Summary
장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.
Abstract
오르가노이드 기술, 미니어처 조직의 체외 3D 배양, 장기 개발 및 기능뿐만 아니라 질병을 제어하는 세포 과정에 대한 새로운 실험 창을열었습니다. 형광 현미경 검사는 세포 구성을 자세하게 특성화하고 그들이 유래 한 조직과 유사성을 입증하는 데 중요한 역할을했습니다. 이 문서에서는 면역 형광 라벨링시 전체 오르가노이드의 고해상도 3D 이미징을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 기원, 크기 및 모양이 다른 오르가노이드의 이미징에 널리 적용됩니다. 지금까지 우리는 건강한 인간 조직에서 파생 된 기도, 결장, 신장 및 간 오르가노이드뿐만 아니라 인간의 유방 종양 오르가노이드 및 마우스 유방 선 동맥 오르간로이드에 방법을 적용했습니다. 우리는 마커의 단세포 정량화를 위한 기회와 함께 전체 3D 오르가노이드의 취득을 가능하게 하는 광학 클리어링 에이전트, FUnGI를 사용합니다. 오르간구지 수확에서 이미지 분석에 이르는 이 3일간의 프로토콜은 공초점 현미경 검사를 사용하여 3D 이미징에 최적화되어 있습니다.
Introduction
오르가노이드 기술과 같은 새로운 문화 방법의 발전은 요리1에서장기의 문화를 가능하게했습니다. 오르가노이드는 현상과 기능적 특성을 보존할 때 기원의 조직을 닮은 3차원(3D) 구조로 자랍니다. 오르가노이드는 이제 근본적인 생물학적 질문2,암3을포함한 모델링 질환, 맞춤형 치료 전략4,5,56,7을개발하는 데 중요한 역할을 하고 있다.,6 장 내 성인19줄기세포8에서 유래된 오르가노이드 생성을8위한 첫 번째 프로토콜 이후, 오르가노이드 기술은 전립선9,뇌10,간11,,12,위13,유방14,,15,내메리움16,침샘17, 18,18,맛, 18, 췌장 등 장기로부터 추출한 다양한 건강및 암 조직을 포함하도록 확장되었다.20
오르가노이드의 발달은 3D,,21,22,23,24에서전체 마운트 조직의 아키텍처를 시각화 할 수있는 새로운 체적 현미경 기술의 상승과 일치했다., 3D 이미징은 생물학적 표본의 복잡한 조직을 시각화하는 전통적인 2D 조직 단면도 이미징보다 우수합니다. 3D 정보는 세포 조성, 세포 모양, 세포 운명 결정 및 그대로 생물학적 샘플의 세포 세포 상호 작용을 이해하는 데 필수적임을 입증합니다. 공초점 또는 다광레이저 스캐닝 현미경검사(CLSM 및 MLSM) 및 라이트 시트 형광 현미경검사(LSFM)와 같은 비파괴 광학 단면 기술은 이제 단일 생물학적 표본 내에서 미세한 세부 사항뿐만 아니라 일반 조직 아키텍처의 결합된 시각화를 가능하게 한다. 이 강력한 이미징 접근법은오르가노이드(25)로 모델링할 수 있는 구조적 복잡성을 연구하고 이러한 3D 구조를 구성하는 모든 개별 세포의 공간 분포, 현상적 정체성 및 세포 상태를 매핑할 수 있는 기회를 제공한다.
최근에 우리는 고정 및 클리어 오르가노이드26의고해상도 3D 이미징을위한 상세한 프로토콜을 발표했다. 이 프로토콜은 DISCO 27,28,CUBIC29,,,3130,31 및27,CLARITY,32,33과같은 큰 온전한 조직에 대한 방법론과는 달리 섬세한 오르가노이드 구조를 처리하기 위해 특별히 설계및 최적화되어 있습니다. 따라서, 이 방법은 일반적으로 기원, 크기 및 모양 및 세포 함량이 다른 다양한 오르가노이드에 적용됩니다. 또한 상당한 시간과 노력이 필요한 다른 볼륨 이미징 프로토콜과 비교하여 프로토콜은 까다롭고 3 일 이내에 완료 될 수 있습니다. 인간기도34,신장20,간11,인간 유방암 오르가노이드15등 다양한 조직에서 파생된 새로 개발된 오르가노이드 시스템의 아키텍처 및 세포 조성을 시각화하기 위해 3D 이미징 프로토콜을 적용하였다. 다색 형광 계보 추적과 함께,이 방법은 마우스 유방 오르가노이드(14)에서기저 세포의 생체 효능을 드러내는 데사용되었습니다.
여기서, 우리는 무독성 클리어링 에이전트 FUnGI(35)를도입하여 프로토콜을 구체화한다. FUnGI 클리어링은 단일 인큐베이션 단계에서 달성되며 점도로 인해 장착하기가 더 쉬우며 저장 중에 형광을 더 잘 보존합니다. 또한, 핵 염색을 향상시키기 위해 세척 버퍼에 나트륨 도데실 황산염(SDS)을 도입하고, 현미경 검사전에 쉽게 슬라이드 준비를 할 수 있도록 실리콘 기반 장착 방법을 소개합니다. 도 1은 프로토콜(도 1A)과3D 이미지 오르가노이드의 예(도1B−D)의그래픽 개요를 제공한다. 요컨대, 오르가노이드는 3D 매트릭스에서 회수되고, 고정 및 면역 라벨을 고정하고, 광학적으로 지워지고, 공초점 현미경을 사용하여 이미지화한 다음 시각화 소프트웨어로 렌더링된 3D입니다.
Protocol
마우스 유래 오르가노이드의 사용은 규제 기준에 부합하며 월터와 엘리자 홀 연구소(WEHI) 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 인간 오르가노이드 샘플은 허브레흐트 오르가노이드 기술(HUB, www.hub4organoids.nl)을 통해 바이오뱅크에서 회수되었습니다. 허가는 인간 과목법과 관련된 네덜란드 의학 연구를 준수하기 위해 HUB의 요청에 따라 UMC Utrecht (METC UMCU)의 의료 윤리위원회에 의해 얻어졌으며 적절한 경우 기부자로부터 통보 된 동의를 얻었습니다.
1. 시약 준비
- 4% (w/v) 파라포름알데히드(PFA)를 준비하려면 400mL의 인산염 완충식식염수(PBS)를 수조에서 60°C 이하로 가열한다. PFA 파우더 20g을 넣고 교반기로 녹입니다.
- 다음으로, 10 M NaOH의 몇 방울을 추가합니다. 얼음을 식히고 10 M HCl 몇 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정하십시오. PBS ~ 500mL 및 알리쿼트(최대 20°C에 보관)로 위로 올려보세요.
참고: PFA의 분해를 피하기 위해 60°C 이상으로 가열하지 마십시오. 준비 시간 = 4 시간.
- 다음으로, 10 M NaOH의 몇 방울을 추가합니다. 얼음을 식히고 10 M HCl 몇 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정하십시오. PBS ~ 500mL 및 알리쿼트(최대 20°C에 보관)로 위로 올려보세요.
- Tween-20 (PBT)(0.1% v/v)으로 PBS를 준비하려면 1mL의 Tween-20 ~ 1 L 의 PBS를 추가하십시오 (최대 4 주 동안 4 ° C에 저장).
참고: 준비 시간 = 10분. - 0.5M 에틸렌디아민테트라아세틱산(EDTA)의 100mL를 준비하려면 EDTA 18.6g, NaOH 2.5g을 dH2O의 80mL에 넣고 1M NaOH로 pH를 8m NaOH로 조정하고 dH2O로 100mL로 채우한다.
- 1M 트리의 500mL를 준비하려면 42mL의 농축액(36-38%)으로 60.55g의 트리스를 녹입니다. HCl은 300mL의 dH2O.에서 pH를 8으로 조정하고 500mL로 채웁니다.
- 오가노이드 세척 버퍼(OWB)를 준비하려면 트리톤 X-100 1mL 1mL, SDS 10%(w/v) SDS 2m, 소세럼 알부민(BSA) 2g을 PBS 1L(최대 2주까지 저장)한다.
참고: 준비 시간 = 10분. - 220mL의 FUnGI를 만들려면 110mL의 글리세롤을 dH220mL, 트라이 버퍼 2.2mL(1M, pH 8.0) 및 EDTA(0.5M)의 440 μL을 혼합한다. 과당 50g을 넣고 실온(RT)에서 녹을 때까지 섞습니다. 클리어하면 과당 49g을 넣고 용해될 때까지 섞습니다. 그런 다음 33.1 g의 우레아를 넣고 용해 될 때까지 섞습니다 (어둠 속에서 4 °C에 보관하십시오).
참고: 과당캐러가 더 높은 온도에서 캐러멜화되기 때문에 가열하지 마십시오. FUnGI는 50% (v/v) 글리세롤, 9.4% (v/v) dH2O, 10.6 mM 트라이베이스, 1.1 mM EDTA, 2.5 M 과당 및 2.5 M 우레아로 구성됩니다. 준비 시간 = 1 일. - PBS-BSA(1%w/v)를 준비하려면 PBS 100mL에 BSA 1g을 녹입니다(최대 2주 까지 4°C에 저장).
참고: 준비 시간 = 10분.
2. 오르가노이드 회복
참고: 다음 단계는 지하 막 추출물(BME)에서 재배된 오가노이드에 적용되어 100-500 μm 크기의 24개의 웰 플레이트에서 배양되었다.
- 배양 매체를 흡기하고 얼음처럼 차가운 PBS로 1x를 씻으세요. 3D 행렬을 방해하지 마십시오.
- 접시를 얼음 위에 놓고 각 웰에 얼음 차가운 세포 회수 용액(재료 표)의1 mL을 추가합니다. 수평 셰이커 (40 rpm)에 4 °C에서 30-60 분 인큐베이션.
참고: 3D 매트릭스 액적은 완전히 용해되어야 합니다. - 1% PBS-BSA에 찍어 2배 위아래로 파이펫을 하여 BSA로 1mL 파이펫 팁을 코팅합니다. 이 코팅은 오르가노이드가 팁에 달라붙는 것을 방지합니다. 15mL 원추형 튜브의 내부 측면을 코팅하려면 1 % PBS-BSA의 5 mL로 채우고 2-3 x를 반전시키고 PBS-BSA를 폐기하십시오.
참고 : 이 코팅은 고정 (단계 3.3)까지 모든 플라스틱 소모품에 필요합니다. - 코팅 된 팁을 사용하여, 부드럽게 잘 5-10x의 내용을 다시 중단하고 코팅 15 mL 튜브에 오르가노이드를 전송합니다. 동일한 정체성을 가진 다른 우물에서 오가노이드는 동일한 튜브로 풀로 풀수 있습니다.
- 모든 오르가노이드를 헹구고 수집하기 위해 각 문화에 얼음 차가운 1 % PBS-BSA 1 mL을 추가하십시오.
- 차가운 PBS를 10mL에 추가하고 70 x g 및 4 °C에서 3 분 동안 회전하여 3D 매트릭스의 가시 층없이 단단한 펠릿을 얻습니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
3. 고정 및 차단
- 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1mL의 얼음 차가운 PFA로 오가노이드를 조심스럽게 재중단합니다.
- 4°C에서 45분 동안 수정합니다. 코팅된 1mL 팁을 사용하여 고정 시간 중간에 유기체를 부드럽게 재페수아 모든 오르가노이드 중에서도 고정합니다.
- 튜브에 10mL의 얼음 차가운 PBT를 넣고 튜브를 반역하여 부드럽게 섞고, 10분 동안 배양하고, 4°C에서 70xg으로회전합니다.
참고 : 이 단계에서 부터 대부분의 오르가노이드 유형이 고정 후 팁에 달라 붙지 않기 때문에 팁 코팅은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나 일부 오르가노이드는 고정 후에도 코팅 된 플라스틱을 필요로 할 수 있습니다. - 얼음차가운 OWB(웰당 OWB의 최소 200μL)에서 펠릿을 재연하여 오르가노이드를 차단하고 오르가노이드를 24개의 잘 서스펜션 플레이트로 옮춥니다.
참고: 하나의 큰 펠릿에서 오가노이드는 다른 얼룩을 수행하기 위해 여러 우물에 분할 될 수있다. - 적어도 15 분 동안 4 °C에서 배양하십시오.
4. 면역 라벨링
- 빈 우물에서 OWB의 파이펫 200 μL을 참조로 잘 작용합니다.
참고: 면역 라벨링은 항체 사용을 줄이기 위해 48- 또는 96웰 플레이트에서 수행될 수도 있습니다. 그러나 사용자는 더 작은 부피로 인해 염색 및 세척 성능이 모두 저하될 수 있음을 알고 있어야합니다. - 오르가노이드가 접시 의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
참고: 이것은 스테레오 현미경을 사용하여 확인할 수 있고 어두운 배경을 사용하여 쉽게 합니다. - 플레이트를 45° 기울이고 OWB의 200 μL에서 오가노이드를 떠나는 OWB를 제거하십시오(참조를 잘 사용하여 200 μL을 추정합니다).
- 1차 항체 2x 농축(예: E-cadherin [1:400] 및 Ki67 [1:200]을 추가하여 도 1;각질 5 [1:500]의 결과를 위해 OWB의 200 μL을 추가합니다. 케라틴 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], 그리고 Ki67 [1:200] 그림 2의결과에 대 한 및 4°C에서 하룻밤 배양 하 고 약간 흔들기/흔들림 (수평 셰이커에 40 rpm).
- 다음 날 OWB 1mL을 추가합니다.
- 오르가노이드가 플레이트 바닥에 3분 동안 정착하도록 허용합니다. 플레이트에 200 μL을 남기는 OWB를 제거합니다. OWB 1mL을 넣고 부드러운 흔들림/흔들림으로 2h를 씻습니다.
- 4.6 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 오르가노이드가 플레이트 바닥에 3분 동안 정착하도록 허용합니다. 잘 에 200 μL을 떠나 OWB를 제거합니다.
- 이차 항체, 공각된 항체 및 염료 2x 농축(예: DAPI [1:1000], 쥐-AF488 [1:500], 마우스-AF555 [1:500], 프할로이드-AF647 [1:100] 결과와 함께 Figure 1OWB의 200 μL을 추가합니다. DAPI [1:1000], 쥐-AF488 [1:500], 토끼-AF555 [1:500], 마우스-AF555 [1:500], 프할로이드-AF647 [1:100] 도 2의결과에 대한; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] 도 3의결과에 대 한 ) 및 약간 흔들기/흔들 면서 4°C에서 하룻밤 배양.
- 다음 날, 4.5-4.7 단계를 반복합니다.
- 오르가노이드를 1.5mL 튜브로 옮기고 70 x g에서 3 분 동안 회전합니다.
5. 오르가노이드의 광학 클리어링
- 오르가노이드를 방해하지 않고 파이프팅하여 OWB를 최대한 많이 제거하십시오.
- 200 μL 팁을 사용하여 FUnGI(최소 50μL, RT)를 추가하고 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 20 분 동안 RT에서 인큐베이션.
참고: FUnGI에 의한 광학 클리어링은 경미한 조직 수축을 일으킬 수 있습니다. 이것은 단층 및 다층 오르가노이드의 일반적인 형태에 영향을 미치지 않습니다; 그러나, 큰 루멘을 가진 구형 모양단층 오르가노이드는 붕괴할 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있고 견본은 4°C (적어도 1 주 동안) 또는 -20°C (적어도 6 개월 동안)에서 저장될 수 있습니다.
6. 공초점 이미징을 위한 슬라이드 준비
- 실리콘실란트(재료표)로10mL 주사기를 준비한다. 200 μL 팁을 부착하고 주사기를 누른 후 점성 실리콘의 부드러운 흐름을 허용하기 위해 끝을 잘라냅니다. 주사기를 사용하여 슬라이드 중간에 1cm x 2cm의 직사각형을 그립니다.
- 200 μL 팁의 끝을 잘라 사각형의 중간에 FUnGI의 오르가노이드를 전송합니다.
- 커버슬립을 위에 놓습니다. 갇힌 기포를 최소화하기 위해 커버슬립의 왼쪽을 먼저 놓고, 갇힌 공기가 없을 때까지 커버슬립을 왼쪽에서 오른쪽으로 천천히 낮추고 커버슬립을 놓습니다.
참고: 오가노이드크기의 시뮬라를 사용하는 스페이서는 이를 손상시키지 않도록 사용할 수 있습니다. - 커버슬립의 모든 가장자리에 압력을 부드럽게 가하여 실리콘 실란트에 단단히 부착합니다. 이제 슬라이드가 이미징을 사용할 준비가 되었습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있고 견본은 4°C (적어도 1 주 동안) 또는 -20°C (적어도 6 개월 동안)에서 저장될 수 있습니다.
7. 이미지 수집 및 처리
- 공초점 레이저 스캐닝현미경(재료 표)을사용하여, 공초점 이미징을 위한 멀티 침수 25배 또는 오일 침지 40x 목표로 슬라이드를 이미지합니다.
- 25x 목표에 대한 다음 획득 설정을 사용합니다: 스캔 모드 프레임, 프레임 크기 1024 x 1024, 복셀 크기 332 nm x 332 nm x 1.2 μm, 픽셀 거주 시간 &2 μm, 픽셀 거주 시간 &2 μm, 양방향 스캐닝, 평균 번호 1, 비트 깊이 8. 광표백을 줄이려면 저레이저 전력(일반적으로 5%, 약한 염색시 lt;10%)을 사용하십시오.
- Z 스택 모드를 사용하여 하부 및 상한을 정의하고 Z 단계 크기를 최적으로 설정합니다. 큰 오르간구체 구조 또는 다중 오르가노이드를 함께 이미징할 때 10%가 겹치는 타일링 모드를 사용하여 관심 영역을 나타냅니다.
참고: 이러한 설정을 사용하면 직경 & 300 μm의 일반적인 오르가노이드의 데이터 크기는 <1 GB입니다.
- 타일 스캔 데이터 세트의 경우현미경(재료 표)과함께 소프트웨어에 이미징 파일을 스티치합니다. 처리 섹션에서 는 스티치를 메서드로 선택하고 매개 변수에서 새 출력을 선택하고 스티치할 파일을 선택합니다. 스티치를 시작하려면 적용을 누릅니다.
- 이미징소프트웨어(재료 표)에서 3D 뷰 탭 하에서 이미징의 3D 렌더링 된 표현을 얻고 이후에 밝기, 대조 및 3D 렌더링 특성을 최적화합니다. 결과의 RGB 스냅샷을 TIFF 파일로 내보냅니다.
Representative Results
3D의 이미징 오르가노이드는 건축, 세포 구성뿐만 아니라 세포 내 공정을 매우 자세하게 시각화할 수 있습니다. 제시된 기술은 까다롭고 아마도 다양한 기관 또는 호스트 종에서 파생되는 광범위한 오르가노이드 시스템에 적용될 수 있습니다.
2D 이미징에 비해 3D 이미징의 강도는 최근에 발표된방법(14)을사용하여 생성된 마우스 유방 선고 오르가노이드의 이미지에 의해 도시된다. 이러한 오르가노이드의 중앙 층은 기둥 모양의 K8/K18 양성 발광 세포로 구성되며 외부 층은 생체 내에서 유방 선의 형태를 재구성하는 길쭉한 K5 후유분세포(그림 2A)를함유하고 있다. 이 편광 조직은 동일한 오르가노이드(그림 2B,중간 패널)의 2D 광학 섹션에서 감사하기가 어렵습니다. 3D 정보 없이 해석할 수 없는 복잡한 구조의 또 다른 예는 인간 간오르가노이드(11)의 담즙액의 수집을 용이하게 하는 MRP2 양성 카날리큘리의 네트워크이다(도2B). 이것은 우리의 방법이 오르가노이드의 필수 구조적 특징을 시각화 할 수있는 방법을 보여 줍니다. 또한, 얻은 품질과 해상도는 반자동 세분화 및 이미지 분석을 허용합니다. 따라서, 마커의 총 세포 수 및 존재는 전체 유기체에서 특정 세포 아류형에서 정량화될 수 있다. 우리는 140 세포를 포함하는 전체 유기체의 핵을 분할하여 이를 예시하며, 그 중 3 세포는 Ki67 세포 주기 마커(도 2C)에대해 높은 양성을 표시합니다. DAPI 채널은 소스 채널로 선택되며, 세그먼트는 강도 임계값 단계와 10 μm의 구지름을 기반으로 생성됩니다. 터치 오브젝트는 시드 포인트에서 자라는 영역별로 분할됩니다. 마지막으로, 작은 노이즈 유도 세그먼트를 제거하기 위해 10 개의 복셀의 크기 필터가 적용됩니다. 핵을 나타내는 모든 세그먼트에 대해 Ki67 채널의 평균 강도는 플롯을 위해 내보냅니다.
우리는 최근에 광학 청산 제 FUnGI35를개발했는데, 이 프로토콜은 이제 오르가노이드의 투명성을 개선하기 위해이 프로토콜에 통합되었습니다. FUnGI는 면역형염색 후 단일 배양 단계에 의해 용이하게 달성되기 때문에 사용하기 쉽습니다. 에이전트의 추가 장점은 점도이며, 슬라이드 장착 시 시 시시 처리를 더 쉽게 할 수 있습니다. FUnGI의 형광 샘플은 -20°C에서 여러 달 동안 보관할 때도 형광을 보존합니다. 우리는 FUnGI가 오르가노이드(도 3A, B)에서형광 신호 품질에서 불분명하고 과당 - 글리세롤을 능가하고 곰팡이 클리어 오르가노이드가 불분명한 오르가노이드(도 3C)에비해 전반적인 형광 강도를 향상시켰다는 것을 보여줍니다.
요약하자면, 우리는 면역 표지된 오르가노이드의 체적 데이터를 획득하기 위한 까다롭고 재현 가능한 3D 이미징 기법을 설명합니다. 이 프로토콜은 건강하고 질병 모델에서 마우스와 인간 기원을 포함하여 다양한 오르가노이드를 이미지화하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 간단한 샘플 제제는 전체 유기체의 세포 분해능을 얻기 위해 공초점, 다광및 광시트 형광 현미경을 용이하게 하기 위해 조정할 수 있다.
그림 1: 고해상도 3D 이미징 프로토콜의 회로도 개요입니다. 오르가노이드는 3D 매트릭스에서 복구됩니다. 고정 및 차단은 항체 및 염료로 면역 라벨링을 하기 전에 수행됩니다. 광학 클리어링은 FUnGI 클리어링 에이전트를 사용하여 단일 단계로 달성됩니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지의 3D 렌더링을 수행할 수 있습니다. (A)절차의 회로도 개요. (B)F-액틴 및 E-카데린(E-cad)(25배 오일 목표)을 위해 표지된 인간 식민지 오르간구형 면역라벨의 전체 마운트 3D 공초점 이미지를 지웠다. 스케일 바 = 40 μm. (C)전체 마운트 3D 공초점 이미지를 클리어. 스케일 바 = 20 μm. (D)F-액틴, E-cad(E-cad) 및 Ki67(25배 오일 목표)을 위해 표지된 인간 식민지 오르가노이드 면역라벨의 광학 섹션을 확대하였다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림은 Dekkers 외26에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 볼륨 이미징은 복잡한 3D 아키텍처를 시각화합니다. 전체 마운트 3D 데이터 집합(왼쪽 패널), 2D 광학 섹션(중간 패널) 및 확대 된 영역의 3D 영역(오른쪽 패널)을 나타내는 공초점 이미지입니다. (A)발광 세포를 둘러싸고 있거나 K8/18, K5 및 F 액틴(과당-글리세롤 클리어링; 25x 오일 목표)에 표지된 길쭉한 유방 기저 세포의 3D 조직을 보여주는 마우스 유방선의 단일 기저세포에서 유래된 오르간로이드. 스케일 바는 55 μm(왼쪽 패널) 및 40 μm(중간 및 오른쪽 패널)을 나타냅니다. (B)DAPI, MRP2 및 F 액틴 (과당 - 글리세롤 클리어링; 40x 오일 목표)에 레이블이 있는 MRP2 양성 카날리큘리의 복잡한 3D 네트워크를 가진 인간 태아 간 오르간 구가성. 스케일 바는 25 μm(왼쪽 패널) 및 8 μm(중간 및 오른쪽 패널)을 나타냅니다. (C)DAPI 및 Ki67(왼쪽 패널)으로 표지된 인간 태아 간 오르가노이드의 공초점 3D 전체 마운트 이미지와 이미징 소프트웨어(중간 패널)를 사용하여 DAPI 채널상에 분할된 이미지. 스케일 바 = 15 μm. 전체 오르가노이드(140셀)(오른쪽 패널)의 모든 세포(DAPI-분할)의 Ki67 평균 강도를 나타내는 그래프 플롯. 이 그림은 Dekkers 외26에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: FUnGI를 가진 오르가노이드의 광학 클리어링. (A)F-actin (녹색) 및 DAPI (회색)로 표지된 인간 식민지 오르가노이드의 대표적인 이미지는 클리어링없이 이미지, 과당 - 글리세롤로 지워지거나 FUnGI (25x 오일 목표)로 지워집니다. 왼쪽 패널: 오르가노이드의 3D 렌더링. 오른쪽 패널: 150 μm 깊이의 오르가노이드의 광학 섹션. "클리어링 없음" 조건을 위해 이미지의 밝기는 오르가노이드를 시각화하기 위해 "과당-글리세롤" 및 "FUnGI" 조건에 비해 증가되어야 했습니다. 스케일 바 = 50 μm. (B)비선형 회귀 적합은 다른 광학 클리어링 방법에 대한 Z 깊이를 증가시켜 DAPI 강도의 감소를 나타낸다. 값은 DAPI 세분화에 의해 검출된 개별 세포의 강도를 나타내며 오르가노이드의 첫 50 μm의 평균 DAPI 강도로 정규화됩니다. 깊은 모서리와 신진 구조물에 밝은 세포에 기인하는 감쇠의 과소 평가를 피하기 위하여는, organoids의 중앙 지역만 분석되었습니다. (C)커버슬립을 향한 유사한 크기와 깊이의 조건당 3개의 오가노이드가 동일한 현미경 설정을 사용하여 이미지화하였다. 전체 3D 데이터 집합은 비교를 위해 DAPI 신호에 분할된 단일 셀이었습니다. 전체 세그먼트 데이터 집합에서 서로 다른 지우기 메서드가 있는 평균 DAPI 강도를 보여주는 막대 그래프입니다. 데이터는 평균 ± SD. 값은 DAPI 세분화에 의해 검출된 >3800 개별 셀의 강도로 묘사됩니다. = p < 0.0001, 크루스칼-월리스 는 양면 던의 다중 비교 후 호크 테스트를 통해 테스트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서, 우리는 단세포 해상도를 가진 그대로 유기체의 3D 화상 진찰을 위한 상세한 프로토콜을 제시했습니다. 이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 몇 가지 중요한 단계를 수행해야 합니다. 이 섹션에서는 이러한 단계를 강조 표시하고 문제 해결을 제공합니다.
첫 번째 중요 단계는 3D 행렬을 제거하는 것입니다. 대부분의 오르가노이드는 잘 편광 된 3D 구조의 형성을 향상시키기 위해 생체 외 세포 환경을 모방 행렬을 사용하여 시험관내에서 전파됩니다. 3D 매트릭스 내에서 고정 및 후속 염색이 가능하지만 항체의 침투에 불리하거나 높은 배경 신호(도시되지 않은 데이터)를 생성할 수 있다. 행렬의 효율적인 제거는 매트릭스의 종류, 오르가노이드의 양과 크기 및 장기간 배양에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 상이한 문화 조건에 최적화가 필요할 수 있다. Matrigel 또는 BME에서 배양된 오르가노이드의 경우, 얼음 차가운 세포 회수 용액에서 30-60 분 단계는 오르가노이드를 손상시키지 않고 매트릭스를 용해시키기에 충분합니다. 또한, 지지 3D 매트릭스의 제거는 유기체가 섬유아세포 또는 면역 세포와 공동 배양되는 경우와 같은 다른 세포 유형과의 오르가노이드 접촉의 손실 및 중단을 초래할 수 있습니다. 또한 최적의 오르가노이드 고정은 3D 조직 아키텍처, 단백질 항원성 및 자동 형광을 최소화하는 데 매우 중요합니다. 4°C에서 4% PFA로 45분 동안 고정하는 것은 일반적으로 광범위한 오르가노이드 및 항원 라벨링에 충분합니다. 그러나, 4시간까지 더 긴 고정 단계는 형광 리포터 단백질을 발현하는 오르가노이드에 더 적합하지만, 다른 형광에 대한 최적화가 필요합니다. 20분 미만의 고정 시간은 Phalloidin 프로브를 사용하여 F-actin에 적절하게 라벨을 붙이기에는 충분하지 않습니다. 또 다른 일반적인 문제는 프로토콜 동안 오르가노이드의 손실입니다. 따라서 (i) 고정되지 않은 오르가노이드를 취급할 때 설명된 바와 같이 1% BSA-PBS로 파이프 팁과 튜브를 조심스럽게 코팅하여 플라스틱에 달라붙지 않도록 하고, (ii) 저준수 또는 서스펜션 플레이트를 사용하여 샘플을 플레이트에 달라붙는 것을 방지하고, (iii) 오간이드가 플레이트 의 바닥에 정착할 수 있는 충분한 시간을 허용하는 것이 중요하다. 점성 FUnGI를 파이프팅하면 거품이 발생할 수 있습니다. RT에서 클리어된 샘플을 처리하면 점도가 감소하고 사용 편의성을 향상시켜 오르가노이드 의 손실을 최소화합니다. 대부분의 오르가노이드는 다루기 쉽지만, 확대된 루멘을 가진 낭포성 오르가노이드는 4% PFA로 고정하거나 FUnGI로 클리어할 때 붕괴하는 경향이 높습니다. 이 효과는 다른 고정(예를 들어, 포르말린 또는 PFA-글루타랄데히드)을 사용하여 완전히 방지되지는 않지만 완전히 방지될 수는 없습니다. 그러나, 이것은 잠재적으로 자동 형광에 영향을 미칠 수 있습니다., 항체 침투 및 에피토프 가용성. 낭포성 오르간노이드가 클리어링 후 접힌 것처럼 보일 때, 광산염에 의해 덜 방해되는 다중 광자 현미경검사법에 의한 클리어링 단계와 이미지를 건너뛰는 것이 좋습니다. 마지막으로, 오르가노이드의 전체 3D 구조를 얻는 것은 어려울 수 있으며 커버 슬립과 오르가노이드 사이의 최소한의 거리가 필요합니다. 또한 오르가노이드가 장착 에이전트에서 이동할 공간이 있는 경우 Z 깊이에서 데이터를 기록하는 동안 X 및 Y-shift가 발생할 수 있습니다. 슬라이드 준비 중에 실리콘 실란트를 적게 사용하면 커버슬립과 현미경 슬라이드 사이에 최적이 아닌 장착을 해결할 수 있습니다. 그러나 실리콘이 너무 적어 내장된 3D 구조의 오르간성 압축 및 손실로 이어질 수 있습니다. FUnGI는 점도가 높기 때문에 이미징을 하는 동안 슬라이드 장착 및 오르가노이드의 안정성을 위한 핸들링을 향상시킵니다.
이 프로토콜은 광범위한 응용 프로그램에서 사용하여 셀룰러 함량과 그대로 오간노이드의 3D 아키텍처를 연구할 수 있지만 특정 제한 사항은 고려해야 합니다. 이 방법론은 처리량이 적고 시간이 많이 걸립니다. 실제로 사용자는 3D의 대형 손상되지 않은 오르가노이드를 이미징하려면 Z의 타일링 과 샘플 수집이 모두 필요하며, 이는 장기간 의 인수 시간이 길어집니다. 공진 또는 방적 디스크 스캐너를 포함한 현미경 자산을 사용하거나 광시트 현미경기술(26)을사용하여 더 빠른 이미징을 얻을 수 있다. 또 다른 고려 사항은 마커가 동일한 샘플에서 다른 오르가노이드 사이에 이질적으로 표현 될 수 있다는 것입니다. 따라서, 여러 오르간노이드는 문화에서 이 오르가노이드 이질성을 더 잘 포착하기 위해 획득되어야 한다. 마지막으로 전체 습식 실험실 절차는 간단하지만 데이터의 후처리에는 3D 시각화 및 정량화를 위한 이미지 분석 소프트웨어의 기술과 데이터 집합에 있는 모든 정보를 마이닝하기 위한 통계가 필요합니다.
지난 10년 동안, 광범위한 광학 클리어링 에이전트의 개발과 현미경 및 전산 기술의 개선으로 인해 볼륨 이미징 분야가 크게발전했습니다(27,,30,,31). 과거에 대부분의 연구는 장기 또는 관련 종양의 대량 화상 진찰에 초점을 맞춘 동안, 장기 구조를 포함하여 더 작고 더 연약한 조직을 위한 더 최근에방법은, 36,,37,,38개발되었습니다. 최근에는 후속 3D 렌더링 및 이미지분석을위한 단일 셀 수준에서 다양한 기원, 크기 및 형상의 전체 마운트 오르가노이드를 이미징하는 간단하고 빠른 방법을 발표했으며, 이를 통해 몇 가지 개선 사항(예: FUnGI, 실리콘 장착)을 제시하고 비디오 프로토콜을 동반했습니다. 이 방법은 복잡한 세포 형태 및 조직아키텍처(도 2)를해독하는 기존의 2D 단면도 기반 이미징보다 우수하며 공초점 현미경을 가진 실험실에서 구현하기 쉽다. 프로토콜에 약간의 적응을 통해 샘플은 초해상도 공초점, 다중 광자 및 라이트 시트 이미징과 호환될 수 있으며, 이 프로토콜을 널리 적용할 수 있으며 사용자에게 오르가노이드로 모델링할 수 있는 다차원 복잡성을 더 잘 이해할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 소아 종양학을위한 공주 Máxima 센터와 화상 진찰 지원 및 협력을위한 Hubrecht 연구소와 자이스의 기술 지원에 매우 감사드립니다. 모든 이미징은 공주 Máxima 이미징 센터에서 수행되었다. 이 작품은 소아 종양학을위한 공주 Máxima 센터에 의해 재정적으로 지원되었다. JFD는 마리 퀴리 글로벌 펠로우십과 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 VENI 보조금에 의해 지원되었습니다. ACR은 유럽 이사회(ERC) 시작 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H.
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
