Hele 3D-strukturen og cellulært innhold av organoider, samt deres fenotypisk likhet med det opprinnelige vevet, kan fanges ved hjelp av encellede 3D-bildeprotokollen som er beskrevet her. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form.
Organoid teknologi, in vitro 3D-dyrking av miniatyrvev, har åpnet et nytt eksperimentelt vindu for cellulære prosesser som styrer organutvikling og funksjon samtsykdom. Fluorescensmikroskopi har spilt en viktig rolle i å karakterisere deres cellulære sammensetning i detalj og demonstrere deres likhet med vevet de kommer fra. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende protokoll for høyoppløselig 3D-avbildning av hele organoider ved immunofluorescerende merking. Denne metoden er allment anvendelig for avbildning av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form. Så langt har vi brukt metoden til luftveier, kolon, nyre, og lever organoider avledet fra sunt menneskelig vev, samt menneskelige bryst tumor organoider og mus brystkjertel organoider. Vi bruker et optisk clearingmiddel, FUnGI, som gjør det mulig å anskaffe hele 3D-organoider med mulighet for encellede kvantifisering av markører. Denne tre-dagers protokollen fra organoid høsting til bildeanalyse er optimalisert for 3D-avbildning ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Utviklingen av nye kulturmetoder, som organoidteknologi, har gjort det mulig for organkulturen i en tallerken1. Organoider vokser til tredimensjonale (3D) strukturer som ressemble deres vev av opprinnelse som de bevare fenotypisk og funksjonelle egenskaper. Organoider er nå medvirkende til å ta opp grunnleggendebiologiske spørsmål 2, modellering sykdommer inkludert kreft3, og utvikle personlig behandling strategier4,5,6,7. Siden den første protokollen for å generere organoider avledet fra intestinal voksenstamceller 8,organoid teknologi har utvidet til å omfatte et bredt spekter av sunne og kreftvev avledet fra organer inkludert prostata9,hjernen10,lever11,12, mage13, bryst14,15, endometrium16, spyttkjertel17, smaksløken18, bukspyttkjertel19, og nyre20.
Utviklingen av organoider har konkludert med fremveksten av nye volumetriske mikroskopiteknikker som kan visualisere arkitekturen av hele mount vev i 3D21,22,23,24. 3D-bildebehandling er bedre enn tradisjonell 2D-vevsseksjonsavbildning for å visualisere den komplekse organiseringen av biologiske prøver. 3D-informasjon viser seg å være avgjørende for å forstå cellulær sammensetning, celleform, celleskjebnebeslutninger og cellecelleinteraksjoner av intakte biologiske prøver. Ikke-destruktive optiske snittingsteknikker, for eksempel konfokal eller multi-foton laserskanning mikroskopi (CLSM og MLSM) og lysark fluorescens mikroskopi (LSFM), nå muliggjør kombinert visualisering av både fine detaljer, samt generell vev arkitektur, innenfor en enkelt biologisk prøve. Denne kraftige bildetilnærmingen gir mulighet til å studere den strukturelle kompleksiteten som kan modelleres med organoider25 og kartlegge romlig fordeling, fenotypisk identitet og cellulær tilstand av alle individuelle celler som komponerer disse 3D-strukturene.
Nylig publiserte vi en detaljert protokoll for høyoppløselig 3D-avbildning av faste og klarerte organoider26. Denne protokollen er spesielt designet og optimalisert for behandling av delikate organoidstrukturer, i motsetning til metoder for store intakte vev som DISCO27,,28,CUBIC29,,30,,31ogCLARITY 32,,33. Som sådan er denne metoden generelt gjelder for et bredt utvalg av organoider som varierer i opprinnelse, størrelse og form og cellulært innhold. Videre, sammenlignet med andre volumetriske bildeprotokoller som ofte krever betydelig tid og krefter, er vår protokoll lite krevende og kan fullføres innen 3 dager. Vi har brukt vår 3D imaging protokoll for å visualisere arkitektur og cellulær sammensetning av nyutviklede organoidsystemer avledet fra ulike vev, inkludert menneskeligeluftveier 34,nyre20,lever 11,og menneskelig brystkreft organoider15. I kombinasjon med flerfarget fluorescerende avstamning sporing, denne metoden har også blitt brukt til å avsløre biopotens av basalceller i mus mammary organoider14.
Her finjusterer vi protokollen ved å introdusere det giftfrie clearingagentet FUnGI35. FUnGI clearing oppnås i et enkelt inkubasjonstrinn, er lettere å montere på grunn av viskositeten, og bevarer bedre fluorescens under lagring. I tillegg introduserer vi natrium dodecylsulfat (SDS) til vaskebufferen for å forbedre kjernefysiske flekker samt en silikonbasert monteringsmetode for enkel gliseforberedelse før mikroskopi. Figur 1 gir den grafiske oversikten over protokollen (figur 1A) og eksempler på 3D-avbildede organoider (figur 1B−D). Kort sagt, organoider gjenopprettes fra deres 3D-matrise, fast og immunolabeled, optisk ryddet, avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi og deretter 3D gjengitt med visualiseringsprogramvare.
Her legger vi frem en detaljert protokoll for 3D-avbildning av intakte organoider med encelleoppløsning. For å kunne utføre denne protokollen, må noen kritiske trinn tas. I denne delen fremhever vi disse trinnene og gir feilsøking.
Det første kritiske trinnet er fjerning av 3D-matrisen. De fleste organoider forplantes in vitro ved bruk av matriser som etterligner in vivo ekstracellulære omgivelser for å forbedre dannelsen av godt polariserte 3D-strukturer. Fiksering og påfølgende farging i 3D-matrisen er mulig, men kan være ugunstig for penetrasjon av antistoffer eller kan generere høyt bakgrunnssignal (data som ikke vises). Effektiv fjerning av matriser kan påvirkes av typen matrise, mengden og størrelsen på organoidene og langvarig dyrking. Derfor kan optimalisering være nødvendig for ulike kulturforhold. For organoider dyrket i Matrigel eller BME, er et 30-60 min trinn i iskald celleutvinningsløsning tilstrekkelig til å oppløse matrisen uten å skade organoidene. I tillegg kan fjerning av støtte 3D matrise føre til tap av innfødte strukturer og forstyrrelse av organoidkontakter med andre celletyper, for eksempel når organoider er co-dyrket med fibroblaster eller immunceller. Videre er optimal organoid fiksering avgjørende for å bevare 3D vevarkitektur, proteinantigenitet og minimere autofluorescence. Feste i 45 min med 4% PFA ved 4 °C er normalt tilstrekkelig for merking av et bredt spekter av organoider og antigener. Imidlertid er et lengre fikseringstrinn, opptil 4 timer, vanligvis mer hensiktsmessig for organoider som uttrykker fluorescerende reporterproteiner, men vil kreve optimalisering for forskjellige fluoroforer. Fikseringstider kortere enn 20 min er utilstrekkelige til å merke F-actin riktig ved hjelp av falloidinsonder. Et annet vanlig problem er tap av organoider under protokollen. Det er derfor viktig å (i) forsiktig belegge pipetspisser og rør med 1% BSA-PBS som beskrevet ved håndtering av uløste organoider for å hindre dem i å holde seg til plast, (ii) bruke lav tilslutning eller suspensjonsplater for å avverge prøven fra å holde seg til platen, og (iii) gi nok tid til organoidene å bosette seg på bunnen av platen før de forsiktig fjerner buffere. Pipettering viskøs FUnGI kan introdusere bobler. Håndtering av den klarerte prøven ved RT reduserer viskositeten og forbedrer brukervennligheten, og minimerer dermed tap av organoider. Mens de fleste organoider er enkle å håndtere, har cystiske organoider med forstørrede lumen en høy tendens til å kollapse når de fikserer med 4% PFA eller når de er ryddet med FUnGI. Denne effekten kan reduseres, men ikke helt forebygges, ved hjelp av et annet fikseringsmiddel (f.eks formalin eller PFA-glutaraldehyd). Dette kan imidlertid potensielt påvirke autofluorescence, antistoffpenetrasjon og epitoptilgjengelighet. Når cystiske organoider vises brettet etter rydding, anbefales det å hoppe over clearing trinn og bilde av multi-foton mikroskopi, som er mindre hemmet av lyssppitting. Til slutt kan det være utfordrende å skaffe hele 3D-strukturen av organoider og krever minimal avstand mellom dekkslip og organoid. I tillegg, når organoider har plass til å bevege seg i monteringsmidlet, kan dette resultere i X- og Y-skift mens du registrerer data i Z-dybde. Bruk av mindre silikontetningsmasse under glimning kan løse suboptimal montering mellom dekkglass og mikroskopsklie. Imidlertid kan for lite silikon føre til organoid kompresjon og tap av deres iboende 3D-struktur. FUnGI forbedrer håndteringen for skyvemontering og stabilitet av organoider under avbildning, på grunn av sin høyere viskositet.
Selv om denne protokollen kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner for å studere i dybden cellulært innhold og 3D-arkitektur av intakte organoider, bør visse begrensninger vurderes. Denne metodikken er ganske lav gjennomstrømming og tidkrevende. Faktisk bør brukerne huske på at avbildning av store intakte organoider i 3D krever både flislegging og prøveoppkjøp i Z, noe som fører til lengre oppkjøpstider. Raskere bildebehandling kan oppnås ved hjelp av mikroskopressurser, inkludert resonans eller spinnende diskskanner, eller ved lysarkmikroskopteknologi26. En annen vurdering er at markører kan være heterogent uttrykt mellom forskjellige organoider fra samme prøve. Derfor bør flere organoider erverves for å bedre fange denne organoide heterogeniteten i kulturen. Til slutt, mens den fullstendige våte laboratorieprosedyren er grei, krever etterbehandling av data ferdigheter i bildeanalyseprogramvare for 3D-visualisering og kvantifisering, samt statistikk for gruvedrift all informasjonen som finnes i datasettet.
I det siste tiåret har feltet volumavbildning sterkt avansert, på grunn av både utviklingen av et bredt spekter av optiske clearing agenter og forbedringer i mikroskopi og beregningsteknologier27,,30,,31. Mens i det siste de fleste studier fokusert på store volum avbildning av organer eller tilhørende svulster, mer nylig metoder for mindre og mer skjøre vev, inkludert organoid strukturer, har blitt utviklet36,37,38. Vi har nylig publisert en enkel og rask metode for å avbilde helmonterte organoider av forskjellig opprinnelse, størrelse og form på enkeltcellenivå for etterfølgende 3D-gjengivelse og bildeanalyse26, som vi presenterte her med noen forbedringer (f.eks FUnGI, silikonmontering) og ledsaget av en videoprotokoll. Denne metoden er overlegen konvensjonell 2D seksjonsbasert avbildning i å tyde kompleks cellemorfologi og vevsarkitektur (figur 2) og lett å implementere i laboratorier med et konfokalt mikroskop. Med små tilpasninger til protokollen, kan prøvene gjøres kompatible med, superoppløsning konfokal, multi-foton samt lysarkavbildning, noe som gjør denne protokollen allment anvendelig og gir brukerne et kraftig verktøy for bedre å forstå den flerdimensjonale kompleksiteten som kan modelleres med organoider.
The authors have nothing to disclose.
Vi er veldig takknemlige for den tekniske støtten fra Princess Máxima Center for Pediatric Oncology og til Hubrecht Institute og Zeiss for bildestøtte og samarbeid. All bildebehandling ble utført på Princess Máxima bildesenter. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Princess Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD ble støttet av et Marie Curie Global Fellowship og et VENI-stipend fra Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO). ACR ble støttet av et oppstartsstipend fra Det europeiske råd (ERC).
1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
Imaris software | Bitplane | ||
Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
Workstation | Dell |