离体加压海马毛细血管-实质小动脉制备用于功能研究

摘要

本文详细介绍了如何从小鼠脑组织中分离海马动脉小动脉和毛细血管，以及如何对其进行加压，以用于压力肌图、免疫荧光、生物化学和分子生物学研究。

摘要

从轻微的行为改变到晚期痴呆，血管性认知障碍通常在脑缺血后发生。中风和心脏骤停是具有显著性别差异的疾病，二者均可引发脑缺血。然而，由于在功能研究中难以检测小鼠模型的脑微循环，目前对血管性认知障碍的理解以及针对性别特异性治疗的开发进展受到一定限制。本文介绍了一种用于研究小鼠脑组织海马区毛细血管-实质小动脉（HiCaPA）离体（ex vivo）制备中毛细血管至小动脉信号传导的方法。我们描述了如何分离、套管插管并加压微循环系统，以测量小动脉在毛细血管刺激下的直径变化。我们展示了可用于验证HiCaPA制备完整性的适当功能对照，并呈现典型实验结果，包括验证钾离子作为神经血管耦合介质的作用，以及近期鉴定的Kir2内向整流钾通道家族抑制剂ML133的效果。此外，我们比较了来自雄性和雌性小鼠制备样本的反应差异。尽管这些数据反映的是功能学研究结果，但本方法也可应用于分子生物学、免疫组织化学和电生理学研究。

引言

大脑表面的软脑膜循环一直是大量研究的对象，部分原因是其易于进行实验操作。然而，脑血管系统的拓扑结构形成了不同的区域。与具有丰富吻合支、可有效重定向血流的强健软脑膜网络相比，脑实质内穿支小动脉（PAs）的侧支供血极为有限，每条小动脉仅灌注特定体积的神经组织^1,2。这导致血流出现瓶颈效应，再结合其独特的生理特征^3,4,5,6,7,8，使得脑实质内小动脉成为脑血流（CBF）调节的关键部位^9,10。尽管分离和插管PAs存在固有的技术挑战，但在过去十年中，利用加压血管进行离体（ex vivo）功能研究的兴趣显著增加^11,12,1....

方案

所有实验均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院的指南进行。

1. 溶液

1. 使用MOPS缓冲盐溶液进行解剖，并在使用前将样品置于4 °C保存。切勿对溶液通气。配制如下成分的MOPS缓冲盐溶液：135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM KH₂PO₄，1 mM MgSO₄₄，2.5 mM CaCl₂，5 mM 葡萄糖，3 mM MOPS，0.02 mM EDTA，2 mM 丙酮酸，10 mg/mL 牛血清白蛋白，pH 7.3（4 °C 条件下）。
2. 使用人工脑脊液（aCSF）作为灌流液和移液管填充液。对 aCSF 和 Ca²⁺含5% CO的无钙人工脑脊液₂，20% O₂₂，以及 N₂ 平衡。配制如下成分的溶液：125 mM NaCl，3 mM KCl，26 mM NaHCO₃₃，1.25 mM NaH₂PO₄，1 mM MgCl₂，4 mM 葡萄糖，2 mM CaCl₂，pH 7.3（用5% CO₂供气）₂，20% O₂₂，以及 N₂

结果

内皮细胞的小电导（SK）和中等电导（IK）Ca²⁺敏感性K⁺通道对肺动脉（PA）的管径具有舒张作用。灌流应用1 µM NS309（一种合成的IK和SK通道激动剂）可引起接近最大幅度的舒张（图2A,B）。然而，毛细血管内皮细胞缺乏IK和SK通道，对NS309无超极化反应²⁰。因此，通过局部压力喷射（20 s，5 psi）将1 µM NS309施加于毛细血管末端时，并未引起上游微动脉的舒张（图2A,B）。该结果表明，在HiCaPA制备中NS309并未扩散至微动脉，因此可将此作为对照，用于评估通过压力喷射将化合物施加于毛细血管时的空间局限性。

该制备方法最初旨在测量从毛细血管向小动脉.......

讨论

本文所述的加压HiCaPA（海马区毛细血管-实质小动脉，hippocampal capillary-parenchymal arteriole）制备方法，是我们已建立的分离、加压并研究实质小动脉方法的进一步拓展²⁹。我们近期报道了脑毛细血管内皮细胞中的Kir2.1通道可感知神经激活相关的细胞外[K⁺]_o升高，并产生向上传导的超极化信号，从而引起上游小动脉舒张²⁰。揭示毛细血管这一此前未被预料的功能，部分得益于从大脑皮层微循环发展而来的CaPA制备技术^20,21。本论文介绍了一种类似实验方法，但取自小鼠大脑更深且更为局限的结构，旨在描述一种简单且可重复的研究神经血管耦合过程中毛细血管至小动脉信号传导的方法。

脑微循环极为脆弱，必须采用特定操作方法，尤其是尽量减少对血管的牵拉和机械接触，以确保微动脉和毛细血管的存活。自发性肌源性张力.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22µm 注射器滤器	CELLTREAT Scientific Products	229751
12-0 尼龙（12 cm）黑色	Microsurgery Instruments, Inc	S12-0 NYLON
自动温度控制器	Warner Instruments	TC-324B
硼硅酸盐玻璃外径：1.2 mm，内径：0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
CaCl2 二水合物	Sigma-Aldrich	C3881
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
解剖显微镜	Olympus	SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — 配驱动装置和 MS/CA 4-12 泵头的完整泵系统	Ismatec	ISM 1090
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
精细剪刀 - 锐头	Fine Science Tools	14063-09
在线水加热器	Warner Instruments	SH-27B
Integra™ Miltex™ 组织镊	Fisher Scientific	12-460-117
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
七水合硫酸镁	Sigma-Aldrich	M1880
无水 MgCl	Sigma-Aldrich	M8266
显微操作器	Narishige	MN-153
ML 133 盐酸盐	Tocris	4549
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NS309	Tocris	3895
Picospritzer III - 胞内微量注射分配系统，双通道	Parker Hannifin	052-0500-900
带蠕动泵的压强伺服控制器	Living Systems Instrumentation	PS-200
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P3662
超精细镊子	Fine Science Tools	11252-20
手术剪 - 锐头钝头	Fine Science Tools	14001-13
垂直微电极拉制仪	Narishige	PP-83