TurboID-baseret nærhed mærkning for I Planta Identifikation af Protein-Protein Interaction Networks
Summary
Beskrevet her er en nærhed mærkning metode til identifikation af interaktion partnere tir domæne NLR immunreceptoren i Nicotiana benthamiana bladvæv. Der findes også en detaljeret protokol til identifikation af interaktioner mellem andre proteiner af interesse ved hjælp af denne teknik i Nicotiana og andre plantearter.
Abstract
Nærhedsmærkningsteknikker (PL) ved hjælp af manipuleret ascorbatperoxidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kendt som BioID) er med succes blevet anvendt til identifikation af proteinproteininteraktioner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoxid (H2O2) i APEX-baseret PL, længere inkubationstid med biotin (16-24 timer) og højere inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baseret PL begrænser imidlertid i alvorlig grad deres anvendelse i planter. Den nyligt beskrevne TurboID-baserede PL adresser mange begrænsninger af BioID og APEX. TurboID giver mulighed for hurtig nærhed mærkning af proteiner på bare 10 min under stuetemperatur (RT) betingelser. Selv om nytten af TurboID er blevet påvist i dyremodeller, vi for nylig viste, at TurboID-baserede PL klarer sig bedre i planter i forhold til BioID for mærkning af proteiner, der er proksimale til et protein af interesse. Forudsat her er en trin-for-trin protokol til identifikation af protein interaktion partnere ved hjælp af N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domæne af nukleotid-bindende leucin-rige gentage (NLR) protein familie som model. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration af proteinekspressionskonstruktioner, biotinbehandling, proteinekstraktion og afsaltning, kvantificering og berigelse af de biotinyterede proteiner ved affinitetsrensning. Den protokol, der er beskrevet her, kan let tilpasses til at studere andre proteiner af interesse i Nicotiana og andre plantearter.
Introduction
PPI er grundlaget for forskellige cellulære processer. Traditionelle metoder til identifikation af PPI omfatter gær-to-hybrid (Y2H) screening og immunudfældning kombineret med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider under nogle ulemper. For eksempel kræver Y2H screening tilgængeligheden af Y2H bibliotek af målet plante eller dyrearter. Opførelsen af disse biblioteker er arbejdskrævende og dyrt. Desuden udføres Y2H-metoden i den heterologe eukaryote organismegær med en enkelt celle, som muligvis ikke repræsenterer den cellulære status for højere eukaryote celler.
I modsætning hertil viser IP-MS lav effektivitet i indfangning af forbigående eller svage PPI, og det er også uegnet til de proteiner med lav overflod eller høj hydrofobitet. Mange vigtige proteiner involveret i planten signalering veje såsom receptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familie af immunreceptorer udtrykkes på lave niveauer og ofte interagere med andre proteiner forbigående. Derfor begrænser det i høj grad forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af disse proteiner.
For nylig, nærhed mærkning (PL) metoder baseret på manipuleret ascorbat peroxidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kendt som BioID) er blevet udviklet og udnyttet til studiet af PPI2,3,4. Princippet i PL er, at et målprotein af interesse er sammensmeltet med et enzym, som katalyserer dannelsen af labilbiotinyl-AMP (bio-AMP). Disse frie bio-AMP frigives af PL enzymer og diffuse til nærheden af målet protein, så biotinylation af proksimale proteiner på de primære aminer inden for en anslået radius på 10 nm5.
Denne tilgang har betydelige fordele i forhold til de traditionelle Y2H- og IP-MS-tilgange, såsom evnen til at fange forbigående eller svage PPI. Desuden tillader PL mærkning af proksimale proteiner af målproteinet i deres oprindelige cellulære miljøer. Forskellige PL enzymer har unikke ulemper, når de anvender dem til forskellige systemer. Selv om APEX tilbyder højere tagging kinetik sammenlignet med BioID og anvendes med succes i pattedyrsystemer, gør kravet om giftig hydrogenperoxid (H2O2)i denne metode det uegnet til PL-undersøgelser i planter.
I modsætning hertil undgår BioID-baseret PL brugen af den giftige H2O2, men mærkningshastigheden er langsom (kræver 18-24 h for at fuldføre biotinylation), hvilket gør indfangningen af forbigående PPI mindre effektiv. Desuden medfører den højere inkubationstemperatur (37 °C), der kræves for effektiv PL ved BioID, ekstern stress for nogle organismer, såsom planter4. Der er derfor rapporteret om begrænset udbredelse af BioID-baseret PL i planter (dvs. risprotoplasts, Arabidopsis og N. benthamiana) 6,7,8,9. Den nyligt beskrevne TurboID enzym overvinder manglerne ved APEX og BioID-baserede PL. TurboID viste høj aktivitet, der gør det muligt at realiseringen af PL inden for 10 min på RT10. TurboID-baserede PL er blevet anvendt med succes i pattedyr celler, fluer, og orme10. For nylig har vi og andre forskningsgrupper uafhængigt optimeret og udvidet brugen af TurboID-baserede PL til at studere PPI i forskellige plantesystemer, herunder N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat behårede rødder11,,12,13,14. Sammenlignende analyser viste , at TurboID klarer sig bedre for PL i planter sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheden af TurboID-baseret PL i planta ved at identificere en række nye interaktioner med en NLR immunreceptor11, et protein, hvis interaktionspartnere normalt er vanskelige at opnå ved hjælp af traditionelle metoder.
Denne protokol illustrerer det TurboID-baserede PL i planta ved at beskrive identifikationen af interaktionsproteiner i NLR-immunreceptorens N-terminal-tir-domæne i N. benthamianaplanter. Metoden kan udvides til at omfatte proteiner af interesse i N. benthamiana. Endnu vigtigere, det giver en vigtig reference til at undersøge PPI i andre plantearter såsom Arabidopsis, tomat, og andre.
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboID biotin ligase genereres af gær display-baseret rettet udvikling af BioID10. Det har mange fordele i forhold til andre PL enzymer. TurboID tillader anvendelse af PL til andre modelsystemer, herunder fluer og orme, hvis optimale væksttemperatur er omkring 25 °C10. Selv om PL-metoden har været udbredt i dyresystemer, er dens anvendelse i planter begrænset. Den protokol, der er beskrevet her, giver en trinvis procedure for oprettelse af TurboID-baserede PL i N….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
