一种简单而可重复的方法,以研究神经血管耦合过程中的毛细管到动脉信号。
大脑微循环非常脆弱,某些做法,特别是尽量减少血管的拉伸和处理,必须用来确保动脉和毛细血管的生存。造血性语气的自发发展是制剂生存能力的第一个指标。然后,通过将SK和IK通道的激动剂NS309添加到沐浴溶液中来评估内皮功能,这应该会导致接近最大扩张。如果无法对 NS309 的沐浴应用产生音调或响应,应用另一种制备代替。NS309也用于测试焦毛细管刺激的传播。由于毛细管内皮细胞缺乏SK和IK通道20,因此通过压力喷射将NS309局部输送到毛细血管上,对上游动脉直径没有影响,如图2所示,说明化合物不会意外刺激动脉。一旦验证这些步骤,即可测试毛细管到动脉信号。
在这里,我们检查了电信号通过刺激毛细血管与含有10 mM K+的CSF。然而,使用目前的方法,通过刺激具有不同已知血管活性剂或神经递质的毛细血管,可以探索不同的信号模式。这种制备的另一个好处是可以调查并最终比较不同动物之间和不同大脑区域之间的NVC。这是特别有趣的,因为大脑不是统一的目标脑血管病31,32。这里介绍的方法的一个一般限制是,通过隔离微循环,神经血管单元的关键成分,如神经元和星形细胞,丢失。其他制剂,如体内CBF成像的颅窗,保持完整的神经血管单元的结构,更适合在完整系统中研究NVC。然而,在颅窗准备中,如果没有特定的设备(如多光子显微镜),皮肤动脉很难成像,而深层区域(如海马区)仍然难以成像。在这方面,在菲洛萨实验室开发的方法,利用光流诱导脑切片的真菌性音调,代表了脑切片和体内接近33之间的优雅联系。然而,周围的神经组织可以限制药物局部应用的渗透,增加其偏离目标的潜力,使解释变得困难,因为几种细胞类型都暴露在药物中。我们主要开发我们的外生方法来解决这些潜在问题。总之,应结合使用多种方法来充分研究NVC。
总之,本报告描述了加压海马动脉和毛细血管的体外完整制备,允许药理学和生物制剂在毛细管动脉连续体的离散位置对功能参数进行测试。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者们感谢朱尔斯·莫林对手稿的有见地的评论。这项研究由CADASIL共同有希望的非营利组织、妇女健康与研究中心和NHLBI R01HL136636(FD)的奖项资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
NS309 | Tocris | 3895 | |
Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
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