Hele 3D-struktur og cellulære indhold af organoider, samt deres fænotopypiske lighed med det oprindelige væv kan fanges ved hjælp af encellede opløsning 3D-billeddannelse protokol beskrevet her. Denne protokol kan anvendes på en bred vifte af organoider varierende i oprindelse, størrelse og form.
Organoid teknologi, in vitro 3D dyrkning af miniaturevæv, har åbnet et nyt eksperimentelt vindue for cellulære processer, der styrer organudvikling og funktion samt sygdom. Fluorescensmikroskopi har spillet en stor rolle i at karakterisere deres cellulære sammensætning i detaljer og demonstrere deres lighed med det væv, de stammer fra. I denne artikel præsenterer vi en omfattende protokol for høj opløsning 3D-billeddannelse af hele organoider på immunfluorescerende mærkning. Denne metode er bredt anvendelig til billeddannelse af organoider forskellige i oprindelse, størrelse og form. Hidtil har vi anvendt metoden til luftveje, kolon, nyre, og lever organoider stammer fra sundt humant væv, samt menneskelige bryst tumor organoids og mus mælkekirtlen organoider. Vi bruger et optisk clearingmiddel, FUnGI, som gør det muligt at erhverve hele 3D-organoider med mulighed for encellet kvantificering af markører. Denne tre-dages protokol fra organoid høst til billedanalyse er optimeret til 3D-billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Udviklingen af nye kultur metoder, såsom organoid teknologi, har gjort det muligt kultur af organer i en skål1. Organoider vokse ind i tre-dimensionelle (3D) strukturer, resemble deres væv af oprindelse, som de bevarer fænoypiske og funktionelle træk. Organoider er nu medvirkende til at løse grundlæggendebiologiske spørgsmål 2, modellering sygdomme, herunder kræft3, og udvikle personligebehandlingsstrategier 4,5,6,7. Siden den første protokol til generering af organoider afledt af intestinal voksne stamceller8,organoid teknologi har udvidet til at omfatte en bred vifte af sunde og kræft væv stammer fra organer, herunder prostata9, hjerne10, lever11,12,mave 13, bryst14,15, endometrium16, spytkirtel17, smagsløg18, bugspytkirtel19, og nyre20.
Udviklingen af organoider har tilekom med stigningen i nye volumetriske mikroskopi teknikker, der kan visualisere arkitekturen af hele mount væv i 3D21,22,23,24. 3D-billeddannelse er bedre end traditionel 2D-vævssektionsbilleddannelse i visualiseringen af den komplekse organisering af biologiske prøver. 3D-oplysninger viser sig at være afgørende for forståelsen af cellulære sammensætning, celleform, celle-skæbne beslutninger og celle-celle interaktioner af intakte biologiske prøver. Ikke-ødelæggende optiske tværsningsteknikker, såsom konfokale eller multi-foton laserscanning mikroskopi (CLSM og MLSM) og lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM), nu muliggøre kombineret visualisering af både fine detaljer, samt generelle væv arkitektur, inden for en enkelt biologisk prøve. Denne kraftfulde billeddannelse tilgang giver mulighed for at studere den strukturelle kompleksitet, der kan modelleres med organoider25 og kortlægge den rumlige fordeling, fænotopisk identitet og cellulære tilstand af alle individuelle celler komponere disse 3D-strukturer.
For nylig offentliggjorde vi en detaljeret protokol for høj opløsning 3D-billeddannelse af faste og ryddede organoider26. Denne protokol er specielt designet og optimeret til behandling af sarte organoidstrukturer i modsætning til metoder til store intakte væv såsom DISCO27,28, CUBIC29,30,31og CLARITY32,33. Som sådan, denne metode er generelt anvendes til en bred vifte af organoids forskellige oprindelse, størrelse og form og cellulære indhold. Desuden, sammenlignet med andre volumetrisk billeddannelse protokoller, der ofte kræver betydelig tid og kræfter, vores protokol er krævende og kan udfyldes inden for 3 dage. Vi har anvendt vores 3D-billeddannelse protokol til at visualisere arkitektur og cellulære sammensætning af nyudviklede organoid systemer stammer fra forskellige væv, herunder menneskelige luftveje34,nyre20,lever 11, og menneskelige brystkræft organoider15. I kombination med flerfarvede fluorescerende afstamning sporing, denne metode er også blevet brugt til at afsløre biopotens af basalceller i mus mammary organoider14.
Her forfiner vi protokollen ved at indføre det ugiftige clearingmiddel FUnGI35. FUnGI clearing opnås i en enkelt inkubation trin, er lettere at montere på grund af sin viskositet, og bedre bevarer fluorescens under opbevaring. Derudover introducerer vi natrium dodecylsulfat (SDS) til vaskebufferen for at forbedre nukleare pletter samt en silikonebaseret monteringsmetode til nem rutsjebaneforberedelse før mikroskopi. Figur 1 giver det grafiske overblik over protokollen (Figur 1A) og eksempler på 3D-afbildede organoider (Figur 1B-D). Kort sagt, organoider inddrives fra deres 3D-matrix, fast og immunmærket, optisk ryddet, afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi og derefter 3D gengivet med visualisering software.
Her har vi fremlagt en detaljeret protokol for 3D-billeddannelse af intakte organoider med encellet opløsning. For at kunne udføre denne protokol skal der tages nogle vigtige trin. I dette afsnit fremhæver vi disse trin og udfører fejlfinding.
Det første kritiske skridt er fjernelsen af 3D-matrixen. De fleste organoider er formeret in vitro med brug af matricer, der efterligner in vivo ekstracellulære miljø for at forbedre dannelsen af vel polariserede 3D-strukturer. Fiksering og efterfølgende farvning i 3D-matrixen er mulig, men kan være ufordelagtig for udbredelsen af antistoffer eller kan generere højt baggrundssignal (data ikke vist). Effektiv fjernelse af matricer kan påvirkes af typen af matrix, mængden og størrelsen af organoids og langvarig dyrkning. Derfor kan optimering være nødvendig for forskellige kulturforhold. For organoider dyrket i Matrigel eller BME er et 30-60 min trin i den iskolde cellegenvindingsopløsning tilstrækkelig til at opløse matrixen uden at beskadige organoiderne. Desuden kan fjernelse af den understøttende 3D-matrix resultere i tab af oprindelige strukturer og afbrydelse af organoidkontakter med andre celletyper, for eksempel når organoider er co-dyrket med fibroblaster eller immunceller. Desuden er optimal organoidfiksering afgørende for at bevare 3D-vævsarkitektur, proteinantigenicitet og minimere autofluorescens. Fastsættelse i 45 min. med 4 % PFA ved 4 °C er normalt tilstrækkelig til mærkning af en lang række organoider og antigener. Men en længere fiksering skridt, op til 4 timer, er typisk mere hensigtsmæssigt for organoider udtrykke fluorescerende reporter proteiner, men vil kræve optimering for forskellige fluorophores. Fiksering gange kortere end 20 min er utilstrækkelige til korrekt mærkning F-actin ved hjælp af falloidin sonder. Et andet almindeligt spørgsmål er tabet af organoider under protokollen. Det er derfor vigtigt at (i) omhyggeligt pelsrørspidser og rør med 1% BSA-PBS som beskrevet ved håndtering af ufikserede organoider for at forhindre dem i at holde sig til plast, (ii) bruge lavklæbende eller suspensionsplader til at forhindre prøven i at holde sig til pladen, og (iii) give organerne tilstrækkelig tid til at sætte sig i bunden af pladen, før bufferne fjernes omhyggeligt. Pipettering viskøse FUnGI kan indføre bobler. Håndtering af den rensede prøve ved RT reducerer viskositeten og forbedrer brugervenligheden og minimerer dermed tab af organoider. Mens de fleste organoider er nemme at håndtere, cystiske organoider med en forstørret lumen har en høj tendens til at kollapse, når fastsættelse med 4% PFA eller når ryddet med FUnGI. Denne effekt kan reduceres, men ikke helt forebygges, ved hjælp af et andet fiksativ (f.eks. formalin eller PFA-glutaraldehyd). Men, Dette kan potentielt påvirke autofluorescens, antistof penetration og epitope tilgængelighed. Når cystiske organoider vises foldet efter clearing, anbefales det at springe clearing trin og billede ved multi-foton mikroskopi, som er mindre hæmmet af lys spredning. Endelig kan det være en udfordring at opnå hele 3D-strukturen af organoider og kræver minimal afstand mellem coverslip og organoid. Når organoider har plads til at bevæge sig i deres monteringsstof, kan det desuden resultere i X- og Y-skift, mens data optages i Z-dybde. Brug mindre silikone fugemasse under dias forberedelse kan løse suboptimal montering mellem coverslip og mikroskop dias. Men for lidt silikone kan føre til organoid kompression og tab af deres iboende 3D-struktur. FUnGI forbedrer håndteringen for diasmontering og stabilitet af organoider, mens billeddannelse, på grund af dets højere viskositet.
Mens denne protokol kan bruges til en bred vifte af applikationer til at studere i dybden cellulære indhold og 3D-arkitektur intaktorganoider, visse begrænsninger bør overvejes. Denne metode er temmelig lav-gennemløb og tidskrævende. Faktisk bør brugerne huske på, at billeddannelse store intakte organoider i 3D kræver både fliser og prøve erhvervelse i Z, hvilket fører til langvarige erhvervelse gange. Hurtigere billedbehandling kan opnås ved hjælp af mikroskop aktiver, herunder resonans eller spinning disk scanner, eller ved lys ark mikroskop teknologi26. En anden overvejelse er, at markører kan udtrykkes heterogent mellem forskellige organoider fra samme prøve. Derfor bør flere organoider erhverves for bedre at fange denne organoid heterogenitet i kulturen. Endelig, mens den komplette våde lab procedure er ligetil, efterbehandling af data kræver færdigheder i billedanalyse software til 3D visualisering og kvantificering, samt statistikker for minedrift alle de oplysninger, der findes i datasættet.
I det sidste årti, inden for volumen billeddannelse har langt fremme, på grund af både udviklingen af en bred vifte af optiske clearing agenter og forbedringer i mikroskopi og beregningsmæssige teknologier27,30,31. Mens der i fortiden de fleste undersøgelser fokuseret på store mængder billeddannelse af organer eller tilhørende tumorer, for nylig metoder til mindre og mere skrøbelige væv, herunder organoid strukturer, er blevetudviklet 36,,37,38. Vi har for nylig offentliggjort en enkel og hurtig metode til billeddannelse hel-mount organoids af forskellig oprindelse, størrelse og form på enkelt celle niveau for efterfølgende 3D-rendering og billedanalyse26, som vi præsenterede her med nogle forbedringer (f.eks FUnGI, silikone montering) og ledsaget af en video protokol. Denne metode er bedre end konventionel 2D-sektionsbaseret billeddannelse i dechifrering af kompleks cellemorfologi og vævsarkitektur (Figur 2) og let at implementere i laboratorier med konfokal mikroskop. Med små tilpasninger til protokollen, kan prøverne gøres kompatible med, super-opløsning konfokale, multi-foton samt lysark billeddannelse, hvilket gør denne protokol bredt anvendelig og giver brugerne et kraftfuldt værktøj til bedre at forstå den flerdimensionelle kompleksitet, der kan modelleres med organoider.
The authors have nothing to disclose.
Vi er meget taknemmelige for den tekniske support fra Princess Máxima Center for Pediatric Oncology og hubrecht instituttet og Zeiss for billedbehandling støtte og samarbejder. Alle billedbilleder blev udført på Princess Máxima imaging center. Dette arbejde blev støttet økonomisk af Princess Máxima Center for Pediatric Oncology. JFD blev støttet af et Samlet Marie Curie-stipendium og et VENI-tilskud fra Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO). ACR blev støttet af et starttilskud fra Det Europæiske Råd (EFR).
1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
Imaris software | Bitplane | ||
Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
Workstation | Dell |