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Immunology and Infection

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

doi: 10.3791/60728 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

Abstract

Näherungskennzeichnungstechniken (PL) mit hilfe von Ascorbatperoxidase (APEX) oder Escherichia coli biotin ligase BirA (bekannt als BioID) wurden erfolgreich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) in Säugetierzellen eingesetzt. Der Bedarf an toxischem Wasserstoffperoxid (H2O2) in APEX-basierter PL, längere Inkubationszeit mit Biotin (16–24 h) und eine höhere Inkubationstemperatur (37 °C) in BioID-basierter PL schränken ihre Anwendungen in Pflanzen jedoch stark ein. Das kürzlich beschriebene TurboID-basierte PL behebt viele Einschränkungen von BioID und APEX. TurboID ermöglicht eine schnelle Näherungskennzeichnung von Proteinen in nur 10 min unter Raumtemperatur (RT). Obwohl der Nutzen von TurboID in Tiermodellen nachgewiesen wurde, haben wir kürzlich gezeigt, dass TurboID-basiertes PL in Pflanzen besser abschneidet als BioID bei der Kennzeichnung von Proteinen, die proximal für ein Protein von Interesse sind. Hier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Protein-Interaktionspartnern unter Verwendung der N-terminalen Toll/Interleukin-1-Rezeptor-Domäne (TIR) der Nukleotid-bindenden Leucin-rich repeat (NLR)-Proteinfamilie als Modell vorgesehen. Die Methode beschreibt die Vektorkonstruktion, die Agroinfiltration von Proteinexpressionskonstrukten, Biotinbehandlung, Proteinextraktion und -entsalzung, Quantifizierung und Anreicherung der biotinylierten Proteine durch Affinitätsreinigung. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in Nicotiana und anderen Pflanzenarten zu untersuchen.

Introduction

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PPI sind die Grundlage verschiedener zellulärer Prozesse. Zu den traditionellen Methoden zur Identifizierung von PPI gehören Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) und Immunpräzipitation in Verbindung mit Massenspektrometrie (IP-MS)1. Beide haben jedoch einige Nachteile. Beispielsweise erfordert das Y2H-Screening die Verfügbarkeit einer Y2H-Bibliothek der Zielpflanze oder Tierart. Der Bau dieser Bibliotheken ist arbeitsintensiv und teuer. Darüber hinaus wird der Y2H-Ansatz in der heterologen einzelligen eukaryotischen Organismushefe durchgeführt, die möglicherweise nicht den zellulären Status höherer eukaryotischer Zellen darstellt.

Im Gegensatz dazu zeigt IP-MS eine geringe Effizienz bei der Erfassung vorübergehender oder schwacher PPI, und es ist auch ungeeignet für Proteine mit geringer Häufigkeit oder hoher Hydrophobie. Viele wichtige Proteine, die an den Signalwegen der Pflanze beteiligt sind, wie z. B. Rezeptor-ähnliche Kiinasen (RLKs) oder die NLR-Familie von Immunrezeptoren, werden auf niedrigem Niveau exprimiert und interagieren oft vorübergehend mit anderen Proteinen. Daher schränkt es das Verständnis der Mechanismen, die der Regulierung dieser Proteine zugrunde liegen, stark ein.

Kürzlich wurden näher markierte (PL) Methoden auf Basis von Ascorbatperoxidase (APEX) und einer mutierten Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekannt als BioID) für die Untersuchung von PPI2,3,4entwickelt und genutzt. Das Prinzip von PL ist, dass ein Zielprotein von Interesse mit einem Enzym verschmolzen wird, das die Bildung von labilem Biotinyl-AMP (Bio-AMP) katalysiert. Diese kostenlosen Bio-AMP werden von PL-Enzymen freigesetzt und diffundieren in die Nähe des Zielproteins, wodurch die Biotinylierung von proximalen Proteinen an den primären Aminen in einem geschätzten Radius von 10 nm5ermöglicht wird.

Dieser Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Y2H- und IP-MS-Ansätzen, wie z. B. der Fähigkeit, transiente oder schwache PPI zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht PL die Kennzeichnung von proximalen Proteinen des Zielproteins in ihrer nativen zellulären Umgebung. Verschiedene PL-Enzyme haben einzigartige Nachteile, wenn sie auf verschiedene Systeme angewendet werden. Obwohl APEX beispielsweise eine höhere Tagging-Kinetik im Vergleich zu BioID bietet und erfolgreich in Säugetiersystemen angewendet wird, macht die Anforderung an giftiges Wasserstoffperoxid (H2O2) in diesem Ansatz es für PL-Studien an Pflanzen ungeeignet.

Im Gegensatz dazu vermeidet BioID-basierte S-basierte S-basierte S-basierte Verwendung der toxischenH2O2, aber die Rate der Etikettierung ist langsam (erfordert 18–24 h, um die Biotinylierung abzuschließen), wodurch die Erfassung vorübergehender PPI weniger effizient ist. Darüber hinaus führt die höhere Inkubationstemperatur (37 °C), die für eine effiziente PL durch BioID erforderlich ist, zu äußerer Belastung für einige Organismen, wie Pflanzen4. Daher wurde berichtet, dassderbegrenzte Einsatz von BioID-basierter PL in Pflanzen (d. h. Reisprotoplasten, Arabidopsis und N. benthamiana) 6,7,8,9gemeldet wurde. Das kürzlich beschriebene TurboID-Enzym bewältigt die Mängel von APEX und BioID-basierter PL. TurboID zeigte eine hohe Aktivität, die die Ausführung von PL innerhalb von 10 min bei RT10ermöglicht. TurboID-basierte sePL wurde erfolgreich in Säugetierzellen, Fliegen und Würmern10eingesetzt. Kürzlich haben wir und andere Forschungsgruppen den Einsatz von TurboID-basiertem PL für die Untersuchung von PPI in verschiedenen Pflanzensystemen, einschließlich N. benthamiana und Arabidopsis Pflanzen und Tomatenhaarwurzeln11,12,13,14, optimiert und erweitert. Vergleichende Analysen ergaben, dass TurboID bei PL in Anlagen besser abschneidet als BioID11,14. Es hat auch die Robustheit der TurboID-basierten PL in Planta gezeigt, indem eine Reihe von neuartigen Wechselwirkungen mit einem NLR-Immunrezeptor11identifiziert wurde, einem Protein, dessen Interaktionspartner in der Regel mit traditionellen Methoden schwer zu erhalten sind.

Dieses Protokoll veranschaulicht die TurboID-basierte PL in planta, indem es die Identifizierung von Interaktionsproteinen der N-terminalen TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in N. benthamiana-Pflanzen beschreibt. Die Methode kann auf alle Proteine von Interesse in N. benthamianaerweitert werden. Noch wichtiger ist, es bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von PPI in anderen Pflanzenarten wie Arabidopsis,Tomaten, und andere.

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Protocol

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ANMERKUNG: Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Pflanzenmaterialaufbereitung

  1. N. Benthamiana-Samen in nassen Böden mit hoher Dichte anbauen und in einer Klimakammer mit einem 16 h-Licht (ca. 75 x2s) und 8 h dunkler Photoperiode bei 23–25 °C halten.
  2. Etwa 1 Woche später jeden jungen Sämling vorsichtig in 4' x 4' Töpfe geben und die Sämlinge in derselben Kammer aufbewahren.
  3. Pflegen Sie die Pflanzen in der Kammer für etwa 4 Wochen, bis sie auf ein Blattstadium von 4-8 für die nachfolgende Agroinfiltration15wachsen.

2. Bau von TurboID-Fusionen

  1. Verwenden Sie die standardmäßige molekulare Klontechnik, um eine Fusion des Zielproteins mit TurboID (PCR TurboID von Addgene plasmid #107177) zu erzeugen. Hier verwendeten wir die N-terminale TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors als Zielprotein von Interesse und konstruierten TIR mit TurboID unter der Kontrolle des Cauliflower-Mosaikvirus 35S-Promotors (p35S::TIR-TurboID).
    HINWEIS: Die Fusion des TurboID-Enzyms zum Carboxylterminus oder Aminoterminus des Zielproteins hängt vom Protein ab. Normalerweise sollten für ein zytoplasmatisches Protein beide Termini akzeptabel sein, solange die TurboID-Fusion die Funktion des Zielproteins nicht beeinträchtigt. Bei einem membranlokalisierten Protein sollte die Proteintopologie jedoch im Voraus charakterisiert werden, bevor bestimmt wird, welcher Terminus für die TurboID-Fusion am besten ist.
  2. Konstruieren Sie ein TurboID-gebundenes Citrin unter demselben Promotor, um als Kontrolle für die nachfolgende quantitative proteomische Analyse zu dienen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine TurboID-Steuerung zu erstellen, um das Proteom proximal für das Zielprotein zu identifizieren. Die TurboID-Fusionssteuerung sollte einen Expressionsgrad aufweisen, der dem des TurboID-gebundenen Zielproteins ähnelt. Dies kann empirisch durch Anpassung der Agrobacterium-Konzentration während der Agroinfiltration bestimmt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass das Kontrollprotein ein subzelluläres Lokalisationsmuster aufweist, das dem des Zielproteins von Interesse ähnelt.

3. Agroinfiltration

  1. Umwandlung der Plasmide in Agrobacterium
    1. Fügen Sie 0,5 g der Plasmide hinzu, die aus den Schritten 2.1 und 2.2 bis 50 'L des Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101-fähigen Zellen erzeugt wurden, die wie zuvor beschrieben16hergestellt wurden.
      HINWEIS: Andere Agrobacterium-Stämme, wie z. B. GV2260, können ebenfalls verwendet werden.
    2. 30 min auf Eis bebrüten.
    3. Hitzeschock im Wasserbad bei 42 °C für 60 s.
    4. 400 l LB-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCl; pH = 7,0) in das Agrobacterium geben und 90 min bei 28 °C brüten.
    5. Den gesamten Gehalt in der Röhre auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika zur Auswahl des Plasmids sowie für das Agrobacterium (für GV3101: 50 mg/L Gentamicin und 50 mg/L Rifampicin) zu verspielen.
    6. Inkubieren Sie Platten bei 28 °C für 36–48 h, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.
  2. Mehrere einzelne Kolonien mit Antibiotika auf eine frische LB-Agarplatte (siehe Schritt 3.1.5) pflücken und streifen und über Nacht bei 28 °C wachsen.
    HINWEIS: Es ist optimaler, die Kolonie PCR durchzuführen, um das Vorhandensein des spezifischen binären Konstrukts im Agrobacteriumzu bestätigen. Unserer Erfahrung nach enthalten über 95% der Kolonien die eingeführten binären Konstrukte.
  3. 3 ml LB-Medium plus geeignete Antibiotika (siehe Schritt 3.1.4) mit Agrobacterium-Kolonie, die das Konstrukt von Interesse beherbergt, impfen und durch Schütteln über Nacht bei 28 °C bebrüten, bis die OD600 der Agrobacterium-Kultur 2,0 erreicht.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 x g und setzen Sie sie im Agroinfiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5.6], 250 'M Acetosyringon) auf OD600 = 1,0 zurück).
    HINWEIS: Obwohl es optimal ist, das Inokulum für 2 h bei RT vor der Agroinfiltration zu inkubieren, gab es nach unserer Erfahrung mit dem GV3101-Stamm keinen großen Unterschied zwischen der Zielproteinexpression mit vs. ohne Inkubation.
  5. Verwenden Sie eine 1 ml nadellose Spritze, um das Inokulum in die (abaxiale) Epidermis der vollreifen N. benthamiana Blätter zu infiltrieren.
    HINWEIS: Um eine ausreichende Menge an Blattmaterialien für drei biologische Replikationen vorzubereiten: Ein ganzes Blatt wird in der Regel infiltriert, drei Blätter werden pro Pflanze infiltriert, und für jedes Konstrukt werden drei bis vier Pflanzen verwendet. Für jedes Blatt reichen 1,5–2,0 ml resuspendierte Agrobakterien aus.
  6. Nach 36 h Nachinfiltration (hpi) 200 M Biotin (in 10 mM MgCl2 Lösung) in die mit TurboID-Konstrukten vorinfiltrierten Blätter infiltrieren.
  7. Bewahren Sie die Pflanze für zusätzliche 3–12 h auf, bevor Sie das Blattgewebe ernten, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
    HINWEIS: Der Grund für die Wahl der 36 PSi für die Biotin-Infiltration ist, dass die Zielproteinexpression zu diesem Zeitpunkt nach früheren Studien11ihren Höhepunkt erreicht. Es wird empfohlen, die Zeit zu bestimmen, die für die optimale Expression des Zielproteins von Interesse benötigt wird. Die Inkubationszeit nach der Biotininfiltration hängt vom experimentellen Design und dem untersuchten Zielprotein ab. In der Regel ermöglicht 3–12 h Biotinbehandlung die Kennzeichnung der meisten Proteine proximal zum Zielprotein durch die TurboID-Fusionen.

4. Blattprobensammlung

HINWEIS: Tragen Sie für die nachfolgende Verarbeitung der Blattproben sterile Handschuhe, um eine Keratinkontamination der Proben zu vermeiden. Alle Reagenzien sollten auch so keratinfrei wie möglich sein.

  1. Schneiden Sie die infiltrierten Blätter an der Basis der Petiole, entfernen Sie die Blattvene, dann blitzen Sie das Blattgewebe in flüssigem Stickstoff ein.
  2. Das Blattgewebe mit einem Stößel und Mörtel mahlen und das Blattpulver in 15 ml oder 50 ml Falkenröhren bei -80 °C für die nachfolgende Verwendung lagern.
    HINWEIS: Nehmen Sie drei bis vier Blätter für jede der drei biologischen Repliken aus verschiedenen Pflanzen. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Vor den nachfolgenden Schritten wird empfohlen, die Proteinexpression und Diebiotinylierung des Zielproteins durch Immunoblot-Analysen zu bewerten. Typische westliche Flecken sind in Abbildung 2dargestellt.

5. Extraktion des Blatt-Gesamtproteins

  1. Ca. 0,35 g Blattpulver in ein 2 ml-Rohr geben. Bereiten Sie zwei Rohre für jede Probe vor.
    VORSICHT: Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie ein Objekt berühren, das durch flüssigen Stickstoff gekühlt wird.
  2. Fügen Sie 700 l RIPA-Lysepuffer hinzu (50 mM Tris-HCl [pH = 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% Natriumdeoxycholat [w/v], 1 mM DTT, 1 Tablette Protease-Hemmer-Cocktail) bis 0,35 g Blattpulver.
  3. Wirbeln Sie die Rohre für 10 min.
  4. Lassen Sie die Proben 30 min auf Eis.
  5. Mischen Sie den Inhalt alle 4-5 min, indem Sie die Rohre mehrmals auf den Kopf stellen.

6. Entfernung von freiem Biotin durch Entsalzung

HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert ca. 50 min.

  1. Equilibrate die Entalting-Spalte.
    1. Entfernen Sie die Versiegelung an der Unterseite der Entsalzungssäule und legen Sie die Säule in ein 50 ml-Rohr.
    2. Entfernen Sie die Lagerlösung durch Zentrifugation bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und stellen Sie sicher, dass die Kappe gelockert wird.
    3. Legen Sie die Entsalzungssäule in ein 50 ml-Rohr. Die Säule 3x mit 5 ml RIPA-Lysepuffer ausdemieren, jedes Mal zentrifugieren bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und den Durchfluss entsorgen.
    4. Die Entsalzungssäule in ein neues 50 ml-Rohr geben und vorübergehend bei 4 °C für die Nachverwendung lagern.
  2. Drehen Sie die Rohre ab Schritt 5.4 bei 16.500 x g und 4 °C für 10 min und übertragen Sie den Überstand aus den beiden Rohren in ein neues 2 ml Rohr.
  3. Fügen Sie 1.500 L Proteinextrakt an die Oberseite des Harzes der ausgeglichenen Entsalzungssäule (ab Schritt 6.1.4) hinzu. Wenn der Proteinextrakt in das Harz gelangt, fügen Sie weitere 100 L RIPA-Lysepuffer hinzu.
    HINWEIS: Obwohl 1.400 L RIPA-Lysepuffer für die Proteinextraktion aus den Blättern verwendet wurden, wurde das Gesamtvolumen nach Deriator-Extraktion und Entsalzung im Verhältnis zum ursprünglichen Volumen unweigerlich zueinem gewissen Grad erhöht. Daher kann eine Kombination der Proben aus jeder Gruppe, wie in den Schritten 5.1 und 5.4 beschrieben, zu mindestens 1.500 l Proteinextrakt pro Probe führen.
  4. Zentrifugieren Sie bei 1000 x g und 4 °C für 2 min und lassen Sie die entsalzten Proben vorübergehend auf Eis.

7. Quantifizierung der entsalzten Proteinextrakte mit einem Bradford-Assay

  1. Bereiten Sie 50 l jeder Gradienten-BSA-Lösung vor: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml und 1 mg/ml.
  2. Verdünnen Sie den entsalzten Proteinextrakt, indem Sie eine 5-L-Probe mit 45 l ddH2O mischen.
  3. Bereiten Sie 1x Bradford Regent durch Verdünnung der 5x Bradford Regent (100 mg Coomassie brillant blau G250, 47 ml Methanol, 100 ml 85% Phosphorsäure, 53 ml ddH2O).
  4. Fügen Sie dem 2,5 ml 1x-Bradford-Regenten 50 l der bgradienten BSA-Lösung und 50 l verdünnten Proteinextrakt hinzu.
  5. Bei RT für 10 min inkubieren.
  6. Fügen Sie 200 L Lösung s jeder Probe zu einem Bohrwert einer ELISA-Platte hinzu (drei technische Replikationen pro Probe).
  7. Messen Sie den OD595 mit einem Mikroplattenleser.
  8. Zeichnen Sie die Standardkurve basierend auf dem Wert der Gradienten-BSA-Lösung und berechnen Sie die Konzentration der entsalzten Proteinproben. In der Regel liegt die Gesamtproteinkonzentration von 0,7 g Blättern zwischen 3–6 mg/ml.
  9. Bereiten Sie 6–8 mg entsalzter Proteinextrakt für die nachfolgende Affinitätsreinigung vor.

8. Anreicherung von biotinylierten Proteinen

  1. Nehmen Sie 200 L Streptavidn-C1-konjugierte Magnetperlen in ein 2 ml-Rohr.
  2. Equilibrate die streptavidn-C1-konjugierten magnetischen Perlen mit 1 ml RIPA-Lysepuffer für 1 min bei RT.
  3. Verwenden Sie nach jeder Wäsche das magnetische Rack, um die Perlen für 3 min zu adsorbieren und die Lösung vorsichtig durch Pipettieren zu entfernen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 8.2 und 8.3.
  5. Übertragen Sie den entsalzten Proteinextrakt auf die äquilibierten Streptavidn-C1-konjugierten Magnetperlen.
  6. Inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C für 12 h (oder über Nacht) auf einem Rotator, um die biotinylierten Proteine zu affinieren.
  7. Erfassen Sie die Perlen auf einem magnetischen Rack für 4 min bei RT, bis sich die Perlen an einer Seite des Rohres sammeln, und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand durch Pipette.
  8. 1,7 ml Waschpuffer I (2% SDS in Wasser) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  9. 1,7 ml Waschpuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Desoxycholsäure [w/v], 1% Triton X-100) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  10. 1,7 ml Waschpuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% Desoxycholsäure [w/v], 1% NP40 [v/v]) in das Rohr geben und 8 min am Rotator bei RT aufbewahren. Schritt 8.3 wiederholen.
  11. Fügen Sie 1,7 ml von 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) hinzu, um das Reinigungsmittel zu entfernen, und wiederholen Sie dann Schritt 8.3.
  12. Übertragen Sie die Perlen in ein neues 1,5 ml Rohr, und wiederholen Sie die Schritte 8.11 und 8.3.
  13. Waschen Sie die Perlen 6x für je 5 min mit 50 mM Ammonium-Bicarbonat-Puffer bei RT.
  14. 1 ml 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer zu den Magnetperlen geben und gut mischen.
  15. Entfernen Sie 100 L Perlen für die Immunoblot-Analyse, um die Anreicherung von biotinylierten Proteinen zu bestätigen. Ein typischer westlicher Fleck ist in Abbildung 3dargestellt.
  16. Den Rest der Proteinproben einfrieren und bei -80 °C lagern oder sofort zur LC-MS/MS-Analyse auf Trockeneis senden.
    HINWEIS: Typische MS-Ergebnisse werden in einer früheren Publikation (Zhang et al. 2019; Abbildung 2, Zusatzdaten 1 und Zusatzdaten 2)11. Die gesamten Datensätze sind auf MassIVE (gefunden unter ) mit dem Bezeichner MSV000083018 und MSV000083019 verfügbar.

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Representative Results

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Die repräsentativen Daten, die die erwarteten Ergebnisse auf der Grundlage des beschriebenen Protokolls veranschaulichen, werden von Zhang et al11adaptiert. Abbildung 1 fasst die Verfahren für die Durchführung von TurboID-basierter PL in N. benthamianazusammen. Abbildung 2 zeigt die Proteinexpression und Biotinylierung in den infiltrierten N. benthamiana Blättern. Abbildung 3 zeigt, dass die biotinylierten Proteine in den infiltrierten Blättern effizient für die anschließende Massenspektrometrieanalyse angereichert wurden. Es sei darauf hingewiesen, dass nach der Anreicherung der biotinylierten Proteine mit Streptavidn-C1-konjugierten Magnetperlen verschiedene Proteine mit unterschiedlichen Größen erfasst wurden und die Western-Blot-Analyse der angereicherten Proteine verschmierte Bänder zeigte (Abbildung 3). Ähnliche Beobachtungen wurden in mehreren kürzlich veröffentlichten Studien6,7,13,14gemacht.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über die TurboID-basierte PL-Methode in N. benthamiana Agrobacterium, das die TurboID-Fusionskonstrukte beherbergte, wurde in N. benthamiana Blätter infiltriert. 36 h nach der Infiltration wird 200 M Biotin in die gleichen Blätter infiltriert, um die Biotinylierung der endogenen Proteine zu initiieren, die proximal für das TurboID-gebundene Zielprotein sind. Die infiltrierten Pflanzen werden dann bei RT für 3–12 h inkubiert, gefolgt von der Blatternte und dem Mahlen in flüssigem Stickstoff. Blattpulver wird im RIPA-Lysepuffer lysiert, und eine Entsalzungssäule wird verwendet, um das freie Biotin im Proteinextrakt zu entfernen. Die biotinylierten Proteine wurden dann mit Streptavidin-konjugierten Perlen affinitätsgereinigt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Abbildung ist an die Ergänzende Abbildung 3 von Zhang et al11angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Immunoblot-Analyse von Proteinextrakten, die in Schritt 4.2 gewonnen wurden. (A) Western Blot Analyse von Proteinen aus den agrofiltrierten Blättern mit Antikörper gegen HA-Tag extrahiert. (B) Western Blot Analyse von biotinylierten Proteinen in den agrofiltrierten Blättern mit Streptavidin-HRP. Diese Zahl ist an die Ergänzende Abbildung 6B von Zhang et al11angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Western Blot Analyse von Perlen in Schritt 8.15 erhalten, um die Anreicherung von biotinylierten Proteinen zu bestätigen. Für jedes Konstrukt gibt es drei unabhängige Replikationen (1, 2 und 3). Streptavidin-HRP wurde zur Analyse von biotinylierten Proteinen in verschiedenen Proben verwendet. Diese Zahl ist an die Ergänzende Abbildung 7 von Zhang et al11angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Die TurboID Biotinligase wird durch Hefedisplay-basierte directed Evolution des BioID10erzeugt. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen PL-Enzymen. TurboID ermöglicht die Anwendung von PL auf andere Modellsysteme, einschließlich Fliegen und Würmern, deren optimale Wachstumstemperatur bei ca. 25 °C10liegt. Obwohl der PL-Ansatz in Tiersystemen weit verbreitet ist, ist seine Anwendung in Pflanzen begrenzt. Das hier beschriebene Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur Etablierung der TurboID-basierten PL in N. benthamiana, einer Modellpflanze, die in Pflanzen-Pathogen-Interaktionsstudien weit verbreitet ist. Dieses Protokoll umreißt die Vorbereitung von Blattproben, die Entfernung von freiem Biotin, die Quantifizierung der extrahierten Proteine und die Anreicherung der biotinylierten Proteine.

Obwohl freies Biotin in tierischen Zellkultursystemen durch Waschen der Zellen mit PBS-Puffer4weitgehend entfernt werden kann, kann das freie Biotin im Blattgewebe nicht durch einfaches Waschen gelöscht werden. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass das freie Biotin die anschließende Anreicherung der biotinylierten Proteine11stark beeinträchtigen kann. In diesem Protokoll wird eine Entsalzungssäule verwendet, um freies Biotin in den Proteinextrakten erfolgreich zu entfernen, was die effiziente Bindung von biotinylierten Proteinen an die Streptavidinperlen ermöglicht.

Darüber hinaus dient dieses Protokoll als wichtiger Bezugspunkt für die Durchführung von PL in anderen Anlagensystemen. Kürzlich haben drei Berichte TurboID-basierte PL in Arabidopsis12,13,14 und Tomaten haarige Wurzel12, neben der N. benthamiana hier beschrieben verwendet. Ähnlich wie bei tierischen Zellkultursystemen wurde die Entfernung des freien Biotins durch Waschen der Pflanzenprotoplasten vor der Proteinextraktionerreicht 6. Im Inneren der Zelle befanden sich jedoch geringere Mengen an freien Biotinmolekülen, die nicht in das Protein integriert waren, was die Effizienz der anschließenden Anreicherung der biotinylierten Proteine beeinträchtigte. Daher wird ein Entsalzungsverfahren zur vollständigen Entfernung von freiem Biotin empfohlen, wodurch die Rückgewinnungseffizienz von biotinylierten Proteinen erhöht wird.

Zwei Arten von Säulen, PD-10 und Zeba, wurden für die kostenlose Biotinentfernung verwendet11,12,13,14. Es könnte in Zukunft von Interesse sein, die Effizienz dieser beiden Säulen bei der Entfernung von freiem Biotin in Blattproteinextrakten zu vergleichen. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll eine kanonische Spritze-vermittelte Agroinfiltrationsmethode, um das Zielprotein von Interesse in N. benthamiana Blättern vorübergehend auszudrücken. Anschließend wird das Biotinsubstrat wieder in die Blätter eingeschleust, um Proteine zu kennzeichnen, die dem Zielprotein proximal sind. Ähnliche Operationen wurden auch in anderen zwei kürzlich berichteten Studien12,13verwendet. Als alternative Methode ist die vakuumvermittelte Infiltration von Biotin sowohl für N. benthamiana als auch für Arabidopsis14anwendbar. Darüber hinaus können in Pflanzen, die nicht für die Agroinfiltration geeignet sind, Zellkulturen für die Zielproteinexpression transformiert werden, gefolgt von Biotinbehandlung und Näherungskennzeichnungstest12. Diese jüngsten Studien haben die Robustheit der TurboID-basierten PL bei der Untersuchung von PPI untermauert und den Grundstein für zukünftige Anwendungen von TurboID-basiertem PL in verschiedenen Pflanzenarten gelegt.

In diesem Protokoll wird ein gut etabliertes Agrobacterium-vermittelte transiente Expression in N. benthamiana verwendet, um PPI des Zielproteins von Interesse zu identifizieren. Die transiente Expression kann zu einer Überexpression der Fusionsproteine führen. Daher ist eine optimale alternative Alternative, die TurboID-Fusion unter der Kontrolle eines nativen Promotors zu entwickeln und sie durch Agroinfiltration oder die Erzeugung stabiler transgener Linien auszudrücken. Mit der Entwicklung der Genom-Editing-Technologie ist es auch möglich, das TurboID-Fragment direkt in die native genomische Loci von Genen von Interesse einzuschlagen.

Ein weiterer wichtiger Faktor, der berücksichtigt werden muss, ist sicherzustellen, dass die TurboID-Fusion die Funktion des Zielproteins nicht verändert. In einer früheren Studie wurde die Funktion des Mitwirkungsfaktors Des NLR-Immunrezeptors mit TurboID bestätigt, indem seine Fähigkeit getestet wurde, den abwehrvermittelten Zelltod in Gegenwart des Tabakmosaikvirus p50-Effektors11zu induzieren. TurboID ist relativ größer (d. h. 35 kDa) als GFP, und seine Fusion zu einem Zielprotein kann die Funktion eines Zielproteins beeinflussen. In solchen Fällen kann der kleinere miniTurboID10 verwendet werden.

Es ist auch wichtig zu bestimmen, welcher Endpunkt des Zielproteins für die Verschmelzung mit TurboID geeignet ist. Ein allgemeiner Ansatz für solche Funktionellen Tests ist die Bestimmung, ob die TurboID-Fusion die mutierte Pflanzenlinie des Zielgens ergänzen wird. Alternativ kann eine Analyse der Wechselwirkung der TurboID-Fusion mit einem bisher bekannten Interaktionspartner des Zielproteins verwendet werden. In den meisten Fällen kann bei zytoplasmatischen Proteinen n-terminale oder C-terminale Markierungen der TurboID vergleichbare Datensätze in der nachfolgenden Massenspektrometrieanalyse erzeugen. Bei membranlokalisierten Proteinen ist es jedoch wichtig, die Topologie vor dem Vektoraufbau zu bestimmen. Andernfalls wird die Fusion von TurboID vor oder nach der Kodierungssequenz von Genen von Interesse völlig unterschiedliche Ergebnisse erzeugen. Daher ist es wichtig, die gegenüberliegenden Seiten (z.B. zytoplasmatisch- oder lumen-zugewandt) des N-Terminus oder C-Terminus der membranlokalisierten Proteine zu bestimmen. Dadurch wird sichergestellt, dass das erwartete proximale Proteom des Zielproteins erhalten werden kann.

Obwohl PL gegenüber den herkömmlichen IP-MS-Ansätzen zur Erkennung vorübergehender oder schwacher PPIs mehrere Vorteile hat, hat es seine eigenen intrinsischen Einschränkungen. Erstens impliziert die Identifizierung eines Kandidaten-Interaktionsproteins nicht sofort eine direkte oder indirekte Interaktion mit dem Köderprotein, sondern spiegelt nur die Nähe2wider. Daher können unabhängige In-vivo-Assays (d. h. Co-Immunpräzipitation, bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung [BiFC] oder in vitro GST-Pull-Down-Assay) durchgeführt werden, um die PPI weiter zu verifizieren.

Zweitens können falsche Negative oder falsche Positivwerte aus dem PL-Assay aus verschiedenen Gründen entstehen. Zum Beispiel können falsche Negative auftreten, wenn das Protein ohne zugängliche primäre Aumine. Darüber hinaus zeigten jüngste Studien mit BIN2-Interaktoren in Pflanzen eine teilweise Überlappung zwischen den Daten aus zwei Experimenten13, was auf das Vorhandensein falsch negativer Ergebnisse aufgrund unzureichender MS-Abdeckung hindeutet. Einige Interaktoren des Zielproteins können auch durch die TurboID-fused-Kontrolle schwach biotinyliert werden, was zu einer Faltenanreicherung unterhalb der Cutoff-Schwelle und schließlich zum Verlust einiger echter Interaktoren13,14führt. Daher sollten ausreichende biologische Replikationen mit geeigneten Kontrollen und Cutoff-Werten festgelegt werden, um die Anzahl der falschen Negative zu minimieren11,14.

Darüber hinaus kann eine lange Biotin-Behandlungsdauer die Biotinylierung von unspezifischen Proteinen erhöhen, was zu falsch positiven Ergebnissen10führt. Daher ist es wichtig, die In-vivo-Etikettierungszeitfenster zu optimieren, um die unspezifische Biotinylierung zu reduzieren, ohne die Produktion von biotinylierten Proteinen für die Analyse11,12,13,14zu beeinflussen. Darüber hinaus wird eine harte Extraktion und strenge Waschbedingungen empfohlen, um die falschen Positivmeldungen zu reduzieren, die aus der unspezifischen Bindung von Proteinen an die Perlen abgeleitet werden17. Neben den oben beschriebenen Vorbehalten ist das Design einer richtigen Negativkontrolle entscheidend, um echte Interaktoren von falschen Interaktoren zu unterscheiden und zu vermeiden, dass echte Interaktoren11,12,13,14fehlen.

TurboID zeigte eine stark verbesserte Etikettierungskinetik im Vergleich zu BioID10,11. Dies kann jedoch auch zu einem höheren Hintergrund während der PL-Analyse führen. Daher müssen geeignete Kontrollen einbezogen werden, um die Hintergrundsignale zu eliminieren. Wir haben die Citrin-fused TurboID in diesem Protokoll11verwendet, und eine ähnliche Steuerung wurde in früheren Studien verwendet18. Für die Zielproteine, die auf eine bestimmte Organelle-Membran lokalisieren, macht TurboID-Verschmelzung mit einem Signalpeptid, das auf dieselbe Organelle-Membran abzielt, eine bessere Kontrolle als TurboID-Verschmelzung mit einer, die im Zytoplasma14ausgedrückt wird.

Wenn Informationen über den Schlüsselbereich oder Aminosäuren im Zielprotein, die seine Wechselwirkungen mit anderen Partnern bestimmen, bekannt sind, sollte die Verschmelzung der TurboID mit einem Zielprotein mit einer Mutation im Schlüsselbereich oder Aminosäuren die beste Kontrolle sein und die vom Zielprotein erzeugten Hintergrundsignale maximal reduzieren. Darüber hinaus erfordern TurboID-Enzyme spezifische Temperaturen sowie angemessene pH-Bedingungen. Für die meisten Organellen in der Zelle wie ER, Kern und Mitochondrien, TurboID erfolgreich beschriftet die proximalen Proteine10. Einige spezielle Organellen (d. h. Vakuolen in Pflanzenzellen, deren pH-Wert sehr niedrigist 19) sind jedoch möglicherweise nicht für die Untersuchung von PPI nach dem PL-Ansatz geeignet. Darüber hinaus können Veränderungen des pH-Wertes oder Oxidationsreduktionszustände der subzellulären Umgebung während der Spannungsreaktion die Etikettierungseffizienz der TurboID beeinträchtigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll die Grundlage für die Untersuchung von PPI mit TurboID in N. benthamianabietet, einem Modellpflanzensystem, das in vielen Aspekten der Pflanzenbiologie weit verbreitet ist20. Mit den kürzlich beschriebenen TurboID-basierten PL-Studien an Arabidopsis-Pflanzen und Tomatenhaarwurzeln12,13,14wird erwartet, dass diese Methode auf andere Pflanzenarten anwendbar sein wird. Es wird erwartet, dass TurboID-basierte SPS eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von PPI in der Pflanzenbiologieforschung spielen werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 bis Y.Z.), der National Natural Science Foundation of China (31872637 to Y.Z.) und der Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 bis Y.Z.) und der NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 und NIH-GM132582-01 bis S.P.D.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

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References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26, (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17, (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196, (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8, (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8, (1), 9212 (2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9, (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19, (1), 326 (2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36, (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10, (1), 3252 (2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6, (10), 26468 (2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9, (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24, (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6, (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56, (1), 405-426 (2018).
TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks
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Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).More

Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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