Summary
Hele 3D-strukturen og cellulært innhold av organoider, samt deres fenotypisk likhet med det opprinnelige vevet, kan fanges ved hjelp av encellede 3D-bildeprotokollen som er beskrevet her. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form.
Abstract
Organoid teknologi, in vitro 3D-dyrking av miniatyrvev, har åpnet et nytt eksperimentelt vindu for cellulære prosesser som styrer organutvikling og funksjon samtsykdom. Fluorescensmikroskopi har spilt en viktig rolle i å karakterisere deres cellulære sammensetning i detalj og demonstrere deres likhet med vevet de kommer fra. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende protokoll for høyoppløselig 3D-avbildning av hele organoider ved immunofluorescerende merking. Denne metoden er allment anvendelig for avbildning av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form. Så langt har vi brukt metoden til luftveier, kolon, nyre, og lever organoider avledet fra sunt menneskelig vev, samt menneskelige bryst tumor organoider og mus brystkjertel organoider. Vi bruker et optisk clearingmiddel, FUnGI, som gjør det mulig å anskaffe hele 3D-organoider med mulighet for encellede kvantifisering av markører. Denne tre-dagers protokollen fra organoid høsting til bildeanalyse er optimalisert for 3D-avbildning ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Introduction
Utviklingen av nye kulturmetoder, som organoidteknologi, har gjort det mulig for organkulturen i en tallerken1. Organoider vokser til tredimensjonale (3D) strukturer som ressemble deres vev av opprinnelse som de bevare fenotypisk og funksjonelle egenskaper. Organoider er nå medvirkende til å ta opp grunnleggendebiologiske spørsmål 2, modellering sykdommer inkludert kreft3, og utvikle personlig behandling strategier4,5,6,7. Siden den første protokollen for å generere organoider avledet fra intestinal voksenstamceller 8,organoid teknologi har utvidet til å omfatte et bredt spekter av sunne og kreftvev avledet fra organer inkludert prostata9,hjernen10,lever11,12, mage13, bryst14,15, endometrium16, spyttkjertel17, smaksløken18, bukspyttkjertel19, og nyre20.
Utviklingen av organoider har konkludert med fremveksten av nye volumetriske mikroskopiteknikker som kan visualisere arkitekturen av hele mount vev i 3D21,22,23,24. 3D-bildebehandling er bedre enn tradisjonell 2D-vevsseksjonsavbildning for å visualisere den komplekse organiseringen av biologiske prøver. 3D-informasjon viser seg å være avgjørende for å forstå cellulær sammensetning, celleform, celleskjebnebeslutninger og cellecelleinteraksjoner av intakte biologiske prøver. Ikke-destruktive optiske snittingsteknikker, for eksempel konfokal eller multi-foton laserskanning mikroskopi (CLSM og MLSM) og lysark fluorescens mikroskopi (LSFM), nå muliggjør kombinert visualisering av både fine detaljer, samt generell vev arkitektur, innenfor en enkelt biologisk prøve. Denne kraftige bildetilnærmingen gir mulighet til å studere den strukturelle kompleksiteten som kan modelleres med organoider25 og kartlegge romlig fordeling, fenotypisk identitet og cellulær tilstand av alle individuelle celler som komponerer disse 3D-strukturene.
Nylig publiserte vi en detaljert protokoll for høyoppløselig 3D-avbildning av faste og klarerte organoider26. Denne protokollen er spesielt designet og optimalisert for behandling av delikate organoidstrukturer, i motsetning til metoder for store intakte vev som DISCO27,,28,CUBIC29,,30,,31ogCLARITY 32,,33. Som sådan er denne metoden generelt gjelder for et bredt utvalg av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form og cellulært innhold. Videre, sammenlignet med andre volumetriske bildeprotokoller som ofte krever betydelig tid og krefter, er vår protokoll lite krevende og kan fullføres innen 3 dager. Vi har brukt vår 3D imaging protokoll for å visualisere arkitektur og cellulær sammensetning av nyutviklede organoidsystemer avledet fra ulike vev, inkludert menneskeligeluftveier 34,nyre20,lever 11,og menneskelig brystkreft organoider15. I kombinasjon med flerfarget fluorescerende avstamning sporing, denne metoden har også blitt brukt til å avsløre biopotens av basalceller i mus mammary organoider14.
Her finjusterer vi protokollen ved å introdusere det giftfrie clearingagentet FUnGI35. FUnGI clearing oppnås i et enkelt inkubasjonstrinn, er lettere å montere på grunn av viskositeten, og bevarer bedre fluorescens under lagring. I tillegg introduserer vi natrium dodecylsulfat (SDS) til vaskebufferen for å forbedre kjernefysiske flekker samt en silikonbasert monteringsmetode for enkel gliseforberedelse før mikroskopi. Figur 1 gir den grafiske oversikten over protokollen (figur 1A) og eksempler på 3D-avbildede organoider (figur 1B−D). Kort sagt, organoider gjenopprettes fra deres 3D-matrise, fast og immunolabeled, optisk ryddet, avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi og deretter 3D gjengitt med visualiseringsprogramvare.
Protocol
Bruk av mus-avledede organoider i samsvar med regulatoriske standarder og ble godkjent av Walter og Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Alle humane organoidprøver ble hentet fra biobanker gjennom Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). Fullmakter ble innhentet av Medical Ethical Committee of UMC Utrecht (METC UMCU) på forespørsel fra HUB for å sikre overholdelse av dutch Medical Research Involving Human Subjects Act og informert samtykke ble innhentet fra givere når det er hensiktsmessig.
1. Tilberedning av reagenser
- For å forberede 4 % (w/v) paraformaldehyd (PFA) varmes det 400 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til i underkant av 60 °C i et vannbad. Tilsett 20 g PFA pulver og oppløs ved hjelp av en rører.
- Deretter legger du til noen dråper 10 M NaOH. La avkjøles på isen og tilsett noen dråper på 10 M HCl for å justere pH til 7,4. Påfør med PBS til 500 ml og aliquot (oppbevares ved -20 °C i opptil 2 måneder).
MERK: Ikke varm opp over 60 °C for å unngå nedbrytning av PFA. Tilberedningstid = 4 timer.
- Deretter legger du til noen dråper 10 M NaOH. La avkjøles på isen og tilsett noen dråper på 10 M HCl for å justere pH til 7,4. Påfør med PBS til 500 ml og aliquot (oppbevares ved -20 °C i opptil 2 måneder).
- For å klargjøre PBS med Tween-20 (PBT) (0,1 % v/v), tilsett 1 ml Tween-20 til 1 L PBS (oppbevares ved 4 °C i opptil 4 uker).
MERK: Tilberedningstid = 10 min. - For å forberede 100 ml 0,5 M etylendiaminetetraacetic acid (EDTA), tilsett 18,6 g EDTA og 2,5 g NaOH til 80 ml dH2O. Juster pH til 8 med 1 M NaOH og fyll til 100 ml med dH2O.
- For å forberede 500 ml 1 M Tris oppløs 60,55 g Tris med 42 ml konsentrert (36-38 %) HCl i 300 ml dH2O. Juster pH til 8 og fyll til 500 ml.
- For å forberede organoid vaskebuffer (OWB), tilsett 1 ml Triton X-100, 2 ml 10% (w / v) SDS og 2 g storfe serumalbumin (BSA) til 1 L PBS (oppbevares ved 4 ° C opptil 2 uker).
MERK: Tilberedningstid = 10 min. - For å lage 220 ml FUnGI, bland 110 ml glyserol med 20 ml dH2O, 2,2 ml Tris buffer (1 M, pH 8,0) og 440 μL EDTA (0,5 M). Tilsett 50 g fruktose og bland ved romtemperatur (RT) i mørket til den er oppløst. Når det er klart, tilsett 49 g fruktose og bland til oppløst. Tilsett deretter 33,1 g urea og bland til oppløst (oppbevares ved 4 °C i mørket).
MERK: Ikke varm opp som fruktosekaramelliserer ved høyere temperaturer. FUnGI består av 50% (v / v) glyserol, 9,4% (v / v) dH2O, 10,6 mM tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruktose og 2,5 M urea. Tilberedningstid = 1 dag. - For å klargjøre PBS-BSA (1 % w/v) oppløs 1 g BSA i 100 ml PBS (oppbevares ved 4 °C opptil 2 uker).
MERK: Tilberedningstid = 10 min.
2. Organoid utvinning
MERK: Følgende trinn gjelder organoider dyrket i kjellermembranekstrakt (BME) som ble dyrket i en 24 brønnplate med en størrelse på 100-500 μm .
- Aspirer kulturmediet og vask 1x med iskald PBS. Unngå å forstyrre 3D-matrisen.
- Sett platen på is og tilsett 1 ml iskald celleutvinningsløsning (Table of Materials) til hver brønn. Inkuber 30–60 min ved 4 °C på en horisontal shaker (40 o/min).
MERK: 3D-matrisedråpene skal oppløses fullstendig. - Coat en 1 ml pipettespiss med BSA ved å dyppe i 1% PBS-BSA og pipettering opp og ned 2x. Dette belegget vil hindre organoider fra å holde seg til spissen. For å belegge innsiden av et konisk rør på 15 ml, fyll med 5 ml 1 % PBS-BSA, inverter 2−3x og kast PBS-BSA.
MERK: Dette belegget er nødvendig for alle forbruksvarer av plast til fiksering (trinn 3.3). - Bruk en belagt spiss til å forsiktig bruke innholdet i brønnen 5-10x og overfør organoidene til belagte 15 ml rør. Organoider fra forskjellige brønner med samme identitet kan være samlet i samme rør.
- Tilsett 1 ml iskald 1% PBS-BSA til hver kultur godt for å skylle og samle alle organoider.
- Tilsett kald PBS til 10 ml og spinn ned i 3 min ved 70 x g og 4 °C for å få en tett pellet uten et synlig lag med 3D-matrise. Fjern forsiktig det overnaturlige.
3. Fiksering og blokkering
- Forsiktig resuspend organoider i 1 ml iskald PFA ved hjelp av en belagt 1 ml tips.
- Fest ved 4 °C i 45 min. Forsiktig resuspend organoider halvveis gjennom fikseringstiden ved hjelp av en belagt 1 ml tips for å sikre jevn fiksering blant alle organoider.
- Tilsett 10 ml iskald PBT i røret, bland forsiktig ved å invertere røret, inkuber i 10 min og spinn ned på 70 x g, begge ved 4 °C.
MERK: Fra dette trinnet og utover er belegg av tips vanligvis ikke nødvendig, da de fleste organoide typer ikke holder seg til spissen etter fiksering. Noen organoider kan imidlertid kreve belagt plast selv etter fiksering. - Blokker organoidene ved å bruke pelleten i iskalde OWB (minst 200 μL OWB per brønn) og overfør organoidene til en 24-brønns suspensjonsplate.
MERK: Organoider fra en stor pellet kan deles over flere brønner for å utføre forskjellige flekker. - Inkuber ved 4 °C i minst 15 min.
4. Immunolabeling
- Pipette 200 μL OWB i en tom brønn for å fungere som referansebrønn.
MERK: Immunolabelingen kan også utføres i 48- eller 96-brønnplater for å redusere antistoffbruken. Brukeren bør imidlertid være oppmerksom på at både farging og vaskeytelse kan reduseres på grunn av mindre volum. - La organoidene bosette seg på bunnen av platen.
MERK: Dette kan kontrolleres ved hjelp av et stereomikroskop og gjøres enklere ved hjelp av en mørk bakgrunn. - Vipp platen 45° og fjern OWB slik at organoidene i 200 μL OWB (bruk referansebrønnen til å estimere 200 μL).
- Tilsett 200 μL OWB med primære antistoffer 2x konsentrert (f.eks. E-kadherin [1:400] og Ki67 [1:200] for resultater i figur 1; keratin 5 [1:500], keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], og Ki67 [1:200] for resultater i figur 2) og inkuber over natten ved 4 °C mens det er mildt gynge/riste (40 rpm på horisontal shaker).
- Neste dag legger du til 1 ml OWB.
- La organoidene bosette seg på bunnen av platen i 3 min. Fjern OWB slik at 200 μL i platen. Tilsett 1 ml OWB og vask 2 timer med mild gynge/risting.
- Gjenta trinn 4.6 to ganger til.
- La organoidene bosette seg på bunnen av platen i 3 min. Fjern OWB slik at 200 μL i brønnen.
- Tilsett 200 μL OWB med sekundære antistoffer, konjugerte antistoffer og fargestoffer 2x konsentrert (f.eks. DAPI [1:1000], rotte-AF488 [1:500], mus-AF555 [1:500], falloidin-AF647 [01:100] for resultater i figur 1; DAPI [1:1000], rotte-AF488 [1:500], kanin-AF555 [1:500], mus-AF555 [1:500], falloidin-AF647 [1:100] for resultater i figur 2; DAPI [1:1000], falloidin-AF647 [1:100] for resultater i figur 3) og inkuber over natten ved 4 °C mens den lett gynger/rister.
- Neste dag gjentar du trinn 4.5-4.7.
- Overfør organoidene til et 1,5 ml rør og spinn ned på 70 x g i 3 min.
5. Optisk rydding av organoider
- Fjern så mye som mulig OWB ved å pipettering uten å forstyrre organoider.
- Tilsett FUnGI (minst 50 μL, RT) ved hjelp av en 200 μL-spiss med enden avskåret og bruk forsiktig for å forhindre bobledannelse. Inkuber ved RT i 20 min.
MERK: Optisk rydding av FUnGI kan forårsake mindre vevkrymping. Dette vil ikke påvirke den generelle morfologien til monolayered og flerlags organoider; Sfæriske formede monolags organoider med store lumen kan imidlertid kollapse. Protokollen kan settes på pause her og prøver kan lagres ved 4 °C (i minst 1 uke) eller ved -20 °C (i minst 6 måneder).
6. Skyv forberedelse for konfokal bildebehandling
- Forbered en 10 ml sprøyte med silikontetningsmasse (Materialsekk). Fest en 200 μL tupp og klipp av enden for å tillate en mild strøm av viskøs silikon etter å ha trykket på sprøyten. Bruk sprøyten til å tegne et rektangel på 1 cm x 2 cm midt på et lysbilde.
- Klipp av enden av en 200 μL tupp og overfør organoidene i FUnGI til midten av rektangelet.
- Plasser en dekkslipp på toppen. For å minimere fanget luftbobler, plasser venstre side av dekkglasset først, og senk deretter dekkslipsen sakte fra venstre til høyre til det ikke er fanget luft og slipp deretter dekkslipsen.
MERK: Avstandssyr som er simililar i størrelse til organoider kan brukes til å hindre dem i å bli skadet. - Legg forsiktig press på alle kantene på dekkslippen for å feste den godt til silikontetningsmassen. Lysbildet er nå klart for bildebehandling.
MERK: Protokollen kan settes på pause her, og prøven kan oppbevares ved 4 °C (i minst 1 uke) eller -20 °C (i minst 6 måneder).
7. Bildeanskaffelse og behandling
- Ved hjelp av et konfokal laserskanningsmikroskop (Materialstabell ) bilde lysbildet med en multi-nedsenking 25x eller olje nedsenking 40x mål for konfokal avbildning.
- Bruk følgende anskaffelsesinnstillinger for målsettingen på 25 x: skannemodusramme, rammestørrelse 1024 x 1024, voxelstørrelse 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, pikselbotid <2 μs, toveis skanning, gjennomsnitt nummer 1, bitdybde 8. Hvis du vil redusere fotobleaching, bruker du lav lasereffekt (<5 % generelt, <10 % for svak farging).
- Bruk Z-stakkmodus til å definere nedre og øvre grenser og sette Z-trinnsstørrelsen til optimal. Når du avbilder store organoidstrukturer eller flere organoider sammen, bruk flisleggingsmodus med 10% overlapping og angi interesseområdet.
MERK: Med disse innstillingene er datastørrelsen for en typisk organoid med en diameter på <300 μm <1 GB.
- For datasett for flisskanningsdata, sy bildefilene i programvaren sammen med mikroskopet (Materialse ). Velg Søm som metode i behandlingsdelen, velg Ny utdata under parametere og velg filen du vil sy. Trykk på Påfør for å starte sømmen.
- Få en 3D-gjengitt representasjon av bildet under 3D-visning-fanen i bildeprogramvaren (Materialstabell ) og optimaliser deretter egenskaper for lysstyrke, kontrast og 3D-gjengivelse. Eksporter RGB-øyeblikksbilder av resultatene som TIFF-filer.
Representative Results
Imaging organoider i 3D muliggjør visualisering av arkitektur, cellulær sammensetning samt intracellulære prosesser i stor detalj. Den presenterte teknikken er lite krevende og kan antagelig brukes på et bredt spekter av organoide systemer som er avledet fra ulike organer eller vertsarter.
Styrken av 3D-bildebehandling sammenlignet med 2D-bildebehandling illustreres av bilder av musepattedyrkjertel organoider som ble generert ved hjelp av nylig publiserte metoder14. Det sentrale laget av disse organoidene består av søyleformede K8/K18-positive luminalceller, og det ytre laget inneholder langstrakte K5-postive basalceller (figur 2A), som rekafulerer morfologien til brystkjertelen in vivo. Denne polariserte organisasjonen er utfordrende å sette pris på fra en 2D optisk del av det samme organoid (Figur 2B, midtpanel). Et annet eksempel på en kompleks struktur som er umulig å tolke uten 3D-informasjon er nettverket av MRP2-positive canaliculi som letter innsamlingen av gallevæsken av menneskelige leverorganoider11 (figur 2B). Dette eksemplifiserer hvordan vår metode tillater visualisering av essensielle strukturelle egenskaper av organoider. Videre gir den oppnådde kvaliteten og oppløsningen mulighet for halvautomatisk segmentering og bildeanalyse. Dermed kan totale celletall og tilstedeværelse av markører kvantifiseres i spesifikke cellulære undertyper i hele organoider. Vi illustrerer dette ved å segmentere kjernene i en hel organoid som inneholder 140 celler, hvorav 3 celler viser høy positivitet for Ki67 cellesyklusmarkøren (figur 2C). DAPI-kanalen er valgt som kildekanal, og segmenter genereres basert på et intensitetsterskelseringstrinn og en sfærediameter på 10 μm. Berøringsobjekter er delt av region som vokser fra frøpunkter. Til slutt brukes et størrelsesfilter på 10 voxels for å fjerne små støyinduserte segmenter. For hvert segment som representerer en kjerne, eksporteres deretter gjennomsnittsintensiteten til Ki67-kanalen for plotting.
Vi har nylig utviklet det optiske clearingagentet FUnGI35, som vi nå integrert i denne protokollen for å avgrense gjennomsiktigheten til organoidene. FUnGI er enkel å bruke, da clearing lett oppnås ved et enkelt inkubasjonstrinn etter immunofluorescerende farging. En ekstra fordel med midlet er viskositeten, noe som gjør det lettere for prøvehåndtering under skyvemontering. Fluorescerende prøver i FUnGI bevarer fluorescensen selv når de oppbevares i flere måneder ved -20 °C. Vi viser at FUnGI overgår uklart og fruktose-glyserol i fluorescerende signalkvalitet dypt i organoid (figur 3A, B),og at sopp-ryddet organoider har samlet forbedret fluorescens intensitet sammenlignet med uklare organoider (Figur 3C).
Oppsummert beskriver vi en lite utligningsteknikk for reproduserende 3D-bildebehandling for å skaffe volumetriske data av immunolabeled organoider. Denne protokollen kan lett brukes til å bilde en rekke organoider, inkludert de av både mus og menneskelig opprinnelse, fra sunne og sykdomsmodeller. Det enkle prøvepreparatet kan tilpasses for å lette konfokale, multi-foton og lysark fluorescerende mikroskoper for å oppnå cellulær til subcellulær oppløsning av hele organoider.
Figur 1: Skjematisk oversikt over 3D-bildeprotokollen med høy oppløsning. Organoider gjenopprettes fra deres 3D-matrise. Fiksering og blokkering utføres før immunolabeling med antistoffer og fargestoffer. Optisk clearing oppnås i ett trinn ved hjelp av FUnGI-clearingagenten. 3D-gjengivelse av bilder kan utføres ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. (A) Skjematisk oversikt over prosedyren. (B)Ryddet hel-mount 3D confocal bilde av en menneskelig colonic organoid immunolabeled for F-actin og E-cadherin (E-cad) (25x olje mål). Vektstangen = 40 μm. (C) Ryddet helmontert 3D confocal bilde. Vektstangen = 20 μm. (D) Forstørret optisk del av en human colonic organoid immunolabeled for F-actin, E-cadherin (E-cad) og Ki67 (25x olje mål). Vektstangen = 5 μm. Dette tallet er endret fra Dekkers et al.26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Volumetrisk bildebehandling visualiserer kompleks 3D-arkitektur. Konfokale bilder som representerer 3D-datasett med full montering (venstre panel), 2D optiske seksjoner (midtpanel) og 3D-områder i et forstørret område (høyre panel). (A)En organoid avledet fra en enkelt basalcelle i musepattedyrkjertelen som illustrerer 3D-organiseringen av langstrakte brystbasalceller som omgir luminalceller eller merket for K8/18, K5 og F-actin (fruktose-glyserolrydding; 25x oljemål). Skaleringsstolper representerer 55 μm (venstre panel) og 40 μm (midtre og høyre paneler). (B)En human fosterlever organoid med et komplekst 3D-nettverk av MRP2-positive canaliculi, merket for DAPI, MRP2 og F-actin (fruktose-glyserol clearing; 40x olje mål). Skaleringsstolper representerer 25 μm (venstre panel) og 8 μm (midtre og høyre paneler). (C) Confocal 3D helmontert bilde av en human fosterlever organoid merket med DAPI og Ki67 (venstre panel) og et segmentert bilde på DAPI-kanalen ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (midtpanel). Vektstangen = 15 μm. Graf plottet som representerer Ki67 gjennomsnittlig intensitet i alle cellene (DAPI-segmentert) av hele organoid (140 celler) (høyre panel). Dette tallet er endret fra Dekkers et al.26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optisk rydding av organoider med FUnGI. (A) Representative bilder av humane kolonorganoider merket med F-actin (grønn) og DAPI (grå) og avbildet uten rydding, ryddet med fruktose-glyserol eller ryddet med FUnGI (25x oljemål). Venstre panel: 3D-gjengivelse av organoiden. Høyre panel: optisk del av organoiden ved 150 μm dybde. For "ingen clearing" tilstand lysstyrken på bildet måtte økes i forhold til "fruktose-glyserol" og "FUnGI" forhold for å visualisere organoid. Vektstangen = 50 μm. (B) Ikke-lineær regresjonspassform som viser reduksjon av DAPI-intensitet med økende Z-dybde for ulike optiske avregningsmetoder. Verdier representerer intensiteter av individuelle celler oppdaget ved DAPI-segmentering og normaliseres til den gjennomsnittlige DAPI-intensiteten av organoidens første 50 μm. For å unngå undervurdering av dempingen forårsaket av lysere celler på de dypere kantene og spirende strukturer, ble bare de midterste områdene av organoidene analysert. (C) Tre organoider per tilstand av lignende størrelse og dybde mot dekkglasset ble avbildet ved hjelp av identiske mikroskopinnstillinger. De fullstendige 3D-datasettene ble segmentert på DAPI-signal til sammenligning. Stolpediagram som viser gjennomsnittlig DAPI-intensitet med ulike avregningsmetoder på fullstendige segmenterte datasett. Data er avbildet som gjennomsnitt ± SD. Verdier er intensiteter på > 3800 individuelle celler oppdaget av DAPI-segmentering. = p < 0,0001, Kruskal-Wallis test med tosidig Dunns flere sammenligning etter hoc testing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her legger vi frem en detaljert protokoll for 3D-avbildning av intakte organoider med encelleoppløsning. For å kunne utføre denne protokollen, må noen kritiske trinn tas. I denne delen fremhever vi disse trinnene og gir feilsøking.
Det første kritiske trinnet er fjerning av 3D-matrisen. De fleste organoider forplantes in vitro ved bruk av matriser som etterligner in vivo ekstracellulære omgivelser for å forbedre dannelsen av godt polariserte 3D-strukturer. Fiksering og påfølgende farging i 3D-matrisen er mulig, men kan være ugunstig for penetrasjon av antistoffer eller kan generere høyt bakgrunnssignal (data som ikke vises). Effektiv fjerning av matriser kan påvirkes av typen matrise, mengden og størrelsen på organoidene og langvarig dyrking. Derfor kan optimalisering være nødvendig for ulike kulturforhold. For organoider dyrket i Matrigel eller BME, er et 30-60 min trinn i iskald celleutvinningsløsning tilstrekkelig til å oppløse matrisen uten å skade organoidene. I tillegg kan fjerning av støtte 3D matrise føre til tap av innfødte strukturer og forstyrrelse av organoidkontakter med andre celletyper, for eksempel når organoider er co-dyrket med fibroblaster eller immunceller. Videre er optimal organoid fiksering avgjørende for å bevare 3D vevarkitektur, proteinantigenitet og minimere autofluorescence. Feste i 45 min med 4% PFA ved 4 °C er normalt tilstrekkelig for merking av et bredt spekter av organoider og antigener. Imidlertid er et lengre fikseringstrinn, opptil 4 timer, vanligvis mer hensiktsmessig for organoider som uttrykker fluorescerende reporterproteiner, men vil kreve optimalisering for forskjellige fluoroforer. Fikseringstider kortere enn 20 min er utilstrekkelige til å merke F-actin riktig ved hjelp av falloidinsonder. Et annet vanlig problem er tap av organoider under protokollen. Det er derfor viktig å (i) forsiktig belegge pipetspisser og rør med 1% BSA-PBS som beskrevet ved håndtering av uløste organoider for å hindre dem i å holde seg til plast, (ii) bruke lav tilslutning eller suspensjonsplater for å avverge prøven fra å holde seg til platen, og (iii) gi nok tid til organoidene å bosette seg på bunnen av platen før de forsiktig fjerner buffere. Pipettering viskøs FUnGI kan introdusere bobler. Håndtering av den klarerte prøven ved RT reduserer viskositeten og forbedrer brukervennligheten, og minimerer dermed tap av organoider. Mens de fleste organoider er enkle å håndtere, har cystiske organoider med forstørrede lumen en høy tendens til å kollapse når de fikserer med 4% PFA eller når de er ryddet med FUnGI. Denne effekten kan reduseres, men ikke helt forebygges, ved hjelp av et annet fikseringsmiddel (f.eks formalin eller PFA-glutaraldehyd). Dette kan imidlertid potensielt påvirke autofluorescence, antistoffpenetrasjon og epitoptilgjengelighet. Når cystiske organoider vises brettet etter rydding, anbefales det å hoppe over clearing trinn og bilde av multi-foton mikroskopi, som er mindre hemmet av lyssppitting. Til slutt kan det være utfordrende å skaffe hele 3D-strukturen av organoider og krever minimal avstand mellom dekkslip og organoid. I tillegg, når organoider har plass til å bevege seg i monteringsmidlet, kan dette resultere i X- og Y-skift mens du registrerer data i Z-dybde. Bruk av mindre silikontetningsmasse under glimning kan løse suboptimal montering mellom dekkglass og mikroskopsklie. Imidlertid kan for lite silikon føre til organoid kompresjon og tap av deres iboende 3D-struktur. FUnGI forbedrer håndteringen for skyvemontering og stabilitet av organoider under avbildning, på grunn av sin høyere viskositet.
Selv om denne protokollen kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner for å studere i dybden cellulært innhold og 3D-arkitektur av intakte organoider, bør visse begrensninger vurderes. Denne metodikken er ganske lav gjennomstrømming og tidkrevende. Faktisk bør brukerne huske på at avbildning av store intakte organoider i 3D krever både flislegging og prøveoppkjøp i Z, noe som fører til lengre oppkjøpstider. Raskere bildebehandling kan oppnås ved hjelp av mikroskopressurser, inkludert resonans eller spinnende diskskanner, eller ved lysarkmikroskopteknologi26. En annen vurdering er at markører kan være heterogent uttrykt mellom forskjellige organoider fra samme prøve. Derfor bør flere organoider erverves for å bedre fange denne organoide heterogeniteten i kulturen. Til slutt, mens den fullstendige våte laboratorieprosedyren er grei, krever etterbehandling av data ferdigheter i bildeanalyseprogramvare for 3D-visualisering og kvantifisering, samt statistikk for gruvedrift all informasjonen som finnes i datasettet.
I det siste tiåret har feltet volumavbildning sterkt avansert, på grunn av både utviklingen av et bredt spekter av optiske clearing agenter og forbedringer i mikroskopi og beregningsteknologier27,,30,,31. Mens i det siste de fleste studier fokusert på store volum avbildning av organer eller tilhørende svulster, mer nylig metoder for mindre og mer skjøre vev, inkludert organoid strukturer, har blitt utviklet36,37,38. Vi har nylig publisert en enkel og rask metode for å avbilde helmonterte organoider av forskjellig opprinnelse, størrelse og form på enkeltcellenivå for etterfølgende 3D-gjengivelse og bildeanalyse26, som vi presenterte her med noen forbedringer (f.eks FUnGI, silikonmontering) og ledsaget av en videoprotokoll. Denne metoden er overlegen konvensjonell 2D seksjonsbasert avbildning i å tyde kompleks cellemorfologi og vevsarkitektur (figur 2) og lett å implementere i laboratorier med et konfokalt mikroskop. Med små tilpasninger til protokollen, kan prøvene gjøres kompatible med, superoppløsning konfokal, multi-foton samt lysarkavbildning, noe som gjør denne protokollen allment anvendelig og gir brukerne et kraftig verktøy for bedre å forstå den flerdimensjonale kompleksiteten som kan modelleres med organoider.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er veldig takknemlige for den tekniske støtten fra Princess Máxima Center for Pediatric Oncology og til Hubrecht Institute og Zeiss for bildestøtte og samarbeid. All bildebehandling ble utført på Princess Máxima bildesenter. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Princess Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD ble støttet av et Marie Curie Global Fellowship og et VENI-stipend fra Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO). ACR ble støttet av et oppstartsstipend fra Det europeiske råd (ERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H.
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
