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Immunology and Infection

基于 TurboID 的接近标签,用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别

doi: 10.3791/60728 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

这里描述的是一种接近标记方法,用于识别尼科蒂亚娜本查米亚叶组织中NLR免疫受体的TIR域的相互作用伙伴。还提供了一个详细的协议,用于识别其他感兴趣的蛋白质之间的相互作用使用这种技术在尼科蒂亚纳和其他植物物种。

Abstract

使用工程抗坏血球过氧化物酶(APEX)或大肠杆菌生物丁加体比拉(称为BioID)的接近标记(PL)技术已成功用于识别哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。然而,基于APEX的PL对过氧化氢(H2O2)的要求、生物素(16~24小时)的孵育时间较长,以及基于BioID的PL的孵育温度(37°C)较高,严重限制了其在植物中的应用。最近描述的基于 TurboID 的 PL 解决了 BioID 和 APEX 的许多限制。TurboID 允许在室温 (RT) 条件下只需 10 分钟即可快速贴贴蛋白质标签。尽管 TurboID 的效用已在动物模型中得到证明,但我们最近发现,与 BioID 相比,基于 TurboID 的 PL 在植物中性能更好,用于标记接近感兴趣的蛋白质的蛋白质。此处提供了一个分步协议,用于使用核苷酸结合白氨酸富一种重复(NLR)蛋白质系列的N端收费/微素-1受体(TIR)域作为模型来识别蛋白质相互作用伙伴。该方法通过亲和力纯化,描述了生物微化蛋白的载体构造、蛋白质表达结构的农业渗透、生物结合处理、蛋白质提取和脱盐、定量和富集。这里描述的协议可以很容易地适应研究尼科蒂亚纳和其他植物物种感兴趣的其他蛋白质。

Introduction

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PPI 是各种细胞过程的基础。识别PPI的传统方法包括酵母-双杂交(Y2H)筛查和免疫沉淀,加上质谱(IP-MS)1。1然而,两者都面临一些缺点。例如,Y2H 筛查要求提供目标植物或动物物种的 Y2H 库。这些图书馆的建设是劳动密集型和昂贵的。此外,Y2H方法在异质单细胞真核生物酵母中执行,这可能不代表高真核细胞的细胞状态。

相比之下,IP-MS在捕获瞬态或弱PPI方面效率较低,也不适合低丰度或高水性的蛋白质。植物信号通路中涉及的许多重要蛋白质,如受体状激酶(RLKs)或NLR系列免疫受体以低水平表达,并经常与其他蛋白质短暂相互作用。因此,它极大地限制了对这些蛋白质调节机制的理解。

最近,基于工程抗坏血球过氧化物酶(APEX)和突变大肠杆菌生物丁加体酶比拉R118G(称为BioID)的接近标记(PL)方法已经开发和用于PPIs2,3,4的研究。2,3,4PL的原理是,感兴趣的目标蛋白与酶融合,酶催化了生物仿生-AMP(生物-AMP)的形成。这些自由生物AMP由PL酶释放,并扩散到目标蛋白附近,允许在估计半径为10 nm5的初级胺处对近端蛋白进行生物微化。

与传统 Y2H 和 IP-MS 方法相比,此方法具有显著优势,例如捕获瞬态或弱 PPI 的能力。此外,PL 允许在其原生细胞环境中标记目标蛋白的近端蛋白。不同的PL酶在应用于不同的系统时有独特的缺点。例如,虽然APEX提供比BioID更高的标记动力学,并成功地应用于哺乳动物系统,但这种方法对过氧化氢(H2O2)的要求使其不适合植物的PL研究。

相反,基于 BioID 的 PL 避免了使用有毒的 H2O2,但标记速度很慢(需要 18-24 h 才能完成生物小化),从而使暂时性 PPI 的捕获效率降低。此外,BioID 高效PL所需的较高孵育温度(37 °C)给一些生物体(如植物4)带来了外部压力。7,8,因此,据报告,,在植物(即水稻原发体、阿拉比多普西北本查米亚纳)中有限地部署基于BioID的PL。最近描述的TurboID酶克服了APEX和基于BioID的PL的不足,TurboID表现出高活性,使PL在RT10的10分钟内达到。基于TurboID的PL已成功应用于哺乳动物细胞、苍蝇和蠕虫10。最近,我们和其他研究小组独立优化和扩展了基于TurboID的PL用于研究不同植物系统中的PPI,包括N.本查米亚和阿拉迪多普西植物和番茄毛根11,12,13,14。11,12,13,14比较分析表明,与BioID11、14相比,TurboID14在植物中的PL性能更好。它还通过识别一些与NLR免疫受体11的新相互作用来证明基于TurboID的PL在植物中的鲁棒性,NLR免疫受体11是一种蛋白质,其相互作用伙伴通常很难用传统方法获得。

该协议通过描述N.本查米亚纳植物中NLR免疫受体的N端TIR域的相互作用蛋白的识别,从而说明了植物中基于TurboID的PL。该方法可以扩展到任何感兴趣的蛋白质在N.本查米亚纳。更重要的是,它为调查其他植物物种(如阿拉伯、番茄和其他)的PPI提供了重要参考。

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Protocol

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注: 方法的概述如图1所示。

1. 植物材料制备

  1. 在潮湿的土壤中高密度地生长N.本查米亚纳种子,并在16小时光(约75μmol/m2s)和8小时暗光周期在23~25°C的气候室中保持。
  2. 大约1周后,小心地将每只幼苗转移到4'x 4'盆中,并将幼苗放在同一室。
  3. 保持在室内的植物约4周,直到它们成长为4-8的叶子阶段,为随后的农业渗透15。

2. 建造涡轮ID融合

  1. 使用标准分子克隆技术生成目标蛋白与 TurboID (PCR TurboID 从添加基因质粒#107177) 的融合。在这里,我们使用NLR免疫受体的N终端TIR域作为感兴趣的目标蛋白,并在花椰菜马赛克病毒35S促进剂(p35S:TIR-TurboID)的控制下构建了TIR熔融到TurboID。
    注:将 TurboID 酶与目标蛋白的卡博基-终点或氨基内因融合将取决于感兴趣的蛋白质。通常,对于细胞质蛋白,只要TurboID融合不影响目标蛋白的功能,两种终点应该是可以接受的。然而,对于膜局部蛋白,在确定哪种终点体最适合 TurboID 融合之前,应提前确定蛋白质拓扑的特征。
  2. 在同一启动器下构建一个 TurboID 融合的仙音,作为后续定量蛋白体分析的控制。
    注:构建一个 TurboID 控件以识别与目标蛋白的蛋白近端非常重要。TurboID 融合控制应显示与 TurboID 融合目标蛋白类似的表达水平。这可以通过调整农业渗透过程中的农业细菌浓度来根据经验确定。此外,控制蛋白具有类似于目标蛋白的亚细胞定位模式也是很重要的。

3. 农业渗透

  1. 质粒向农业细菌的转化
    1. 加入0.5 μg的质粒产生从步骤2.1和2.2至50μL的农业细菌乳酸菌株GV3101能力细胞,制备如下所述的16。
      注:其他农业细菌菌株,如GV2260,也可以使用。
    2. 在冰上孵育30分钟。
    3. 在 42 °C 的 42°C 下水浴中加热冲击,温度为 60 s。
    4. 将400μL的LB介质(10克/升试管酮,5克/升酵母提取物,和10克/升NaCl;pH = 7.0)添加到农业细菌中,并在28°C孵育90分钟。
    5. 在LB agar上的管中盘整片,辅以适当的抗生素来选择质粒,以及用于农业细菌(GV3101:50毫克/L根卡霉素和50毫克/L里福霉素)。
    6. 在28°C下孵育板,36~48小时,直到个别菌落可见。
  2. 用抗生素将几个单独的菌落挑到新鲜的LB agar盘上(参见步骤3.1.5),并在28°C下过夜生长。
    注:执行菌落PCR以确认农业细菌中特定二元结构的存在更为最佳。根据我们的经验,超过95%的殖民地包含引入的二进制构造。
  3. 接种3 mL的LB介质加上适当的抗生素(见步骤3.1.4),其中含有感兴趣的构造,并在28°C过夜摇动,直到农细菌培养的OD600达到2.0。
  4. 将细胞在 3,000 x g下离心,并在农业渗透缓冲液(10 mM MgCl2、10mM MES [pH = 5.6]、250 μM 乙酰痛酮)中重新悬浮到 OD600 = 1.0。
    注:虽然在农业渗透之前在RT孵育2小时是最佳选择,但根据我们在GV3101菌株方面的经验,目标蛋白表达与无孵育之间并没有太大差异。
  5. 使用 1 mL 无针注射器在完全成熟的N. benthamiana 叶(轴旁)表皮中渗透。
    注:为三种生物复制准备足够数量的叶子材料:整个叶子通常被渗透,每株三片叶子被渗透,每个植物使用三到四株植物。对于每片叶子,1.5~2.0 mL重新悬浮的农细菌就足够了。
  6. 在36小时渗透后(hpi)后,将200μM生物素(在10 mM MgCl2溶液中)渗透到预渗透与TurboID结构的叶子中。
  7. 如第4节所述,在收获叶组织之前,将植物保持3~12小时。
    注:选择36 hpi用于生物tin渗透的原因是,根据以前的研究11,目标蛋白表达在这个时间点达到峰值。建议确定最佳表达感兴趣的目标蛋白所需的时间。生物蛋白渗透后的孵育时间取决于实验设计和研究中的目标蛋白。通常,3-12 h 的生物结合处理允许通过 TurboID 聚变标记大多数接近目标蛋白的蛋白质。

4. 叶样本收集

注:对于叶样品的后续处理,要戴上无菌手套,以避免样品的角蛋白污染。所有试剂也应尽可能不含角蛋白。

  1. 切掉小叶底部的渗入叶,取出叶静脉,然后用液氮对叶组织进行闪冻。
  2. 使用虫子和砂浆研磨叶组织,并将叶粉储存在15 mL或50mL猎鹰管中,温度为-80°C,以便随后使用。
    注:从不同植物的三种生物复制器中,每片叶子取三到四片。协议可以在这里暂停。在后续步骤之前,建议通过免疫布洛特分析评估目标蛋白的蛋白质表达和生物微化。典型的西方印迹如图2所示。

5. 提取叶总蛋白

  1. 将约0.35克叶粉转移到2 mL管。为每个样品准备两个管。
    注意:接触用液氮冷却的任何物体时,请戴上手套。
  2. 加入 RIPA 裂裂液缓冲液 700 μL(50 mM 三分-HCl [pH = 7.5], 500 mM NaCl,1 mM EDTA,1% NP40 [v/v],0.1% SDS [w/v],0.5% 脱氧酸钠 [w/v],1 mM DTT,1 片蛋白酶抑制剂鸡尾酒)到 0.35 克叶粉。
  3. 将管子旋涡10分钟。
  4. 将样品放在冰上 30 分钟。
  5. 每 4-5 分钟混合一次,将管子倒置几次。

6. 通过脱盐去除游离生物群

注:此部分大约需要 50 分钟。

  1. 平衡脱盐列。
    1. 拆下脱盐柱底部的消减器,将该柱置于 50 mL 管中。
    2. 在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟,将存储溶液拆下,并确保盖子松开。
    3. 将脱盐柱放入 50 mL 管中。用 5 mL RIPA 裂裂液缓冲液对柱 3x 进行平衡,每次在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟,并丢弃流通。
    4. 将脱盐柱转移到新的 50 mL 管中,并暂时储存在 4 °C 下,以便随后使用。
  2. 从步骤 5.4 旋转管在 16,500 x g和 4 °C 10 分钟,并将上清液从两个管转移到一个新的 2 mL 管。
  3. 将1,500 μL的蛋白质提取物添加到平衡脱盐柱树脂的顶部(从步骤6.1.4起)。当蛋白质提取物进入树脂时,再加入100μL的RIPA裂解缓冲液。
    注:虽然1,400μL的RIPA裂解缓冲液用于从叶子中提取蛋白质,但蛋白质提取和脱盐后的总体积总是比原始体积在一定程度上增加。因此,步骤 5.1 和 5.4 中描述的每个组样本的组合可为每个样品至少产生 1,500 μL 的蛋白质提取物。
  4. 在 1000 x g和 4 °C 下离心 2 分钟,将脱盐样品暂时留在冰上。

7. 使用布拉德福德测定对脱盐蛋白提取物的定量

  1. 制备每个梯度BSA溶液的50μL:0毫克/mL、0.2毫克/米拉、0.4毫克/米拉、0.6毫克/米拉、0.8毫克/米拉和1毫克/米拉。
  2. 将5μL样品与45μL的ddH2O混合,稀释脱盐蛋白提取物。
  3. 通过稀释 5x 布拉德福德原石(100 毫克库马西亮蓝色 G250,47 mL 甲醇,100 mL 85% 磷酸,53 mL ddH2O)制备 1x 布拉德福德摄政。
  4. 将每个梯度BSA溶液的50μL和50μL的稀释蛋白提取物添加到1x布拉德福德晶丽的2.5 mL中。
  5. 在RT孵育10分钟。
  6. 将每个样品的200μL溶液添加到ELISA板的一口井中(每个样品有三个技术复制)。
  7. 使用微孔板读取器测量 OD595。
  8. 根据梯度BSA溶液的值绘制标准曲线,并计算脱盐蛋白样品的浓度。通常,从0.7克叶子中获得的总蛋白质浓度在3~6毫克/米拉之间。
  9. 准备6~8毫克脱盐蛋白提取物,进行后续亲和力纯化。

8. 生物微量蛋白质的富集

  1. 将 200 μL 链球菌-C1 偶联磁珠放入 2 mL 管中。
  2. 在 RT 下,将链球菌-C1 偶联磁珠与 1 mL RIPA 裂裂缓冲液进行平衡 1 分钟。
  3. 每次清洗后,使用磁性架吸附珠 3 分钟,并通过移液轻轻去除溶液。
  4. 重复步骤 8.2 和 8.3。
  5. 将脱盐蛋白提取物转移到平衡链球菌-C1偶联磁珠。
  6. 在旋转器上以4°C孵育管12小时(或过夜),以亲和-纯化生物微化蛋白质。
  7. 在 RT 处将磁架上的珠子捕获 4 分钟,直到磁珠在管的一侧聚集,然后通过移液器轻轻去除上清液。
  8. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 I(水中 2% SDS)添加到管中,并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。 重复步骤 8.3。
  9. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 II(50 mM HEPES:pH = 7.5,500 mM NaCl,1 mM EDTA,0.1% 脱氧胆酸 [w/v],1% Triton X-100)添加到管中,并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。
  10. 将 1.7 mL 的洗涤缓冲液 III(10 mM Tris-HCl:pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1% 脱氧胆酸 [w/v]、1% NP40 [v/v])添加到管中,并将其保持在 RT 的旋转器上 8 分钟。 重复步骤 8.3。
  11. 加入 1.7 mL 的 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) 去除洗涤剂,然后重复步骤 8.3。
  12. 将珠子转移到新的 1.5 mL 管中,重复步骤 8.11 和 8.3。
  13. 在 RT 上用 50 mM 碳酸氢铵缓冲液将珠子洗涤 6x 5 分钟。
  14. 在磁珠中加入1 mL的50mM铵碳酸氢盐缓冲液,搅拌均匀。
  15. 去除100μL的珠子进行免疫斑点分析,以确认生物微量蛋白的富集。图3显示了典型的西方污点。
  16. 将其余蛋白质样品进行闪光冷冻,并储存在-80°C,或立即将其送去,用于干冰上的LC-MS/MS分析。
    注:典型 MS 结果显示在上一出版物中(张等人 2019 年;图 2、补充数据 1 和补充数据 2)11。使用标识符:MSV000083018 和 MSV000083019,在 MassIVE 上提供整个数据集(见于 )。

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Representative Results

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代表数据,说明基于所述协议的预期结果,改编自张等人11。图 1总结了在 N. benthamiana中执行基于 TurboID 的 PL 的过程。图2显示了渗透的N.本查米亚纳叶中的蛋白质表达和生物微化。图3显示,渗透叶片中的生物微化蛋白质有效富集,用于后续质谱分析。需要注意的是,使用链球菌-C1偶联磁珠浓缩生物微化蛋白后,捕获了不同大小的蛋白质,对富蛋白的西方斑点分析显示了涂片带(图3)。最近发表的几项研究676、7、13、1413,14也发表了类似的研究。,

Figure 1
图1:本查米亚纳基于 TurboID 的 PL 方法概述。藏有TurboID融合结构的农业细菌被渗透到本查米亚纳岛。36 h 渗透后,200μM生物群蛋白被渗透到相同的叶子中,以启动与 TurboID 融合目标蛋白接近的内源蛋白的生物微化。然后,被渗透的植物在RT孵育3~12小时,然后进行叶子收获和液氮研磨。叶粉在RIPA裂解缓冲液中裂解,使用脱盐柱去除蛋白质提取物中的游自由生物类。生物微化蛋白然后与链球菌结合珠进行亲和纯化,并通过质谱鉴定。这个数字是从张等人11号补充图3中改编的。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:步骤4.2中蛋白质提取物的免疫布洛分析。A) 西方斑点分析从农业渗透的叶子中提取的蛋白质,用抗体对抗HA标签。(B) 西式斑点分析,用链球菌-HRP 在农业渗透的叶子中生物微化蛋白质。这个数字是从张等人11号补充图6B中改编的。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3:步骤8.15中获得的珠子的西方斑点分析,以确认生物微量蛋白的富集。对于每个构造,有三个独立的复制(1、2 和 3)。链球菌-HRP用于分析不同样品中的生物微化蛋白质。这个数字是从张等人11号补充图7中改编的。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

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TurboID生物体蛋白连体酶是由基于酵母的基于酵母的定向进化产生的BioID10。它比其他PL酶有许多优点。TurboID 允许 PL 应用于其他模型系统,包括苍蝇和蠕虫,其最佳生长温度约为 25°C10。虽然PL方法在动物系统中得到了广泛的应用,但在植物中的应用是有限的。此处描述的协议为在N.benthamiana建立基于TurboID的PL提供了一个分步程序,该示范植物已广泛应用于植物-病原体相互作用研究。该协议概述了叶样品制备、自由生物类群蛋白的去除、提取蛋白质的定量以及生物微化蛋白质的富集。

虽然动物细胞培养系统中的游离生物素可以通过用PBS缓冲液4清洗细胞来基本去除,但叶组织中的自由生物素无法通过简单的洗涤来清除。最近的一项研究表明,自由生物群蛋白可以严重影响生物微量细胞蛋白的后续富集11。在此协议中,利用脱盐柱成功地去除蛋白质提取物中的游自由生物类,使生物微化蛋白与链球菌珠有效结合。

此外,该协议作为在其他工厂系统中进行PL的重要参考。最近,有三份报告在阿拉伯1212、13、1413,14和番茄毛根12中使用基于TurboID的PL,此外还有这里描述的N.本查米亚娜。与动物细胞培养系统类似,在蛋白质提取6之前,通过清洗植物原体来去除游离的生物素。然而,细胞内部存在少量未与蛋白质结合的自由生物素分子,这影响了生物微量蛋白质随后富集的效率。因此,建议采用脱盐程序,完全去除游离生物类蛋白,从而提高生物微化蛋白的回收效率。

两种列,PD-10和Zeba,已被用于免费生物类林去除11,12,13,14。11,12,13,14将来比较这两个列在去除叶蛋白提取物中游离的生物类蛋白的效率可能有兴趣。此外,该协议采用规范注射器介导的农业渗透方法,暂时表达对N.本查米亚纳叶感兴趣的靶蛋白。然后,生物蛋白基质被重新渗透到叶子中,以标记与目标蛋白接近的蛋白质。其他两项最近报告的研究也,采用了类似的行动。作为一种替代方法,真空介导的生物型蛋白渗透适用于N.本查米亚纳阿拉伯生物14。此外,在不适合农业渗透的植物中,细胞培养可以转化为靶蛋白表达,其次是生物素处理和接近标记测定12。这些最近的研究巩固了基于 TurboID 的 PL 在研究 PPI 方面的强大性,并为基于 TurboID 的 PL 在未来不同植物物种中的应用奠定了基础。

在该协议中,在N.benthamiana中采用成熟的农业细菌介导瞬态表达,用于识别感兴趣的目标蛋白的PPI。瞬态表达可能导致融合蛋白的过度表达。因此,更最佳的选择是在原生促进器的控制下设计 TurboID 聚变,并通过农业渗透或生成稳定的转基因线来表达。随着基因组编辑技术的发展,TurboID片段也可以直接进入感兴趣的基因的本地基因组位点。

另一个需要考虑的重要因素是确保 TurboID 融合不会改变感兴趣的目标蛋白的功能。在以前的研究中,融合到TurboID的NLR免疫受体的功能通过测试其诱导在烟草马赛克病毒p50效应器11存在的情况下诱导防御介导的细胞死亡的能力得到了证实。TurboID 比 GFP 相对较大(即 35 kDa),它与目标蛋白的融合会影响目标蛋白的功能。在这种情况下,可以使用较小的 miniTurboID10。

确定目标蛋白的哪个终点体适合与 TurboID 融合也很重要。这种功能测试的一般方法是确定 TurboID 融合是否会补充目标基因的突变植物系。或者,可以使用分析 TurboID 融合与目标蛋白的先前已知的相互作用伙伴的相互作用。在大多数情况下,对于细胞质蛋白,TurboID 的 N 端或 C 端标记可以在后续质谱分析中生成类似的数据集。然而,对于膜局部蛋白,在载体构建之前确定拓扑非常重要。否则,对感兴趣的基因编码序列的TurboID上下游融合将产生完全不同的结果。因此,确定膜局部蛋白的N-终点蛋白或C-terminus的面向面(例如,细胞质或流明面)是很重要的。这确保了目标蛋白的预期近端蛋白可以获得。

尽管PL在检测瞬态或弱PPI方面比传统的IP-MS方法具有几个优点,但它有其自身的内在局限性。首先,确定候选相互作用的蛋白质并不立即意味着与诱饵蛋白的直接或间接相互作用,但它只反映了近距离接近2。因此,可以进行独立的体内检测(即共免疫沉淀、双分子荧光补充[BiFC]或体外GST拉下测定)以进一步验证PPI。

其次,由于各种原因,PL测定可能产生假阴性或误报。例如,当蛋白质缺乏可接近的初级胺时,可能会出现假阴性。此外,最近对植物中BIN2相互作用者的研究表明,两个实验13的数据之间存在部分重叠,表明由于MS覆盖率不足,存在假阴性结果。目标蛋白的一些相互作用者也可能被TurboID融合控制所弱的生物微量,导致折叠浓缩度低于截止阈值,最终失去一些真正的相互作用者13,14。13,因此,应设置足够的生物复制,具有适当的控制和截止值,以尽量减少假阴性11,14,14的数量。

此外,一个漫长的生物蛋白治疗期可以增加非特异性蛋白质的生物小化,导致误报10。因此,优化体内贴标时间窗口,减少非特异性生物小化,同时不影响生物微化蛋白质的产生,分析11、12、13、14。11,12,13,14此外,建议使用严酷的萃取和严格的洗涤条件,以减少从蛋白质的非特异性结合中得出的假阳性到珠17。除了上述警告外,设计适当的负控制对于区分真正的相互间和虚假的相互间,避免缺少真正的参与者11、12、13、14,12,13,14至关重要。

与 BioID10,,11相比,TurboID 的标记动力学有了很大的提高。但是,这也可能导致 PL 分析期间的背景更高。因此,必须包括适当的控件以消除背景信号。我们在该协议11中使用了熔融融合的TurboID,在以前的研究中也使用了类似的控制。对于定位到特定细胞膜的目标蛋白,TurboID 与针对同一细胞膜的信号肽融合,比 TurboID 与细胞质14中表达的一种信号肽更好地控制。

此外,如果已知目标蛋白中的关键域或氨基酸信息,确定其与其他伙伴的相互作用,则将 TurboID 与关键域或氨基酸中突变的目标蛋白融合到一起,应该是最佳控制,并将最大方式减少目标蛋白产生的背景信号。此外,TurboID 酶需要特定的温度以及适当的 pH 条件。对于细胞中的大多数细胞器,如ER、细胞核和线粒体,TurboID成功地标记了近端蛋白10。然而,一些特殊的细胞器(即植物细胞中的真空,其pHH非常低19)可能不适合使用PL方法研究PPI。此外,在应力响应期间,亚细胞环境的pH水平变化或氧化还原状态可能会影响 TurboID 的标签效率。

综上所述,此处描述的协议为在N.benthamiana使用TurboID研究PPI提供了基础,该模型植物系统已广泛应用于植物生物学的许多方面20。随着最近描述的基于TurboID的PL研究在阿拉伯植物和番茄毛根12,13,14,预计这种方法将适用于其他植物物种。12,13,14预计基于TurboID的PL将在植物生物学研究中的研究PPI方面发挥重要作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家转基因科学技术计划(2019ZX080-003至Y.Z.)、中国国家自然科学基金(31872637至Y.Z.)和中央大学基础研究基金(2019TC028至Y.Z.)和NSF-IOS-1354434的资助, NSF-IOS-1339185 和 NIH-GM132582-01 到 S.P.D.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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基于 TurboID 的接近标签,用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别
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Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).More

Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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