Summary
את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.
Abstract
טכנולוגיית אורגנואיד, במבחנה 3D culturing של רקמה מיניאטורית, פתח חלון ניסיוני חדש עבור תהליכים תאיים השולטים פיתוח איברים ותפקוד, כמו גם מחלות. מיקרוסקופית פלואורסץ מילאה תפקיד מרכזי באיפיון הרכב התא שלהם בפירוט והדגמת הדמיון שלהם לרקמות שהם מקורם. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים שלמים על תיוג חיסוני. שיטה זו ישימה באופן נרחב עבור הדמיה של אורגנואידים שונים במקור, גודל וצורה. עד כה יישמענו את השיטה דרכי הנשימה, המעי הגס, הכליה, ואורגנואידים בכבד נגזר רקמה אנושית בריאה, כמו גם אורגנואידים גידול בשד אנושי אורגנואידים בלוטת עכבר. אנו משתמשים בחומר סלה אופטי, FUnGI, המאפשר רכישה של אורגנואידים תלת-מיוד שלמים עם הזדמנות לכמת חד-תאי של סמנים. פרוטוקול זה של שלושה ימים מקצירת אורגנואידים לניתוח תמונה ממוטב להדמיה תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית.
Introduction
קידום שיטות תרבות חדשניות, כגון טכנולוגיית אורגנואידים, אפשר את תרבות האיברים במנה1. אורגנואידים גדלים למבנים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) המקלים מחדש את רקמת המוצא שלהם כשהם משמרים תכונות פנוטיפיות ופונקציונליות. אורגנואידים הם כעת אינסטרומנטלילטיפול בשאלות ביולוגיות בסיסיות 2,מידול מחלות כולל סרטן 3, ופיתוח אסטרטגיות טיפול מותאמותאישית 4,5,6,7. מאז הפרוטוקול הראשון ליצירת אורגנואידים נגזר תאי גזע מבוגרים מעיים 8 , טכנולוגיית אורגנואיד התרחב לכלולמגווןרחב של רקמות בריאות סרטניים נגזר איברים כוללערמונית 9, מוח10, כבד1 1,12,בטן 13, חזה14,15,רירית הימת הי רקמה 16,בלוטת הרוק 17,בלוטת טעם 18,לבלב 19,וכליה 20.
הפיתוח של אורגנואידים הסכים עם עלייתן של טכניקות מיקרוסקופיות נפחיות חדשות שיכולות להמחות את הארכיטקטורה של רקמת הר שלמה ב-3D 21,22,23,24. הדמיה תלת-ממדית עדיפה על הדמיית מקטע רקמות 2D מסורתי בהדמיה של הארגון המורכב של דגימות ביולוגיות. מידע תלת-מיוד מוכיח שהוא חיוני להבנת הרכב תאי, צורת התא, החלטות גורל תא ואינטראקציות תא-תא של דגימות ביולוגיות שלמות. טכניקות ניתוח אופטי לא דקורטיבי, כגון מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי או רב-פוטון (CLSM ו-MLSM) ומיקרוסקופ פלואורסצנס גיליון אור (LSFM), מאפשרות כעת הדמיה משולבת של שני הפרטים העדינים, כמו גם ארכיטקטורת רקמות כללית, בתוך דגימה ביולוגית אחת. גישת הדמיה רבת עוצמה זו מספקת את ההזדמנות ללמוד את המורכבות המבנית שניתן לדגמן עםאורגנואידים 25 ולמפה את ההתפלגות המרחבית, זהות פנוטיפית ו מצב תאי של כל התאים הבודדים המחברים את המבנים תלת-ממדיים אלה.
לאחרונה פרסמנו פרוטוקול מפורט עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים קבועים ומנוקים26. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד וממוטב לעיבוד מבני אורגנואיד עדינים, בניגוד מתודולוגיות לרקמות גדולות ושלמות כגון דיסקו27,28, מעוקב29,30,31, ו CLARITY32,33. ככזה, שיטה זו ישימה בדרך כלל למגוון רחב של אורגנואידים השונים במקור, גודל וצורה ותוכן סלולרי. יתר על כן, בהשוואה לפרוטוקולי הדמיה נפחיים אחרים הדורשים לעתים קרובות זמן ומאמץ ניכרים, הפרוטוקול שלנו אינו תובעי ותושלם בתוך 3 ימים. יישמנו את פרוטוקול ההדמיה 3D שלנו כדי לדמיין את הארכיטקטורה ואת ההרכב התאי של מערכות אורגנואיד שפותחו לאחרונה נגזר רקמות שונות, כוללדרכי הנשימה האנושיות 34,כליה 20,כבד 11,אורגנואידים סרטן השדהאנושי 15. בשילוב עם מעקב פלואורסצנט צבעוני, שיטה זו שימשה גם כדי לחשוף את הפוטנטיות של תאי בסיס באורגן מאמיעכבר 14.
כאן, אנו מחדדים את הפרוטוקול על-ידי הצגת סוכן ניקוי לא-רעלים FUnGI35. ניקוי FUnGI מושגת בשלב דגירה יחיד, קל יותר להרכבה בשל צמיגותה, ושומרת טוב יותר על פלואורסץ' במהלך האחסון. בנוסף, אנו מציגים נתרן dodecyl סולפט (SDS) למאגר השטיפה כדי לשפר כתמים גרעיניים, כמו גם שיטה מבוססת סיליקון להרכבה להכנת שקופיות קלה לפני מיקרוסקופיה. איור 1 מספק מבט כולל גרפי על הפרוטוקול (איור 1A) ודוגמאות של אורגנואידים בעלי תמונות תלת-מיתיד (איור 1B-D). בקיצור, אורגנואידים התאוששו מטריצת 3D שלהם, קבוע immunolabeled, פינה אופטית, תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal ולאחר מכן 3D מעובד עם תוכנת הדמיה.
Protocol
השימוש באורגניואידים המופקים בעכבר תואם לתקנים רגולטוריים ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים ע"ש מכון וולטר ואלייזה הול (WEHI). כל דגימות האורגנואידים האנושיים הוחזרו מבנקים ביולוגיים באמצעות טכנולוגיית אורגנואיד Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). אישורים התקבלו על ידי הוועדה האתית הרפואית של UMC אוטרכט (METC UMCU) לבקשת ה-HUB על מנת להבטיח תאימות עם חוק המחקר הרפואי ההולנדי המעורב בנושאים אנושיים והסכמה מדעת התקבלה מתורמים בעת הצורך.
1. הכנת ריאה
- כדי להכין 4% (w /v) paraformaldehyde (PFA), לחמם 400 מ"ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כדי קצת פחות מ 60 ° C באמבט מים. מוסיפים 20 גרם אבקת PFA ומתמוססים באמצעות ערבוב.
- לאחר מכן, להוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH. נותנים להתקרר על הקרח ולהוסיף כמה טיפות של 10 M HCl כדי להתאים את ה-pH ל 7.4. למעלה עם PBS עד 500 מ"ל ו aliquot (חנות ב -20 °C עבור עד 2 חודשים).
הערה: אין לחמם מעל 60°C כדי למנוע השפלה של ה-PFA. זמן הכנה = 4 שעות.
- לאחר מכן, להוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH. נותנים להתקרר על הקרח ולהוסיף כמה טיפות של 10 M HCl כדי להתאים את ה-pH ל 7.4. למעלה עם PBS עד 500 מ"ל ו aliquot (חנות ב -20 °C עבור עד 2 חודשים).
- כדי להכין PBS עם Tween-20 (PBT) (0.1% v/v), הוסף 1 מ"ל של Tween-20 ל- 1 L של PBS (חנות ב- 4 °C עד 4 שבועות).
הערה: זמן הכנה = 10 דקות. - כדי להכין 100 מ"ל של 0.5 M אתילנדיאמיןtraacetic חומצה (EDTA), להוסיף 18.6 גרם של EDTA ו 2.5 גרם של NaOH כדי 80 מ"ל של dH2O. להתאים את ה-pH ל 8 עם 1 M NaOH ולמלא עד 100 מ"ל עם dH2O.
- כדי להכין 500 מ"ל של 1 M Tris, להמיס 60.55 גרם של Tris עם 42 מ"ל של מרוכז (36-38%) HCl ב 300 מ"ל של dH2O. להתאים את ה-pH ל 8 ולמלא ל 500 מ"ל.
- כדי להכין מאגר כביסה אורגנואיד (OWB), להוסיף 1 מ"ל של Triton X-100, 2 מ"ל של 10% (w /v) SDS ו 2 גרם של אלבומין סרום של סרן חזיר (BSA) ל- 1 L של PBS (חנות ב 4 °C עד 2 שבועות).
הערה: זמן הכנה = 10 דקות. - כדי להפוך 220 מ"ל של FUnGI, לערבב 110 מ"ל של גליסרול עם 20 מ"ל של dH2O, 2.2 מ"ל של מאגר Tris (1 M, pH 8.0) ו 440 μL של EDTA (0.5 M). מוסיפים 50 גרם פרוקטוז ומערבבים בטמפרטורת החדר (RT) בחושך עד להמסה. כשנקה, מוסיפים 49 גרם פרוקטוז ומערבבים עד להמסה. לאחר מכן מוסיפים 33.1 גרם אוריאה ומערבבים עד להמסה (לאחסן ב-4°C בחושך).
הערה: אין לחמם כמו פרוקטוז קרמל בטמפרטורות גבוהות יותר. FUnGI מורכבת 50% (v / v) גליטרול, 9.4% (v /v) dH2O, 10.6 mM tris בסיס, 1.1 mM EDTA, 2.5 M פרוקטוז ו 2.5 M urea. זמן הכנה = יום אחד. - כדי להכין PBS-BSA (1% עם רוחב/v), המיסו גר' אחד של BSA ב-100 מ"ל של PBS (חנות ב-4°C עד שבועיים).
הערה: זמן הכנה = 10 דקות.
2. שחזור אורגנואיד
הערה: השלבים הבאים חלים על אורגנואידים הגדלים בתמצית קרום מרתף (BME) שהיו תרבותיים בצלחת 24 באר עם גודל של 100-500 μm .
- שאף את מדיום התרבות ושטוף פי 1 עם PBS קר כקרח. הימנע משיבוש מטריצת תלת-מיוד.
- מניחים את הצלחת על קרח ומוסיפים 1 מ"ל של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח(טבלת חומרים)לכל באר. דגירה 30-60 דקות ב-4°C על שייקר אופקי (40 סל"ד).
הערה: יש לפרק לחלוטין את טיפות מטריצת תלת-מיתד. - מעיל קצה פיפטה 1 מ"ל עם BSA על ידי טבילה ב 1% PBS-BSA ו pipetting למעלה ומטה 2x. ציפוי זה ימנע אורגנואידים להיצמד לקצה. כדי לכסות את הצד הפנימי של צינור חרסי של 15 מ"ל, מלא ב- 5 מ"ל של PBS-BSA 1% , הפוך פי 2-3 ובטל את ה- PBS-BSA.
הערה: ציפוי זה נחוץ עבור כל חומרים מתכלים מפלסטיק עד קיבעון (שלב 3.3). - בעזרת קצה מצופה, תוסתר בעדינות את תכולת הבאר 5-10x והעבר את האורבנואידים לצינורות מצופה של 15 מ"ל. אורגנואידים מבארות שונות עם זהות זהה יכולים להיות מקצברים לתוך אותו צינור.
- הוסף 1 מ"ל של קר כקרח 1% PBS-BSA לכל תרבות גם לשטוף ולאסוף את כל האורגן.
- הוסף PBS קר ל-10 מ"ל והתנועב למשך 3 דקות ב-70 x g ו-4°C כדי להשיג כדור הדוק ללא שכבה נראית לעין של מטריצה תלת-מית-ת-ית- הסירו בזהירות את הסופרנטנט.
3. קיבעון וחסימה
- בזהירות respenpened את organoids ב 1 מ"ל של PFA קר כקרח באמצעות קצה מצופה 1 מ"ל.
- תקן ב-4°C ל-45 דקות. בעדינות respenpened את organoids באמצע זמן קיבעון באמצעות קצה מצופה 1 מ"ל כדי להבטיח אפילו קיבעון בין כל organoids.
- מוסיפים 10 מ"ל של PBT קר כקרח לצינור, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור, דגירה במשך 10 דקות ומסתובבים ב-70 x g, שניהם ב-4 °C.
הערה: מצעד זה ואילך ציפוי של טיפים בדרך כלל לא נחוץ כמו רוב סוגי אורגנואידים לא להיצמד לקצה לאחר קיבעון. עם זאת, אורגנואידים מסוימים עשויים לדרוש פלסטיק מצופה גם לאחר קיבעון. - לחסום את organoids על ידי תחשוף מחדש את הכדור ב OWB קר כקרח (לפחות 200 μL של OWB לבאר) ולהעביר את organoids לצלחת השעיה 24 גם.
הערה: אורגנואידים מתוך גלולה אחת גדולה ניתן לפצל על בארות מרובות כדי לבצע כתמים שונים. - דגירה ב 4 °C במשך 15 דקות לפחות.
4. אימונוללינג
- פיפט 200 μL של OWB בבאר ריקה כדי לשמש התייחסות גם.
הערה: החיסון יכול להתבצע גם ב-48 או 96 בארות כדי להפחית את השימוש בנוגדנים. עם זאת, המשתמש צריך להיות מודע לכך שביצועי הכתמים והשטיפת ניתן להפחית בשל נפח קטן יותר. - תן לאובנואידים להתיישב בתחתית הצלחת.
הערה: ניתן לבדוק זאת באמצעות סטריאומיקרוסקופ והוא נעשה קל יותר באמצעות רקע כהה. - להטות את הצלחת 45° ולהסיר OWB עוזב את organoids ב 200 μL של OWB (השתמש בחומר עזר גם כדי להעריך 200 μL).
- הוסף 200 μL של OWB עם נוגדנים ראשוניים 2x מרוכז (למשל, E-cadherin [1:400] ו Ki67 [1:200] לתוצאות באיור 1; קרטין5 [1:500], קרטין 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], ו Ki67 [1:200] לתוצאות באיור 2) ודרודר לילה ב-4°C תוך נדנדה/רעד קלות (40 סל"ד על שייקר אופקי).
- למחרת, להוסיף 1 מ"ל של OWB.
- מניחים לאוגן להתיישב בתחתית הצלחת למשך 3 דקות. הסר OWB משאיר 200 μL בצלחת. מוסיפים 1 מ"ל של OWB ולשטוף 2 שעות עם נדנדה קלה / טלטול.
- חזור על שלב 4.6 פעמיים נוספות.
- מניחים לאוגן להתיישב בתחתית הצלחת למשך 3 דקות. הסר OWB עוזב 200 μL בבאר.
- להוסיף 200 μL של OWB עם נוגדנים משניים, נוגדנים וצבעים מרוכזים 2x מרוכזים (לדוגמה, DAPI [1:1000], חולדה-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] לתוצאות באיור 1; DAPI [1:1000], חולדה-AF488 [1:500], rabbit-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] לתוצאות איור 2; DAPI [1:1000], פאלודין-AF647 [1:100] לתוצאות באיור 3) ותדגירה לילה ב-4°C תוך כדי נדנדה/רעידות קלות.
- למחרת, חזור על שלבים 4.5-4.7.
- מעבירים את האורגנואידים לצינור של 1.5 מ"ל ומסתובבים ב-70 x g למשך 3 דקות.
5. ניקוי אופטי של אורגנואידים
- להסיר ככל האפשר OWB על ידי pipetting מבלי לשבש את organoids.
- הוסף FUnGI (לפחות 50 μL, RT) באמצעות 200 μL טיפ עם הסוף לחתוך ולהשתמש מחדש בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה. דגירה ב RT במשך 20 דקות.
הערה: ניקוי אופטי על ידי FUnGI עלול לגרום להתכווצות רקמות קלה. זה לא ישפיע על המורפולוגיה הכללית של אורגנואידים חד שכבתיים ורב שכבתיים; עם זאת, אורגנואידים חד שכבתיים בצורת כדורית עם לומן גדול עלולים להתמוטט. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ודגימות ניתן לאחסן ב 4 °C (עבור לפחות 1 שבוע) או ב -20 ° C (לפחות 6 חודשים).
6. הכנת שקופיות להדמיה קונפוקל
- הכנת מזרק 10 מ"ל עם חומר איטום סיליקון(טבלת חומרים). חבר קצה μL 200 μL וחתוך את הקצה כדי לאפשר זרימה עדינה של הסיליקון צמיגי לאחר לחיצה על המזרק. השתמש במזרק כדי לצייר מלבן של 1 ס"מ על 2 ס"מ באמצע שקופית.
- חותכים את הקצה של 200 טיפ μL ולהעביר את האורגנואידים ב FUnGI לאמצע המלבן.
- מניחים כיסוי על גבי. כדי למזער בועות אוויר לכודות, מקם תחילה את הצד השמאלי של הכיסוי, ולאחר מכן הנמך באיטיות את כיסוי הכיסוי משמאל לימין עד שאין אוויר לכוד ולאחר מכן שחרר את הסם.
הערה: ניתן להשתמש במחללים הגודלים ההזויים של האורבנואידים כדי למנוע את נזקיהם. - לחץ בעדינות על כל קצוות הכיסוי כדי לחבר אותו בחוזקה לאיטום הסיליקון. השקופית מוכנה כעת להדמיה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ותו לאחסן את המדגם ב- 4 °C (למשך שבוע אחד לפחות) או -20 °C (למשך 6 חודשים לפחות).
7. רכישת תמונה ועיבוד
- באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal(טבלת חומרים),תמונה השקופית עם רב טבילה 25x או שמן טבילה 40x יעד עבור הדמיה confocal.
- השתמש בהגדרות הרכישה הבאות עבור המטרה 25x: מסגרת מצב סריקה, גודל מסגרת 1024 x 1024, גודל voxel 332 nm x 332 nm x 1.2 μm, זמן לשכון פיקסלים <2 μs, סריקה דו-כיוונית, מספר ממוצע 1, עומק סיביות 8. כדי להפחית את ההתכתמות, השתמש בהתחלת לייזר נמוכה (<5% באופן כללי, <10% עבור כתמים חלשים).
- השתמש במצב Z-stack כדי להגדיר את הגבולות הנמוכים והעליונה והגדר את גודל שלב ה- Z לאופטימלי. בעת הדמיה של מבני אורגנואידים גדולים או אורגנואידים מרובים יחד, השתמש במצב ריצוף עם חפיפה של 10% וציין את תחום העניין.
הערה: עם הגדרות אלה, גודל הנתונים עבור אורגנואיד טיפוסי בקוטר של <300 μm הוא <1 GB.
- עבור ערכות נתונים סריקת אריח, לתפור את קבצי ההדמיה בתוכנה מלווה מיקרוסקופ (טבלת חומרים). במקטע העיבוד, בחר תפירה כשיטה, בחר פלט חדש תחת פרמטרים ובחר את הקובץ לתפירה. הקש החל כדי להתחיל בתפירה.
- השג ייצוג מעובד תלת-ממדי של ההדמיה תחת הכרטיסיה תצוגת תלת-ממדית תוכנת ההדמיה(Table of Materials)ולאחר מכן מטב את מאפייני הבהירות, הניגודיות והעיבוד תלת-ממדי. יצא תמונות RGB של התוצאות כקבצי TIFF.
Representative Results
אורגנואידים הדמיה ב3D מאפשר הדמיה של אדריכלות, הרכב הסלולר, כמו גם תהליכים תאיים בפירוט רב. הטכניקה המוצגת אינה תובענית וככל הנראה ניתן להחילה על מגוון רחב של מערכות אורגנואידים הנגזרות מאיברים שונים או מינים מארחים.
הכוח של הדמיה 3D לעומת הדמיה דו-ממדית מאויר על ידי תמונות של אורגנואידים בלוטת מאם העכבר שנוצרו באמצעות שיטות שפורסמו לאחרונה14. השכבה המרכזית של אורגנואידים אלה מורכבת מתאי זוהרים בצורת טורים K8/K18, והשכבה החיצונית מכילה תאי בסיס מוארך K5-postive(איור 2A),אשר מסכם את המורפולוגיה של בלוטת המאם ב vivo. ארגון מקוטב זה מאתגר להעריך ממקטע אופטי דו-מיו-ד של אותו אורגנואיד(איור 2B,לוח אמצעי). דוגמה נוספת של מבנה מורכב כי הוא בלתי אפשרי לפרש ללא מידע 3D היא הרשת של MRP2 חיובי canaliculi המאפשרים את האיסוף של נוזל המרה של אורגנואידים כבדאנושי 11 (איור 2B). זה מדגים כיצד השיטה שלנו מאפשרת הדמיה של תכונות מבניות חיוניות של אורגנואידים. יתר על כן, האיכות והרזולוציה שהושגו מאפשרים פילוח חצי אוטומטי וניתוח תמונה. לכן, מספר תאים כולל ונוכחות של סמנים ניתן לכמת בתתי סוגים תאיים ספציפיים באורגן שלם. אנו ממחישים זאת על ידי פילוח הגרעין של אורגנואיד שלם המכיל 140 תאים, אשר 3 תאים להציג חיוביות גבוהה עבור סמן מחזור תא Ki67 (איור 2C). ערוץ DAPI נבחר כערוץ מקור, ומקטעים נוצרים בהתבסס על שלב סף עוצמה וקוטר כדור של 10 μm. אובייקטים נוגעים בהם מפוצלים לפי אזור הגדל מנקודות זרע. לבסוף, מסנן גודל של 10 voxels מוחל כדי להסיר מקטעים המושרה רעש קטן. עבור כל קטע המייצג גרעין, העוצמה המהותית של ערוץ Ki67 מיוצאית לאחר מכן לתווה.
לאחרונה פיתחנו את סוכן ניקוי אופטי FUnGI35, אשר עכשיו שילבנו בפרוטוקול זה כדי לחדד את השקיפות של organoids. FUnGI הוא קל לשימוש, כמו ניקוי מושגת בקלות על ידי צעד דגירה יחיד לאחר כתמי חיסון. יתרון נוסף של הסוכן הוא צמיגותו, מה שמקל על טיפול בדגימה במהלך הרכבת שקופיות. דגימות פלורסנט ב- FUnGI שומרות על הפלואורסצנטיות שלהן גם כאשר הם מאוחסנים במשך מספר חודשים ב-20°C. אנו מדגימים כי FUnGI עולה על ביצועים לא ברורים פרוקטוז-גליסרול באיכות אות פלורסנט עמוק באורגניואיד(איור 3A,B),וכי אורגנואידים מנוקה פטריות יש עוצמה פלואורסצנטית משופרת הכוללת בהשוואה אורגנואידים לאברור (איור 3C).
לסיכום, אנו מתארים טכניקת הדמיה תלת-ממדית לא תובענית ושחזור לרכישת נתונים רב-עוצמה של אורגנואידים עם תבלין חיסוני. פרוטוקול זה יכול לשמש בקלות כדי למצוא מגוון של אורגנואידים כולל אלה של עכבר ומוצא אנושי, ממודלים בריאים ומחלות. הכנת המדגם הפשוט ניתן להתאים כדי להקל על confocal, מולטי פוטן ומיקרוסקופי גיליון אור פלורסנט כדי להשיג רזולוציה תאית תת תאית של אורגנואידים שלמים.
איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. אורגנואידים נמצאים במטריקס תלת-מיוד שלהם. קיבעון וחסימה מתבצעים לפני immunolabeling עם נוגדנים וצבעים. ניקוי אופטי מושגת בשלב אחד באמצעות סוכן ניקוי FUnGI. ניתן לבצע עיבוד תלת-ממדי של תמונות באמצעות תוכנת הדמיה. (א)סקירה סכמטית של ההליך. (ב)פינה תמונה 3D רכוב הר מלא של אימונואיד אורגנואיד המעי הגס האנושי immunolabeled עבור F-actin ו E-cadherin (E-cad) (25x שמן המטרה). סרגל קנה מידה = 40 μm. (ג)נוקתה תמונה קונפוקל תלת-מיוד שלמה. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ד)קטע אופטי מוגדל של אימונול חיסוני אורגנואיד מעי גס אנושי עבור F-actin, E-cadherin (E-cad) ו Ki67 (25x שמן המטרה). סרגל קנה מידה = 5 μm. נתון זה שונה מ- Dekkers ואח '26. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הדמיה רב-נפחית מדמיינת ארכיטקטורה תלת-ממדית מורכבת. תמונות קונפוקליות המייצגות ערכות נתונים תלת-מיוד להרכבה שלמה (החלונית השמאלית), מקטעים אופטיים תלת-מיוד (בלוח האמצעי) ואזורים תלת-מית-מיוד של אזור מוגדל (החלונית הימנית). (א)אורגנואיד המופק מתא בזל יחיד של בלוטת מאם העכבר הממחיש את הארגון 3D של תאי בזלת מומית מוארך המקיפים תאים זוהרים או מסומן עבור K8/18, K5 ו-F-actin (ניקוי פרוקטוז-גליצרול; 25x שמן המטרה). פסים בקנה מידה מייצגים 55 μm (החלונית השמאלית) ו 40 μm (לוחות אמצעיים ויניים). (ב)אורגנואיד כבד עוברי אנושי עם רשת תלת-מימדית מורכבת של תעלות MRP2-חיוביות, המסויגות עבור DAPI, MRP2 ו-F-actin (ניקוי פרוקטוז-גליטרול; מטרת שמן פי 40). פסים בקנה מידה מייצגים 25 μm (החלונית השמאלית) ו 8 μm (לוחות אמצעיים ויניים). (ג)תמונת הרכבה שלמה תלת-ממדית קונפוקלית של אורגנואיד כבד עוברי אנושי המסומן ב- DAPI ו- Ki67 (לוח שמאלי) ותמונה מפולגת בערוץ DAPI באמצעות תוכנת הדמיה (הפאנל האמצעי). סרגל קנה מידה = 15 μm. גרף המתווים המייצג את עוצמת אומר Ki67 בכל התאים (DAPI מחולק) של האורגניואיד כולו (140 תאים) (החלונית הימנית). נתון זה שונה מ- Dekkers ואח '26. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניקוי אופטי של אורגנואידים עם FUnGI. (א)תמונות מייצגות של אורגנואידים אנושיים במעי הגס המסויגים ב-F-actin (ירוק) ו-DAPI (אפור) ותמונות ללא ניקוי, נקי עם פרוקטוז-גליטרול או נוקה עם FUnGI (25x שמן המטרה). לוח שמאלי: עיבוד תלת-ממדי של האורבנואיד. לוח ימני: קטע אופטי של האורבנואיד בעומק 150 μm. עבור מצב "אין ניקוי" הבהירות של התמונה היה צריך להיות מוגבר בהשוואה לתנאים "פרוקטוז-גליטרול" ו -"FUnGI" כדי לדמיין את האורגנואיד. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב)רגרסיה לא ליניארית מתאימה המציגה את הירידה בעוצמת DAPI עם עומק Z הולך וגדל עבור שיטות סליקה אופטיות שונות. ערכים מייצגים עוצמות של תאים בודדים שזוהו על-ידי פילוח DAPI ומנורמלים לעוצמת DAPI הממוצעת של 50 μm הראשון של organoid. כדי למנוע הערכה נמוכה של ההתכה הנגרמת על ידי תאים בהירים יותר בקצוות העמוקים יותר ומבנים ניצנים, רק האזורים המרכזיים של organoids נותחו. (ג)שלושה אורגנואידים לכל מצב בגודל ועומק דומים לכיוון כיסוי ים נתונו באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות. ערכות הנתונים המלאות של תלת-מיוד היו עם תא בודד המקטע אות DAPI לצורך השוואה. גרף עמודות המציג עוצמה ממוצעת של DAPI עם שיטות ניקוי שונות ב ערכות נתונים מפולחות מלאות. הנתונים מתוארים כנתונים ממוצעים ± SD. ערכים הם עוצמות של >3800 תאים בודדים שזוהו על-ידי פילוח DAPI. = p < 0.0001, Kruskal-Wallis מבחן עם דו צדדי של דאן השוואה מרובה לאחר הוק בדיקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
כאן, אנחנו שמים קדימה פרוטוקול מפורט להדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים שלמים עם רזולוציה של תא יחיד. כדי לבצע פרוטוקול זה בהצלחה, יש לנקוט מספר שלבים קריטיים. בסעיף זה אנו מדגישים שלבים אלה ומספקים פתרון בעיות.
הצעד הקריטי הראשון הוא הסרת מטריצת תלת-מית-מיוד. רוב האורגנואידים מופצים במבחנה עם השימוש מטריצות המחקים את הסביבה החוץ תאית vivo כדי לשפר את היווצרות של מבנים 3D מקוטב היטב. כתמים מתקבעים ובעקבות הבאים בתוך מטריצת 3D אפשרי, אבל יכול להיות נחות לחדירה של נוגדנים או יכול ליצור אות רקע גבוה (נתונים לא מוצגים). הסרה יעילה של מטריצות יכולה להיות מושפעת על ידי סוג של מטריצה, הכמות והגודל של organoids וculturing ממושך. לכן, ייתכן שיהיה צורך במיטוב עבור תנאי תרבות שונים. עבור אורגנואידים המתואורים במטריגל או BME, צעד של 30-60 דקות בתמיסת שחזור תאים קרים כקרח מספיק כדי להמיס את המטריצה מבלי לפגוע באורגנואידים. בנוסף, הסרת מטריצת 3D התומכת עלולה לגרום לאובדן מבנים מקומיים ולשיבוש של מגעים אורגנואידים עם סוגי תאים אחרים, למשל כאשר אורגנואידים הם שיתוף תרבות עם פיברובלסטים או תאים חיסוניים. יתר על כן, קיבעון אורגנואיד אופטימלי הוא חיוני בשימור ארכיטקטורת רקמות 3D, אנטי ניות חלבון ומזעור פלואורסצינטיות אוטומטית. תיקון במשך 45 דקות עם 4% PFA ב 4 °C הוא בדרך כלל מספיק עבור תיוג של מגוון רחב של אורגנואידים ואנטיגן. עם זאת, שלב קיבעון ארוך יותר, עד 4 שעות, הוא בדרך כלל מתאים יותר אורגנואידים המביעים חלבונים כתב פלורסנט, אבל ידרוש אופטימיזציה עבור פלואורופורים שונים. זמני קיבעון קצרים מ-20 דקות אינם מספיקים כדי לתייג כראוי את F-actin באמצעות בדיקות פאלואידין. בעיה נפוצה נוספת היא אובדן אורגנואידים במהלך הפרוטוקול. לכן חשוב (i) בזהירות מעיל טיפים צינור וצינורות עם 1% BSA-PBS כמתואר בעת טיפול organoids לא תקן כדי למנוע מהם דבק פלסטיק, (ii) להשתמש בדבקות נמוכה או לוחות השעיה כדי למנוע את הדגימה מדבק לצלחת, ו(iii) לאפשר מספיק זמן עבור organoids להתיישב בתחתית הלוחית לפני הסרת בזהירות את המאגרים. FUnGI צמיגי pipetting עשוי להציג בועות. טיפול הדגימה פינה ב RT מפחית צמיגות ומשפר את קלות השימוש, ובכך למזער את אובדן organoids. בעוד רוב organoids קל להתמודד, אורגנואידים סיסטיק עם לומן מוגדל יש נטייה גבוהה להתמוטט בעת תיקון עם 4% PFA או כאשר פינה עם FUnGI. אפקט זה ניתן להפחית, אבל לא לגמרי למנוע, באמצעות קיבעון שונה (למשל, פורמלין או PFA-גלוטראלדהייד). עם זאת, זה עלול להשפיע על השפעה אוטומטית, חדירה נוגדן וזמינות epitope. כאשר אורגנואידים סיסטיק מופיעים מקופלים לאחר סליקה, מומלץ לדלג על שלב הסליקה והתמונה על ידי מיקרוסקופי פוטון מרובה, אשר פחות מעוכב על ידי פיזור אור. לבסוף, השגת כל מבנה 3D של אורגנואידים יכול להיות מאתגר ודורש מרחק מינימלי בין כיסויים אורגנואיד. בנוסף, כאשר אורגנואידים יש מקום לנוע בסוכן הרכבה שלהם, זה יכול לגרום X- ו- Y-shifts בעת הקלטת נתונים בעומק Z. שימוש פחות איטום סיליקון במהלך הכנת שקופיות יכול לפתור הרכבה תת-אופטימלית בין כיסויים ושקופית מיקרוסקופ. עם זאת, מעט מדי סיליקון עלול להוביל לדחיסת אורגנואיד ואובדן של המבנה 3D הטבוע שלהם. FUnGI משפר את הטיפול בהרכבת שקופיות ויציבות של אורגנואידים תוך כדי הדמיה, בשל צמיגותו הגבוהה יותר.
בעוד פרוטוקול זה יכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים ללמוד תוכן סלולרי עומק וארכיטקטורה תלת-מימד של אורגנואידים שלמים, יש לקחת בחשבון מגבלות מסוימות. מתודולוגיה זו היא די בתפוקה נמוכה וגוזלת זמן. אכן, משתמשים צריכים לזכור כי הדמיה אורגנואידים גדולים שלמים ב3D דורש גם ריצוף ורכישת מדגם Z, המוביל לזכי רכישה ממושכות. ניתן להשיג הדמיה מהירה יותר באמצעות נכסי מיקרוסקופ, כולל סורק דיסק תהודה או ספינינג, או על ידי טכנולוגיית מיקרוסקופ גיליון אור26. שיקול נוסף הוא כי סמנים יכולים לבוא לידי ביטוי הטרוגני בין אורגנואידים שונים מאותה מדגם. לכן, אורגנואידים מרובים יש לרכוש כדי ללכוד טוב יותר הטרוגניות אורגנואיד זה בתרבות. לבסוף, בעוד הליך המעבדה הרטובה המלאה הוא פשוט, לאחר תהליך של נתונים דורש מיומנויות בתוכנה לניתוח תמונה עבור הדמיה 3D וכימות, כמו גם סטטיסטיקה לכריית כל המידע הנוכחי ב- dataset.
בעשור האחרון, תחום הדמיית נפח התקדם מאוד, הן בשל פיתוח של מגוון רחב של סוכני ניקוי אופטי ושיפורים בטכנולוגיותמיקרוסקופיות וחשביות 27,30,31. בעוד בעבר רוב המחקרים התמקדו בהדמיית נפח גדול של איברים או גידולים קשורים, לאחרונה שיטות עבור רקמות קטנות ושבריריות יותר, כולל מבנים אורגנואידים,פותחו 36,37,38. לאחרונה פרסמנו שיטה פשוטה ומהירה להדמיית אורגנואידים להרכבה שלמה ממקורות שונים, גודל וצורה ברמת התא היחיד לעיבוד תלת-ממדי וניתוחתמונה 26, שאותם הצגנו כאן עם כמה שיפורים (למשל, FUnGI, הרכבה על סיליקון) ומלווים בפרוטוקול וידאו. שיטה זו עדיפה על הדמיה דו-ממדית קונבנציונלית המבוססת על מקטע בפענוח מורפולוגיה מורכבת של תאיםוארכיטקטורת רקמות( איור 2 ) וקלה ליישום במעבדות עם מיקרוסקופ קונפוקאלי. עם התאמות קלות לפרוטוקול, הדגימות יכולות להיעשות תואמות, סופר-רזולוציה confocal, מולטי פוטן, כמו גם הדמיית גיליון אור, מה שהופך פרוטוקול זה ישים נרחב ומספק למשתמשים כלי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את המורכבות הרב מימדי שניתן לדגמן עם organoids.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של מרכז הנסיכה מקסימה לאונקולוגיה ילדים ולכון הוברכט ולזייס על תמיכה בהדמיה ושיתופי פעולה. כל ההדמיה בוצעה במרכז ההדמיה של הנסיכה מקסימה. עבודה זו נתמכה כספית על ידי מרכז הנסיכה מקסימה לאונקולוגיה ילדים. JFD נתמך על ידי מלגת מארי קירי העולמית ומענק VENI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO). ACR נתמכה על ידי מענק התחלתי של המועצה האירופית (ERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
References
- Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H.
- Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84 (2016).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
- Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
- Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342 (2013).
- Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884 (2019).
