Den nuvarande manuskript Detaljer hur man isolerar Hippocampus arterioler och kapillärer från mus hjärnan och hur man pressar dem för tryck myography, immunofluorescenser, biokemi, och molekylära studier.
Från subtila beteendemässiga förändringar till sent stadium demens, vaskulär kognitiv svikt utvecklas typiskt efter cerebral ischit. Stroke och hjärtstillestånd är anmärkningsvärt sexuellt dimorfiska sjukdomar, och båda inducera cerebral ischa. Emellertid, framsteg i förståelsen av vaskulär kognitiv svikt, och sedan utveckla könsspecifika behandlingar, har delvis begränsats av utmaningar i att undersöka hjärnans mikrocirkulation från musmodeller i funktionella studier. Här presenterar vi en metod för att undersöka kapillär-till-arteriole signalering i en ex vivo Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole (HiCaPA) beredning från mushjärna. Vi beskriver hur man isolerar, kanylera, och pressa mikrocirkulationen för att mäta arteriolär diameter som svar på kapillärstimulering. Vi visar vilka lämpliga funktionella kontroller kan användas för att validera HiCaPA förberedelse integritet och Visa typiska resultat, inklusive testning av kalium som en neurovaskulär koppling agent och effekten av den nyligen kännetecknas hämmare av Kir2 inåt korrigera kalium kanal familj, ML133. Vidare jämför vi svaren i beredningar erhållna från manliga och kvinnliga möss. Även om dessa data återspeglar funktionella utredningar, kan vår metod också användas inom molekylärbiologi, immunokemi och elektrofysiologiska studier.
Den piala cirkulationen på hjärnans yta har varit föremål för mycket studie, delvis på grund av dess experimentella tillgänglighet. Dock skapar topologin för cerebral kärlsystemet distinkta regioner. I motsats till den robusta Arvika nätverk rik på anastomoser med betydande kapacitet för att omdirigera blodflödet, intracerebral parenkymala arterioler (PAS) nuvarande begränsade säkerheter försörjning, var och en av dem parfymera en diskret volym av nervvävnad1,2. Detta skapar en flaskhals effekt på blodflödet som, kombinerat med unika fysiologiska funktioner3,4,5,6,7,8, gör intracerebral arterioler en avgörande plats för cerebralt blodflöde (CBF)regel 9,10. Trots de tekniska utmaningarna i samband med isolering och kanylering av utbetalande organen har det senaste decenniet sett ett ökat intresse för ex vivo funktionella studier med tryckkärl11,12,13,14,15,16,17. En av anledningarna till detta ökade intresse är den avsevärda forskningsinsatser som bedrivs på neurovaskulär koppling (NVC), mekanismen upprätthålla hjärnans funktionella hyperemi18.
Regionalt, CBF kan snabbt öka efter lokala neurala aktiveringen19. Den cellulära mekanismer och signalering egenskaper kontrollera NVC är ofullständigt förstås. Emellertid, vi identifierade en tidigare oväntad roll för hjärnans kapillärer under NVC i avkänning Neural aktivitet och översätta den till en hyperpolariserande elektrisk signal till vidga uppströms arterioler20,21,22. Actionpotentialer23,24 och öppnande av stor-conductance ca2 +-aktiverad K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 öka interstitiell kalium Jon koncentrationen [k+]o, vilket resulterar i aktivering av stark aktiv likriktare K+ (KIR) kanaler i det vaskulära endotelet i kapillärerna. Denna kanal aktiveras av externa K+ men också av hyperpolarisering själv. Spridning genom gap korsningar, den hyperpolariserande strömmen sedan återskapar i angränsande kapillära endotelceller upp till arteriole, där det orsakar myocyt avslappning och CBF öka20,21. Studiet av denna mekanism ledde oss att utveckla en trycksatt kapillär-parenkymal arteriole (Capa) beredning för att mäta arteriolär diametern under kapillärstimulering med vasoaktiva agenter. Den CaPA preparatet består av en kanylerad intracerebral arteriole segment med en intakt, nedströms kapillär ramification. Kapillärändarna komprimeras mot kammarens glasbotten med en mikropipett, som ockluderar och stabiliserar hela vaskulär bildningen20,21.
Vi har tidigare gjort instrumentella innovationer genom Imaging Capa preparat från mus barken20,21 och arterioler från råtta amygdala13 och Hippocampus16,17. Som Hippocampus kärlsystemet får mer uppmärksamhet på grund av dess mottaglighet för patologiska tillstånd, här ger vi en steg-för-steg-metod för Capa beredning från musen Hippocampus (hicapa) som inte bara kan användas i funktionella NVC studier men också i molekylärbiologi, immunokemi, och elektrofysiologi.
Den trycksatta hicapa (Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole) beredning beskrivs i det nuvarande manuskriptet är en förlängning av vår väletablerade förfarande för att isolera, tryck, och studera parenkymal arterioler29. Vi rapporterade nyligen att Kir 2,1 kanaler i hjärnan kapillära endotelceller känsla ökar i [K+]o i samband med neurala aktivering, och generera en stigande hyperpolariserande signal som Vidar uppströms arterioler20. A…
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Jules Morin för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet. Denna forskning finansierades av utmärkelser från CADASIL tillsammans har vi hopp ideell organisation, centrum för kvinnors hälsa och forskning, och NHLBI R01HL136636 (FD).
0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
NS309 | Tocris | 3895 | |
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |