For å vise og kvantifisere de interne funksjonene i Candida albicans biofilms, forbereder vi faste intakte prøver som er avklart ved brytningsindeksmatching. Deretter kan optisk snitting mikroskopi brukes til å få tredimensjonale bildedata gjennom full tykkelse av biofilmen.
Den mikrobielle soppCandida albicans kan gjennomgå en endring fra commensal kolonisering til virulens som er sterkt korrelert med sin evne til å bytte fra gjær-form vekst til hyphal vekst. Celler som initierer denne prosessen blir tilhenger av overflater så vel som til hverandre, med den resulterende utviklingen av en biofilmkoloni. Dette forekommer vanligvis ikke bare på slimhinnevevoverflater i gjærinfeksjoner, men også på medisinske implantater som katetre. Det er velkjent at biofilmceller er resistente mot antifungale legemidler, og at celler som kaster seg fra biofilmen kan føre til farlige systemiske infeksjoner. Biofilms spenner fra tungt gjennomskinnelig til ugjennomsiktig på grunn av brytningsheterogenitet. Derfor er soppbiofilmer vanskelig å studere ved optisk mikroskopi. For å visualisere interne strukturelle, cellulære og subcellulære funksjoner, avklarer vi faste intakte biofilmer ved trinnvis løsemiddelutveksling til et punkt med optimal brytningsindeksmatching. For C. albicans biofilms oppnås tilstrekkelig avklaring med metylsalicylate (n = 1.537) for å muliggjøre konfokal mikroskopi fra toppunkt til base i 600 μm biofilms med liten dempering. I denne visualiseringsprotokollen skisserer vi fasekontrastrefraktomi, veksten av laboratoriebiofilmer, fiksering, farging, løsemiddelutveksling, oppsettet for konfokal fluorescensmikroskopi og representative resultater.
Candida albicans er en mikrobiell sopp som vanligvis er i samsvar med mennesker. Det er av grunnleggende interesse for biologer fordi organismen har flere morfologier. For eksempel, som svar på visse miljømessige signaler eller stressfaktorer, vil gjærdannende spirende celler bytte til filamentousvekst som septerende kjeder av svært langstrakte celler kjent som hyphae. Overgangen er viktig som et eksempel på fenotypisk uttrykk for en overgang mellom et encellulært og flercellet genuttrykksprogram. På samme måte er C. albicaner av biomedisinsk interesse fordi organismen er et velkjent opportunistisk patogen. Det er ansvarlig for slimhinnegjærinfeksjoner som trost (oral candidiasis), genitourinary infeksjoner, og en årsak til farlige invasive eller systemiske infeksjoner hos immunologisk svekkede pasienter.
Denne organismens potensial for virulens er nært knyttet til sine flere morftyper og andre aspekter av sin genetiske allsidighet1,2,3,4. Germ tube forlengelse, den første synlige fasen av overgangen til hyphal vekst, oppstår med tilstrekkelig hurtighet for å aktivere oppslukt C. albicans celler å bryte ut av phagocytes og dermed unnslippe en tidlig fase av cellulær immunrespons av verten5. I tillegg er filamentering innledes og ledsaget av en stor økning i celle-til-celle og celle-til-overflate-overholdelse som skyldes regulert uttrykk for flere klasser av celleveggproteiner kjent som adhesiner6,7,8,9. Under et bredt spekter av forhold resulterer kombinasjonen av etterlevelse og filamentering i et dramatisk skifte fra planktonisk, encellulær vekst til overflateassosiert kolonial vekst som danner en biofilm. C. albicans biofilms kan utvikle seg på vanlige implanterte medisinske enheter som venøse katetre. Disseminerte infeksjoner kan oppstå når slike biofilmer begynner å knoppav gjærdannende celler og kaste dem inn i sirkulerende blod. Flere studier har vist at biofilmceller er mer motstandsdyktige mot antifungale legemidler enn planktoniske celler10,11, som delvis kan skyldes senket metabolisme12. Videre kan den høye generelle overholdelsen av en biofilm gi forankring som trengs for effektiv invasiv vekst av hyphae i vertsvev1.
Optisk avklaring av C. albicans biofilms ved brytningsindeksmatching har hatt stor innvirkning på vår evne til å visualisere strukturen i dette mikrobielle samfunnet og oppdage relasjoner mellom genuttrykk og fenotype. Biofilms dyrket i laboratoriet på testflater under flytende kultur medium i 48 h vises som et hvitt belegg som er tett nok og tykk nok til å være ugjennomsiktig (Figur 1). Derfor er mange interessante fenotypic trekk ved biofilmen skjult for visning. De 24 h vill type biofilms dyrket i YPD, RPMI-1640, eller Spider medium på 37 °C rekkevidde opp til 300 μm tykk, med 48 h biofilms ofte nå 500 μm. Tettheten skyldes lysspredning, som oppstår fra brytningsheterogenitet: soppcelleveggen er mer brytning enn det omkringliggende mediet, og cytoplasma litt mer brytning enn celleveggen. Den resulterende høye optiske tettheten til en innfødt biofilm skjuler alle strukturer mer enn 30 μm dypt når de ses med et konvensjonelt mikroskop eller til og med en konfokal skanner (Figur 2). Imidlertid kan en stor grad av avklaring oppnås ved å infiltrere faste biofilmer med en høy brytningsindeksvæske som omtrent samsvarer med refraktivitet av store cellulære bestanddeler. Etter avklaring kan avbildning ved submikronoppløsning utføres ved konfokal mikroskopi gjennom hele tykkelsen på nesten alle C. albicans biofilm13. I villtypeprøver er det lett å se at biofilmer består av lang sammenfiltret hyphae, klynger av spirende gjærdannede celler eller pseudohyphalceller, tomrom og en viss mengde ekstracellulær matrise. Videre er biofilmer generelt stratifisert, viser romlig variant morfologiske forskjeller i celletype, celletetthet, og tilstedeværelsen av spirende eller forgreningceller. Mange variasjoner i en eller flere av disse funksjonene har blitt observert i biofilmer utviklet av mutant stammer14,15. I tillegg viser reporterstammer i situ romlige forskjeller i genuttrykk16,9,13. Den overraskende graden av avklaring oppnåelig med denne relativt enkle og rimelige tilnærmingen gjør det også mulig å se at mange biofilmer inkluderer apical hyphae og basal invasiv hyphae som strekker seg ut til millimeter avstander.
I denne visualiseringsprotokollen demonstrerer vi fiksering, merking, avklaring og avbildning av en C. albicans biofilm ved hjelp av en enkel celleveggmarkør som en flekk. Opprinnelsen til den nåværende versjonen av protokollen er den forbedrede klarheten vi observerte da formaldehyd-faste biofilmer ble infiltrert med 97% glykol metakrylat (GMA), som deretter ble polymerisert for å bygge inn biofilmen i en hard plast som hadde en moderat høy brytningsindeks (n = 1,49). Vi brukte deretter konvensjonell fasekontrastmikroskopi og en rekke brytningsindeksreferansevæsker for å bedre nøyaktig bestemme punktet for kontrastreversering (maksimal gjennomsiktighet) av biofilmen (Figur 3). For C. albicans biofilms dette skjedde nær n = 1.530, som var overraskende høy gitt at en tett protein struktur som hår keratin er bare litt mer brytning (1,54-1,55). Selv om det er på den øvre enden av det optimale området i figur 3, vi vedtok metylsalicylate (olje av wintergreen, n = 1.537) i dagens protokoll fordi det lenge har vært brukt som et avklarende middel for mikroskopi i embryologi og histologi, har den lav toksisitet og lavt damptrykk, og det ga gode resultater i våre forsøk ved hjelp av moderat-NA olje nedsenking optikk.
Fire poeng bør gjøres her:
(1) Med få unntak er den ideelle situasjonen i mikroskopi at refraktiv indeksen for prøven skal være lik brytningsindeksen for objektivlinsenedsenmmerjonsvæsken17,18,13. For tredimensjonale (3D) bildestudier der dyp fokusering er nødvendig, er dette alltid viktig.
(2) Vårt eksperimentelle resultat for optimal rydding (n = 1.525–1.535) er litt høyere enn standard nedsenkingoljer (n = 1.515, 1.518) og bryter derfor punkt (1), og introduserer dermed en kilde til sfærisk avvik ved bruk av standard oljenedsenkingoptikk. En løsning på dette problemet er bruk av et mål designet for en nedsenking indeks i høyere område. På grunn av en gjenoppblomstring av interesse for å forestille seg klarerte prøver, blir spesialmål med den nødvendige korreksjonen tilgjengelig. Den andre løsningen er å justere indeksen for det klargjørende mediet ned til 1,515 eller 1,518 ved å tilsetning av en liten mengde butanol (n = 1,399) for optimal oljenedsenking ytelse, og godta den litt forringet klarhet.
(3) Mikroskopi av intakte biofilmer (og andre prøver på denne skalaen) krever en betydelig arbeidsavstand for å imøtekomme prøvetykkelsen. Dette er en stor praktisk vurdering. En lang arbeidsavstand begrenser optikken til en moderat numerisk blenderåpning (NA = 0,6–1,25), som begrenser oppløsningen, men begrenser også alvorlighetsgraden av sfærisk avvik.
(4) Den optimale brytningsindeksen for avklaring kan være forskjellig for andre typer faste prøver. Prøver bør testes tilsvarende ved hjelp av fasekontrast og en rekke brytningsindeksreferansevæsker som vist i figur 3.
Fremskritt i fluorescensmikroskopi i optisk snitting, oppløsning, hastighet, unngåelse eller kompensasjon av avvik, flerkanals oppkjøp og i datakraft, har forårsaket en oppblomstring i avbildning intakte prøver. For faste prøver har både klassiske og nye avklarings- og utvidelsesmetoder hatt stor innvirkning19,20,21,22,23,24. I dette tilfellet brukte vi en rask og enkel løsningsmiddelbasert indeksmatchingstilnærming for å studere strukturen til soppbiofilmer som er sterkt gjennomsiktige for ugjennomsiktige.
De foregående protokollene er testet med en rekke prøver. I vårt laboratorium candida albicans biofilms er oftest dyrket på 14 mm firkanter kuttet fra et ark med medisinsk kvalitet silikon gummi (se Table of Materials). Denne substratum brukes fordi vekst på PDMS (poly-dimethylsiloxane) nedsenket i flytende kultur medium er etablert som en viktig in vitro modell for infeksjoner forbundet med medisinske implantater, spesielt iboende katetre. Stressede celler som starter filamenter holder seg raskt til ikke-polare overflater som PDMS. I praksis, brukte firkanter som har blitt rengjort og resterilisert i en autoklav (tørr syklus) gi de mest konsekvente biofilms for en bestemt belastning. Biofilms dyrkes også ofte på dekkbriller, i dekkeglassbunnskulturretter, i standard bakteriologiske polystyrenretter og på agar. Fordi C. albicans celler ikke holder seg godt til glass, bør dekkbriller behandles med et lectin som vil binde celleveggpolysakkarider. Vi bruker 40 μL av 1 mg/ml ConA eller WGA i sterilt vann på hver dekksklioverflate. Etter tørking behandles dekkbriller med 40 μL av 1% glutaraldehyd i 3 min for å krysskoble proteinet til en uoppløselig film. De vaskes deretter med sterilt destillert vann for å fjerne fikseringsmiddelet og eventuelle løselige lectin og lufttørket. Om nødvendig resteriliseres de behandlede dekkbrillene eller rettene på nytt under en germicidal UV-lampe i 10 min.
Prøvetykkelsen vil påvirke de nødvendige inkubasjonsperiodene i protokollene. Fixativ diffusjon i en 300 μm biofilm krever flere minutter å likevekt. Denne tidsperioden øker som kvadratet av prøvetykkelsen, og bør utvides til en time eller mer for svært tykke biofilmer eller agarblokkprøver som kan være 2–3 mm tykke. Likegyldighetsperioden for farging avhenger også av prøvetykkelsen som beskrevet for festing og utvasking. Men fordi lectins diffuserer saktere enn de lave MW fikseringene, spesielt i en agargel, bør flekker utvides over natten. Det samme bør gjøres for utvasking av overflødig flekk.
Flekker av ulike typer kan innlemmes i protokollene. Vi bruker en celleveggflekk for strukturell avbildning, oftest Calcofluor White M2R (Fluor. Brightener #28) eller en farget-merket lectin som ConA-Alexafluor 594 eller WGA-Alexafluor 594. Det bør tas hensyn til proteinets valency. ConA tetramer kan forårsake krysskobling av svært fleksibel hyphae i den apikale regionen i en biofilm. Dette er mindre tydelig med WGA dimer. De kanoniske spesifisitetene til disse markørene er Calcofluor for chitin, ConA for mannoserester, og WGA for N-acetyl-D-glukosamin og sialsyrerester.
Fordi løsningsmiddelutvekslingsprotokollen er gradert fra PBS eller vann, selv om metanol til metylsalisylat, må prøvebeholdere være løsemiddelbestandige. Metylsalicylate (MS) vil raskt myke polystyren plasttøy og sakte myke andre plast. Protokollen går opp til bruk av den pene metanol kan utføres i plasttøy, men på det tidspunktet i protokollen vi vanligvis bytte over til standard 20 ml glass scintillation hetteglass med løsemiddel-resistente skrue caps. Hetteglassene er praktiske for biofilmer på silikon firkantet substrata, fordi rutene kan plukkes opp og overføres ved hjelp av fine pinsett. Også et hetteglass kan dreneres og fylles med den flate firkanten hviler på den indre buede overflaten slik at biofilmen ikke kommer i kontakt med glasset. Substratumet skal være biofilm-up når det er nedsenket i det oppreist hetteglasset. Hetteglassene er utmerket for langsiktig prøvelagring.
I avklaringsprotokollen minimerer flere graderte løsemiddelutvekslingstrinn risikoen for prøvedeformasjon på grunn av oppløsningsvæskeblandingseffekter. For hastighet og bekvemmelighet i den grunnleggende protokollen, er det fire trinn: 1) trinn 3.3, PBS til 50:50 PBS:metanol; 2) trinn 3.4 og 3.5, PBS:metanol til ryddig metanol, 3) trinn 3.6, pen metanol til 50:50 metanol:MS; og 4) trinn 3.7 og 3.8, metanol: MS å ryddig MS. Metanol gir overgangsfeil. Men fordi vann og MS er nesten ublandbare, er det viktig at alt vann forskyves av metanol før innføringen av ms. På samme måte, fordi metanol er svært flyktig, er det viktig å fortrenge all metanol av MS ellers, fortsatte den fortsatte fortsatte fortsatte å forskyve all metanol av MS. Ellers fortsetter den fortsatte fortsatte fortsatte å forskyve sms. fordampning av restmetanol vil føre til brytningsindeksvariasjoner i prøven. I løpet av den fire trinns sekvens, gjenta andre og fjerde trinn ved å legge til en annen endring av ryddig løsemiddel, eller til og med en tredje endring, er tilrådelig. For spesielt skjøre prøver kan løsemiddelendringer formuleres i mindre prosenttrinn.
Med agarblokkprøver kan trinn 3,4 og 3,5 (pen metanol) forårsake utseendet av saltkrystaller i agaren på grunn av uoppløseligheten til gjenværende PBS-salter i metanol. Dette kan unngås ved hjelp av destillert vann (DW) i det første blandede løsemiddeltrinnet i stedet for PBS for å fortynne salter under vann:metanolutveksling. Den alternative løsemiddelutvekslingssekvensen for faste biofilmer består deretter av disse trinnene: 1) trinn 3.3, overføre prøven fra PBS til 50:50 DW:metanol (gi ekstra tid til diffusjon gjennom agar); 2) trinn 3.4, overføre prøven fra 50:50 DW:metanol til pen metanol (gjenta 2x med metanol som i trinn 3.5); 3) trinn 3.6, overføre prøven fra metanol til 50:50 metanol:metylsalicylate; og 4) trinn 3.7, overføre prøven fra 50:50 metanol:MS til ryddig MS (gjenta 2x med MS som i trinn 3.8).
Fordi metylsalisylat raskt myker polystyrenplastware, bruker vi en anodisert aluminiumsrett med en dekselglassbunn for å holde den avklarede biofilmen på scenen til et omvendt mikroskop. Dekkglasset holdes på plass ved hjelp av UV-herding optisk sement (Norland Optisk klebemiddel #61, se Materialtabellen). Forutsatt at MS fjernes på slutten av dagen ved å vaske parabolen med isopropanol etterfulgt av såpevann og sskylling, vil det sementerte dekkglasset tjene i mange måneder.
Objektivlinsevalg er kritisk viktig i storskala avbildning av avklarede prøver på grunn av viktigheten av å minimere sfærisk avvik og behovet for tilstrekkelig arbeidsavstand. Vi har erfaring med tre mål i disse studiene. I det inverterte mikroskopoppsettet bruker vi en lang arbeidsavstand, moderat numerisk blenderåpning (NA) objektiv olje nedsenket under dekkglasset med biofilmen nedsenket i metylsalisylat i parabolen over dekkglasset. Det meste av vårt arbeid er gjort med en Zeiss Universal-serien achromatisk mål, type 461708, 40x 0.85NA Oel 160/1.5, brukt med en negativ 160 mm brennviddeadapter for nominell uendelig konjugat (IC) kompatibilitet. Dette målet ble opprinnelig designet for oljenedsenket visning gjennom 1,5 mm mikroskoplysbilder med 0,35 mm arbeidsavstand25. Når arbeidsavstanden brukes med et standard dekselglass (0,17 mm), er arbeidsavstanden mye større: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1680 μm. Vi bruker også et nytt Zeiss multi-immersion mål, type 420852, 25x 0.8NA LD LCI Plan-apochromat med en arbeidsavstand som overstiger 540 μm, med nedsenking korreksjon satt til den høye siden av “olje”. Dette målet er svært korrigert og gir et ypperlig bilde. På et oppreist mikroskopstativ har vi brukt et nytt Nikon multi-nedsenkingmål, type MRD71120, 10x 0,5NA CFI Plan-apochromat med en arbeidsavstand som overstiger 5000 μm (5 mm), også med nedsenkingkorreksjonen satt til den høye siden av “olje” (n = 1.518). Selv om dette målet har en lavere NA enn de andre, har det fordelen av å være direkte uforsonlig i metylsalicylate.
For å optimalisere datainnsamling når det gjelder hastighet og oppløsning, bør konfokalmikroskopinnstillinger ideelt sett møte både tverrgående og aksial Nyquist prøvetakingstettheter18. Ved hjelp av konvensjonelle kriterier, sett konfokal pinhole diameter nominelt til 1 luftig enhet. I forstørrede koordinater,
dP (μm) = 1,22 x forstørrelse x (utslippsbølgelengde i μm) / NA
Tverrgående prøvetaking (pikselavstand) bør ikke overskride (1/2) x Abbes oppløsningsgrense. I objekt-plass koordinater,
x, y = (utslippsbølgelengde i nm) / (4 NA)
Aksial prøvetaking (fokusøkning) bør ikke overskride den inverse aksialbåndbredden,
z = (nedsenking indeks) x (utslipp bølgelengde i nm) / (NA2)
Det konfokale optiske systemet utvider båndbredden til mikroskopet og skjerper både tverrgående og aksial oppløsning med minst 1 /√2.
For 40x 0,85 NA-målet som vi bruker oftest, se tabell 1 for resultatene av disse formlene for en 600 nm utslippsbølgelengde (Alexa Fluor 594).
Formel | x 1/√2 | sett (typisk) | |
dP (μm) | 34,5 μm | – | 25 eller 50 μm |
x, y | 176 nm | 125 nm | 161 nm |
z (Andre) | 1200 nm | 848 nm (andre kan være på samme tid) | 900 nm (andre kan være på) |
Tabell 1: Konfokal pinhole diameter, tverrgående prøvetaking og aksiale prøvetakingsverdier for en 600 nm utslippsbølgelengde.
Ved hjelp av en konfokal skanner med spinningdisk med disse innstillingene og et skannefelt på 1392 x 1040 piksler, kan data fra biofilmprøver anskaffes med rimelig hastighet og oppløsning. Typiske 3D-bildestabler med én farge kjører 0,35–1,55 GB.
Avklaringsmedier i bred bruk spenner over et betydelig brytningsindeksområde. Ved darkfield belysning og visuell inspeksjon fant vi at faste C. albicans biofilms var mest gjennomsiktig over n = 1.5. Dette ble raffinert etter fasekontrastmikroskopi til n = 1.530–1.535. Av en rekke praktiske årsaker bruker vi metylsalisylat (n = 1.537) som det endelige indeksmatchende løsningsmiddelet. Selv om løsemiddelutveksling medfører risiko for prøvedeformasjon eller andre artefakter, har celler i faste, avklarede prøver lignende cellekroppsdimensjoner, hyphadiameter og interseptelle lengdedimensjoner som levende prøver.
Mange variasjoner i løsemiddelutvekslingsprosessen er mulig (f.eks. ved hjelp av et annet overgangsløsningsmiddel eller et annet endelig løsningsmiddel). Metanol ble valgt for sin høye polaritet og rask diffusjon, men etanol ble vist å bedre bevare rødt fluorescerende protein (RFP) quantum yield26 som et overgangsløsningsmiddel. Metylsalicylate ble valgt for sin indeks, moderat polaritet, lavt damptrykk og kompatibilitet med mange flekker, fargestoffer og fluorescerende proteiner. Imidlertid kan et endelig løsningsmiddel med litt lavere indeks, eller en blanding av metylsalisylat og et lavere indeksløsningsmiddel, som butanol, tjene bedre.
Uventet avslører evnen til å se gjennom en biofilm ikke bare sine stratifiserte interne egenskaper, men også hjelpemidler i å se opprinnelsen til utvidede strukturer som lange, uomviklede apical hyphae og invasive basal hyphae på visse substrata. Opportunistisk virulens i C. albicans avhenger av dens genetiske allsidighet (dvs. overgang til hyphalvekst, upregulering av cellesubstratum og cellecelleoverholdelse, generering av osmolyte for cellespirende og forlengelse, og bruk av alternative næringsstoffer). Hyphal forlengelse muliggjør breakout av individuelle C. albicans celler fra fagocytiske immunceller, men er også avgjørende for invasjon. Biofilmvedhesjon og hyphalforvikling ser ut til å gi overflateforankring som trengs for hyphae å effektivt invadere et substratum. Når det substratet er vertsvev, kan økt virulens resultat.
Imaging intakt biofilms muliggjør et stort antall informative eksperimenter ved hjelp av reporter stammer for genuttrykk, modell vev substrata, og inkludering av andre organismer som bakterier som finnes i naturlige biofilms. Selv i det enkleste tilfellet av rent strukturell avbildning med en celleveggflekk, avsløres in situ fenotyper som da kan kvantifiseres og genetisk analyseres.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble delvis støttet av NIH tilskudd R01 AI067703, R21 AI100270, og R21 AI135178 til A.P. Mitchell. Forfatterne er takknemlige for Greenfield ‘Kip’ Sluder for å gi den lange arbeidsdistanseoljenedsenking målet som brukes i dette arbeidet, og til Daniel Shiwarski for konfokal mikroskopi med direkte metylsalicylate nedsenking.
Biohazardous waste receptacle | |||
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
Distilled water | DW | ||
Distilled water, sterile | |||
Ethanol, absolute | EtOH | ||
Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
Fixative waste bottle in secondary containment | |||
Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
Fume hood | |||
Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
Methanol 99.9% | MeOH | ||
Methyl salicylate 99% | MS | ||
Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
Orbital mixer, benchtop | |||
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
Solvent waste bottle in secondary containment | |||
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |