Die gesamte 3D-Struktur und der zelluläre Gehalt von Organoiden sowie ihre phänotypische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Gewebe können mit dem hier beschriebenen einzelligen 3D-Bildgebungsprotokoll erfasst werden. Dieses Protokoll kann auf eine breite Palette von Organoiden mit unterschiedlichem Ursprung, Größe und Form angewendet werden.
Organoid-Technologie, in vitro 3D-Kultivierung von Miniaturgewebe, hat ein neues experimentelles Fenster für zelluläre Prozesse geöffnet, die Organentwicklung und Funktion sowie Krankheitsteuern. Die Fluoreszenzmikroskopie hat eine wichtige Rolle dabei gespielt, ihre zelluläre Zusammensetzung im Detail zu charakterisieren und ihre Ähnlichkeit mit dem Gewebe, aus dem sie stammen, zu demonstrieren. In diesem Artikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur hochauflösenden 3D-Bildgebung ganzer Organoide bei immunfluoreszierender Etikettierung vor. Diese Methode ist weit verbreitet für die Abbildung von Organoiden unterschiedlich in Herkunft, Größe und Form. Bisher haben wir die Methode auf Atemwege, Dickdarm-, Nieren- und Leberorganoide angewendet, die aus gesundem menschlichen Gewebe stammen, sowie auf menschliche Brusttumororganoide und Maus-Mamma-Organoide. Wir verwenden ein optisches Clearing-Mittel, FUnGI, das die Erfassung ganzer 3D-Organoide mit der Möglichkeit der einzelligen Quantifizierung von Markern ermöglicht. Dieses dreitägige Protokoll von der organoiden Ernte bis zur Bildanalyse ist für die 3D-Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie optimiert.
Die Weiterentwicklung neuartiger Kulturmethoden, wie der Organoidtechnologie, hat die Kultur der Orgeln in einem Gerichtermöglicht 1. Organoide wachsen zu dreidimensionalen (3D) Strukturen, die ihr Ursprungsgewebe ressemble, da sie phänotypische und funktionelle Eigenschaften bewahren. Organoide sind jetzt entscheidend für die Behandlung grundlegender biologischer Fragen2, Modellierung von Krankheiten einschließlich Krebs3, und die Entwicklung personalisierter Behandlungsstrategien4,5,6,7. Seit dem ersten Protokoll zur Erzeugung von Organoiden, die aus darmen adulten Stammzellen abgeleitet sind8, Organoid-Technologie hat sich erweitert, um eine breite Palette von gesunden und Krebsgewebe aus Organen einschließlich Prostataabgeleitet gehören9 , Gehirn10, Leber11,12, Magen13, Brust14,15, Endometrium16, Speicheldrüse17, Geschmack Sknospe18, Bauchspeicheldrüse19, und Niere20.
Die Entwicklung von Organoiden hat mit dem Aufstieg neuer volumetrischer Mikroskopie-Techniken zueinem, die die Architektur des gesamten Reitgewebes in 3D21,22,23,24visualisieren können. Die 3D-Bildgebung ist der herkömmlichen 2D-Gewebesektionsbildgebung bei der Visualisierung der komplexen Organisation biologischer Proben überlegen. 3D-Informationen erweisen sich als wesentlich für das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Zellform, Zell-Fate-Entscheidungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen intakter biologischer Proben. Zerstörungsfreie optische Schnitttechniken wie konfokale oder multiphotonenlasersperkpere Mikroskopie (CLSM und MLSM) und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglichen nun die kombinierte Visualisierung sowohl feiner Details als auch allgemeiner Gewebearchitektur innerhalb einer einzigen biologischen Probe. Dieser leistungsstarke bildgebende Ansatz bietet die Möglichkeit, die strukturelle Komplexität zu untersuchen, die mit Organoiden25 modelliert werden kann, und die räumliche Verteilung, die phänotypische Identität und den zellulären Zustand aller einzelnen Zellen, die diese 3D-Strukturen bilden, abzubilden.
Kürzlich haben wir ein detailliertes Protokoll für hochauflösende 3D-Bildgebung von festen und gelöschten Organoiden26veröffentlicht. Dieses Protokoll wurde speziell für die Verarbeitung empfindlicher organoider Strukturen entwickelt und optimiert, im Gegensatz zu Methoden für große intakte Gewebe wie DISCO27,28, CUBIC29,30,31und CLARITY32,33. Als solche, Diese Methode ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Organoiden unterschiedlich in Herkunft, Größe und Form und Zellgehalt. Darüber hinaus ist unser Protokoll im Vergleich zu anderen volumetrischen Bildgebungsprotokollen, die oft viel Zeit und Aufwand erfordern, anspruchslos und kann innerhalb von 3 Tagen abgeschlossen werden. Wir haben unser 3D-Bildgebungsprotokoll angewendet, um die Architektur und zelluläre Zusammensetzung von neu entwickelten Organoidsystemen aus verschiedenen Geweben zu visualisieren, einschließlich menschlicher Atemwege34, Niere20, Leber11und menschliche Brustkrebsorganoide15. In Kombination mit mehrfarbigen fluoreszierenden Linienverfolgung, Wurde diese Methode auch verwendet, um die Biopotenz von Basalzellen in Maus-Mamma-Organoiden zu offenbaren14.
Hier verfeinern wir das Protokoll durch die Einführung des ungiftigen Clearingmittels FUnGI35. Das FUnGI-Clearing wird in einem einzigen Inkubationsschritt erreicht, ist aufgrund seiner Viskosität einfacher zu montieren und bewahrt die Fluoreszenz während der Lagerung besser. Darüber hinaus führen wir Natriumdodecylsulfat (SDS) in den Waschpuffer ein, um kerntechnische Färbungen zu verbessern, sowie ein Silikon-basiertes Montageverfahren zur einfachen Folienvorbereitung vor der Mikroskopie. Abbildung 1 bietet einen grafischen Überblick über das Protokoll (Abbildung 1A) und Beispiele für 3D-bildende Organoide (Abbildung 1B-D). Kurz gesagt, Organoide werden aus ihrer 3D-Matrix zurückgewonnen, fixiert und immunmarkiert, optisch gelöscht, mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und dann mit Visualisierungssoftware 3D gerendert.
Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur 3D-Bildgebung intakter Organoide mit einzelliger Auflösung vorgelegt. Um dieses Protokoll erfolgreich ausführen zu können, müssen einige wichtige Schritte unternommen werden. In diesem Abschnitt werden diese Schritte hervorgehoben und die Fehlerbehebung angezeigt.
Der erste kritische Schritt ist das Entfernen der 3D-Matrix. Die meisten Organoide werden in vitro mit der Verwendung von Matrizen vermehrt, die die extrazelluläre In-vivo-Umgebung imitieren, um die Bildung gut polarisierter 3D-Strukturen zu verbessern. Eine Fixierung und nachfolgende Färbung innerhalb der 3D-Matrix ist möglich, kann aber für das Eindringen von Antikörpern nachteilig sein oder ein hohes Hintergrundsignal erzeugen (Daten werden nicht angezeigt). Effiziente Entfernung von Matrizen kann durch die Art der Matrix, die Menge und Größe der Organoide und verlängerte Kultivierung beeinflusst werden. Daher kann eine Optimierung für unterschiedliche Kulturbedingungen erforderlich sein. Für Organoide, die in Matrigel oder BME kultiviert werden, reicht ein 30-60-min-Schritt in der eiskalten Zellrückgewinnungslösung aus, um die Matrix aufzulösen, ohne die Organoide zu schädigen. Darüber hinaus könnte die Entfernung der unterstützenden 3D-Matrix zum Verlust einheimischer Strukturen und zur Störung von organoiden Kontakten mit anderen Zelltypen führen, z. B. wenn Organoide mit Fibroblasten oder Immunzellen kokultiviert werden. Darüber hinaus ist eine optimale organoide Fixierung entscheidend für die Erhaltung der 3D-Gewebearchitektur, die Proteinantigenität und die Minimierung der Autofluoreszenz. Die Fixierung für 45 min mit 4% PFA bei 4 °C ist normalerweise ausreichend für die Kennzeichnung einer breiten Palette von Organoiden und Antigenen. Allerdings ist ein längerer Fixierungsschritt, bis zu 4 h, in der Regel besser geeignet für Organoide, die fluoreszierende Reporterproteine exezieren, erfordert aber eine Optimierung für verschiedene Fluorophore. Befestigungszeiten von weniger als 20 min reichen nicht aus, um F-Actin mit Phalloidin-Sonden richtig zu kennzeichnen. Ein weiteres häufiges Problem ist der Verlust von Organoiden während des Protokolls. Es ist daher wichtig, (i) Pipettenspitzen und Tuben sorgfältig mit 1% BSA-PBS zu beschichten, wie beschrieben, wenn sie mit unfixierten Organoiden umgehen, um zu verhindern, dass sie an Kunststoffen kleben, (ii) niedrighaften oder Suspensionsplatten verwenden, um zu verhindern, dass die Probe an der Platte klebt, und (iii) genügend Zeit zu lassen, damit sich die Organoide am Boden der Platte absetzen, bevor sie die Puffer vorsichtig entfernen. Pipettierviskose FUnGI kann Blasen einführen. Die Handhabung der gelöschten Probe bei RT verringert die Viskosität und verbessert die Benutzerfreundlichkeit, wodurch der Verlust von Organoiden minimiert wird. Während die meisten Organoide einfach zu handhaben sind, haben zystische Organoide mit einem vergrößerten Lumen eine hohe Neigung zu kollabieren, wenn sie mit 4% PFA fixieren oder mit FUnGI gelöscht werden. Dieser Effekt kann durch die Verwendung eines anderen Fixativs (z. B. Formalin oder PFA-Glutaraldehyd) reduziert, aber nicht vollständig verhindert werden. Dies könnte sich jedoch potenziell auf Autofluoreszenz, Antikörperdurchdringung und Epitopverfügbarkeit auswirken. Wenn zystische Organoide nach dem Löschen gefaltet erscheinen, wird empfohlen, den Clearingschritt und das Bild durch Multi-Photonenmikroskopie zu überspringen, die weniger durch Lichtstreuung behindert wird. Schließlich kann die Erlangung der gesamten 3D-Struktur von Organoiden eine Herausforderung sein und erfordert einen minimalen Abstand zwischen Coverslip und Organoid. Wenn Organoide platzig in ihrem Montagemittel haben, kann dies zu X- und Y-Verschiebungen führen, während daten in Z-Tiefe aufgezeichnet werden. Die Verwendung von weniger Silikondichtmittel während der Gleitvorbereitung kann die suboptimale Montage zwischen Deckel- und Mikroskopschlitten lösen. Jedoch, zu wenig Silikon kann zu organoiden Kompression und Verlust ihrer inhärenten 3D-Struktur führen. FUnGI verbessert die Handhabung für die Gleitmontage und Stabilität von Organoiden während der Bildgebung, aufgrund seiner höheren Viskosität.
Während dieses Protokoll für eine breite Palette von Anwendungen verwendet werden kann, um den zellulären Inhalt und die 3D-Architektur intakter Organoide eingehend zu untersuchen, sollten bestimmte Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Diese Methode ist eher kostengünstig und zeitaufwändig. In der Tat sollten Benutzer bedenken, dass die Bildgebung großer intakter Organoide in 3D sowohl Fliesen als auch Probenerfassung in Z erfordert, was zu längeren Erfassungszeiten führt. Eine schnellere Bildgebung könnte durch den Einsatz von Mikroskop-Assets, einschließlich Resonanz- oder Spinnscheibenscanner, oder durch Lichtbogenmikroskop-Technologie26erreicht werden. Eine weitere Überlegung ist, dass Marker heterogen zwischen verschiedenen Organoiden aus derselben Probe exprimiert werden können. Daher sollten mehrere Organoide erworben werden, um diese organoide Heterogenität in der Kultur besser einzufangen. Während das gesamte Nasslaborverfahren einfach ist, erfordert die Nachbearbeitung von Daten Kenntnisse in Bildanalysesoftware für die 3D-Visualisierung und -Quantifizierung sowie Statistiken zum Mining aller im Datensatz vorhandenen Informationen.
In den letzten zehn Jahren hat sich der Bereich der Volumenbildgebung stark weiterentwickelt, sowohl aufgrund der Entwicklung einer breiten Palette von optischen Clearing-Agenten als auch der Verbesserungen in der Mikroskopie und den Computertechnologien27,30,31. Während in der Vergangenheit die meisten Studien konzentrierten sich auf großvolumige Bildgebung von Organen oder assoziierten Tumoren, in jüngerer Zeit Methoden für kleinere und empfindlichere Gewebe, einschließlich organoider Strukturen, wurdenentwickelt 36,37,38. Wir haben vor kurzem eine einfache und schnelle Methode zur Abbildung von Vollmontage-Organoiden unterschiedlicher Herkunft, Größe und Form auf Einzelzellebene für die nachfolgende 3D-Rendering- und Bildanalyse26veröffentlicht, die wir hier mit einigen Verbesserungen (z.B. FUnGI, Silikonmontage) und begleitet von einem Videoprotokoll vorgestellt haben. Diese Methode ist der herkömmlichen 2D-Sektions-basierten Bildgebung bei der Entschlüsselung komplexer Zellmorphologie und Gewebearchitektur überlegen (Abbildung 2) und einfach in Laboratorien mit einem konfokalen Mikroskop zu implementieren. Mit leichten Anpassungen an das Protokoll können die Proben kompatibel mit, super-Auflösung konfokale, Multi-Photon sowie Lichtbogen-Bildgebung, die dieses Protokoll weit anwendbar macht und bietet Benutzern ein leistungsfähiges Werkzeug, um besser zu verstehen, die multidimensionale Komplexität, die mit Organoiden modelliert werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind sehr dankbar für die technische Unterstützung durch das Princess Mxima Center for Pediatric Oncology und das Hubrecht Institute und Zeiss für die unterstützung und Zusammenarbeit in der Bildgebung. Die gesamte Bildgebung wurde im Bildzentrum der Prinzessin Méxima durchgeführt. Diese Arbeit wurde vom Princess Mxima Center for Pediatric Oncology finanziell unterstützt. JFD wurde von einem Marie Curie Global Fellowship und einem VENI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt. Die ACR wurde von einem Startzuschuss des Europäischen Rates (ERC) unterstützt.
1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
Imaris software | Bitplane | ||
Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
Workstation | Dell |