Summary

基于 TurboID 的接近标签,用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别

Published: May 17, 2020
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Summary

这里描述的是一种接近标记方法,用于识别尼科蒂亚娜本查米亚叶组织中NLR免疫受体的TIR域的相互作用伙伴。还提供了一个详细的协议,用于识别其他感兴趣的蛋白质之间的相互作用使用这种技术在尼科蒂亚纳和其他植物物种。

Abstract

使用工程抗坏血球过氧化物酶(APEX)或大肠杆菌生物丁加体比拉(称为BioID)的接近标记(PL)技术已成功用于识别哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。然而,基于APEX的PL对过氧化氢(H2O2)的要求、生物素(16~24小时)的孵育时间较长,以及基于BioID的PL的孵育温度(37°C)较高,严重限制了其在植物中的应用。最近描述的基于 TurboID 的 PL 解决了 BioID 和 APEX 的许多限制。TurboID 允许在室温 (RT) 条件下只需 10 分钟即可快速贴贴蛋白质标签。尽管 TurboID 的效用已在动物模型中得到证明,但我们最近发现,与 BioID 相比,基于 TurboID 的 PL 在植物中性能更好,用于标记接近感兴趣的蛋白质的蛋白质。此处提供了一个分步协议,用于使用核苷酸结合白氨酸富一种重复(NLR)蛋白质系列的N端收费/微素-1受体(TIR)域作为模型来识别蛋白质相互作用伙伴。该方法通过亲和力纯化,描述了生物微化蛋白的载体构造、蛋白质表达结构的农业渗透、生物结合处理、蛋白质提取和脱盐、定量和富集。这里描述的协议可以很容易地适应研究尼科蒂亚纳和其他植物物种感兴趣的其他蛋白质。

Introduction

PPI 是各种细胞过程的基础。识别PPI的传统方法包括酵母-双杂交(Y2H)筛查和免疫沉淀,加上质谱(IP-MS)1。1然而,两者都面临一些缺点。例如,Y2H 筛查要求提供目标植物或动物物种的 Y2H 库。这些图书馆的建设是劳动密集型和昂贵的。此外,Y2H方法在异质单细胞真核生物酵母中执行,这可能不代表高真核细胞的细胞状态。

相比之下,IP-MS在捕获瞬态或弱PPI方面效率较低,也不适合低丰度或高水性的蛋白质。植物信号通路中涉及的许多重要蛋白质,如受体状激酶(RLKs)或NLR系列免疫受体以低水平表达,并经常与其他蛋白质短暂相互作用。因此,它极大地限制了对这些蛋白质调节机制的理解。

最近,基于工程抗坏血球过氧化物酶(APEX)和突变大肠杆菌生物丁加体酶比拉R118G(称为BioID)的接近标记(PL)方法已经开发和用于PPIs2,3,4的研究。2,3,4PL的原理是,感兴趣的目标蛋白与酶融合,酶催化了生物仿生-AMP(生物-AMP)的形成。这些自由生物AMP由PL酶释放,并扩散到目标蛋白附近,允许在估计半径为10 nm5的初级胺处对近端蛋白进行生物微化。

与传统 Y2H 和 IP-MS 方法相比,此方法具有显著优势,例如捕获瞬态或弱 PPI 的能力。此外,PL 允许在其原生细胞环境中标记目标蛋白的近端蛋白。不同的PL酶在应用于不同的系统时有独特的缺点。例如,虽然APEX提供比BioID更高的标记动力学,并成功地应用于哺乳动物系统,但这种方法对过氧化氢(H2O2)的要求使其不适合植物的PL研究。

相反,基于 BioID 的 PL 避免了使用有毒的 H2O2,但标记速度很慢(需要 18-24 h 才能完成生物小化),从而使暂时性 PPI 的捕获效率降低。此外,BioID 高效PL所需的较高孵育温度(37 °C)给一些生物体(如植物4)带来了外部压力。7,8,因此,据报告,,在植物(即水稻原发体、阿拉比多普西北本查米亚纳)中有限地部署基于BioID的PL。最近描述的TurboID酶克服了APEX和基于BioID的PL的不足,TurboID表现出高活性,使PL在RT10的10分钟内达到。基于TurboID的PL已成功应用于哺乳动物细胞、苍蝇和蠕虫10。最近,我们和其他研究小组独立优化和扩展了基于TurboID的PL用于研究不同植物系统中的PPI,包括N.本查米亚和阿拉迪多普西植物和番茄毛根11,12,13,14。11,12,13,14比较分析表明,与BioID11、14相比,TurboID14在植物中的PL性能更好。它还通过识别一些与NLR免疫受体11的新相互作用来证明基于TurboID的PL在植物中的鲁棒性,NLR免疫受体11是一种蛋白质,其相互作用伙伴通常很难用传统方法获得。

该协议通过描述N.本查米亚纳植物中NLR免疫受体的N端TIR域的相互作用蛋白的识别,从而说明了植物中基于TurboID的PL。该方法可以扩展到任何感兴趣的蛋白质在N.本查米亚纳。更重要的是,它为调查其他植物物种(如阿拉伯、番茄和其他)的PPI提供了重要参考。

Protocol

注: 方法的概述如图1所示。 1. 植物材料制备 在潮湿的土壤中高密度地生长N.本查米亚纳种子,并在16小时光(约75μmol/m2s)和8小时暗光周期在23~25°C的气候室中保持。 大约1周后,小心地将每只幼苗转移到4’x 4’盆中,并将幼苗放在同一室。 保持在室内的植物约4周,直到它们成长为4-8的叶子阶段,为随后的?…

Representative Results

代表数据,说明基于所述协议的预期结果,改编自张等人11。图 1总结了在 N. benthamiana中执行基于 TurboID 的 PL 的过程。图2显示了渗透的N.本查米亚纳叶中的蛋白质表达和生物微化。图3显示,渗透叶片中的生物微化蛋白质有效富集,用于后续质谱分析。需要注意的是,使用链球菌-C1偶联磁珠浓缩生物?…

Discussion

TurboID生物体蛋白连体酶是由基于酵母的基于酵母的定向进化产生的BioID10。它比其他PL酶有许多优点。TurboID 允许 PL 应用于其他模型系统,包括苍蝇和蠕虫,其最佳生长温度约为 25°C10。虽然PL方法在动物系统中得到了广泛的应用,但在植物中的应用是有限的。此处描述的协议为在N.benthamiana建立基于TurboID的PL提供了一个分步程序,该示范植物已广泛应用于?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了国家转基因科学技术计划(2019ZX080-003至Y.Z.)、中国国家自然科学基金(31872637至Y.Z.)和中央大学基础研究基金(2019TC028至Y.Z.)和NSF-IOS-1354434的资助, NSF-IOS-1339185 和 NIH-GM132582-01 到 S.P.D.K.

Materials

721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

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Cite This Article
Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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