Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

doi: 10.3791/60728 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Abstract

Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak da bilinir) kullanılarak yapılan yakınlık etiketleme (PL) teknikleri memeli hücrelerindeki protein-protein etkileşimlerinin (PPI) belirlenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Ancak, APEX tabanlı PL'de toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimleri, biotin ile daha uzun kuluçka süresi (16-24 saat) ve BioID tabanlı PL'de daha yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkilerdeki uygulamalarını ciddi şekilde sınırlar. Yakın zamanda açıklanan TurboID tabanlı PL BioID ve APEX birçok sınırlamaları giderir. TurboID, oda sıcaklığında (RT) sadece 10 dakika içinde proteinlerin hızlı bir şekilde etiketlemesine olanak tanır. TurboID'nin faydası hayvan modellerinde gösterilmiş olsa da, yakın zamanda TurboID tabanlı PL'nin bitkilerde bioid ile karşılaştırıldığında ilgi çekici bir proteine yakın proteinlerin etiketedilmesi nde daha iyi performans gösterdiğini gösterdik. Burada sağlanan bir model olarak nükleotit bağlayıcı lösin zengintekrar (NLR) protein ailesinin N-terminal Toll/interlökin-1 reseptör (TIR) etki alanı kullanarak protein etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir adım adım protokoldür. Yöntem vektör yapımı, protein ekspresyonu yapılarının agroinfiltrasyonu, biotin tedavisi, protein ekstraksiyonu ve tuzsuzlaştırma, niceleme ve biyotinylated proteinlerin afinite saflaştırma ile zenginleştirilmesi açıklar. Burada açıklanan protokol, Nicotiana ve diğer bitki türlerinde ilgi çeken diğer proteinleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PpIs çeşitli hücresel süreçlerin temelidir. PpIs tanımlamak için geleneksel yöntemler maya-iki-hibrid (Y2H) tarama ve immünopresidkütle spektrometresi ile birleştiğinde (IP-MS)1. Ancak, her ikisi de bazı dezavantajları muzdarip. Örneğin, Y2H taraması hedef bitki veya hayvan türlerinin Y2H kütüphanesinin kullanılabilirliğini gerektirir. Bu kütüphanelerin inşaatı emek yoğun ve pahalıdır. Ayrıca, Y2H yaklaşımı heterolog tek hücreli ökaryotik organizma mayasında gerçekleştirilir, bu da yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu temsil etmeyebilir.

Buna karşılık, IP-MS geçici veya zayıf PPI yakalama düşük verimlilik gösterir, ve aynı zamanda düşük bolluk veya yüksek hidrofobiklik ile bu proteinler için uygun değildir. Reseptör benzeri kinazlar (RLKs) veya NLR bağışıklık reseptörleri ailesi gibi bitki sinyal yollarında yer alan birçok önemli protein düşük seviyelerde ifade edilir ve genellikle geçici olarak diğer proteinlerle etkileşime girer. Bu nedenle, büyük ölçüde bu proteinlerin düzenlenmesi altında mekanizmaların anlaşılmasını kısıtlar.

Son zamanlarda, yakınlık etiketleme (PL) yöntemleri mühendislik askorbat peroksidaz dayalı (APEX) ve mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (BioID olarak bilinen) geliştirilmiş ve PPIs çalışması için kullanılmıştır2,3,4. PL prensibi, bir hedef proteinin labile biotinyl-AMP (bio-AMP) oluşumunu katalizler bir enzim ile kaynaşmış olmasıdır. Bu serbest biyo-AMP PL enzimleri tarafından serbest bırakılır ve hedef protein in çevresine diffüz, 10 nm5tahmini yarıçapı içinde birincil aminlerde proksimal proteinlerin biyotinylation sağlayan 5 .

Bu yaklaşım, geçici veya zayıf PPI yakalama yeteneği gibi geleneksel Y2H ve IP-MS yaklaşımları üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca, PL kendi yerli hücresel ortamlarda hedef proteinproksimal proteinlerin etiketleme sağlar. Farklı PL enzimleri farklı sistemlere uygularken benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, APEX BioID'ye göre daha yüksek etiketleme kinetik leri sunsa ve memeli sistemlerinde başarılı bir şekilde uygulansa da, bu yaklaşımda toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimi bitkilerdeki PL çalışmaları için uygun değildir.

Buna karşılık, BioID tabanlı PL toksik H kullanımını önler2O2, ama etiketleme oranı yavaş (biyotinylation tamamlamak için 18-24 h gerektiren), böylece geçici PPIs yakalama daha az verimli hale. Ayrıca BioID tarafından verimli PL için gereken yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkiler4gibi bazı organizmalara dış stres getirir. Bu nedenle, bitkilerde BioID tabanlı PL sınırlı dağıtım (yani, pirinç protoplastlar, Arabidopsis, ve N. benthamiana) bildirilmiştir6,7,8,9. Yakın zamanda açıklanan TurboID enzim APEX ve BioID tabanlı PL. TurboID eksiklikleri üstesinden rt 10 10 10 dakika içinde PL başarı sağlayan yüksek aktivitegösterdi. TurboID tabanlı PL başarıyla memeli hücreleri, sinekler ve solucanlar10uygulanmıştır. Son zamanlarda, biz ve diğer araştırma grupları bağımsız optimize ve N. benthamiana ve Arabidopsis bitkiler ve domates tüylü kökleri11,12,,13,14dahil olmak üzere farklı bitki sistemlerinde PPI eğitimi için TurboID tabanlı PL kullanımını uzattı. Karşılaştırmalı analizler TurboID'nin bitkilerde PL için BioID11,14ile karşılaştırıldığında daha iyi performans gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca bir NLR bağışıklık reseptörü 11 ile yeni etkileşimler bir dizi tespit ederek planta TurboID tabanlı PL sağlamlığını göstermiştir11, etkileşim ortakları genellikle geleneksel yöntemlerle elde etmek zor bir protein.

Bu protokol, N. benthamiana tesislerinden NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanının etkileşim proteinlerinin tanımlanmasını tanımlayarak planta'daki TurboID tabanlı PL'yi göstermektedir. Yöntem N. benthamianailgi herhangi bir protein için uzatılabilir. Daha da önemlisi, Arabidopsis,domates ve diğerleri gibi diğer bitki türlerinde PPIs araştırmak için önemli bir referans sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Bitki malzemesi hazırlama

  1. N. benthamiana tohumlarını ıslak toprakta yüksek yoğunlukta yetiştirin ve 23-25 °C'de 16 h ışık (yaklaşık 75 mol/m2s) ve 8 saat karanlık fotoperiyotlu bir iklim odasında saklayın.
  2. Yaklaşık 1 hafta sonra, her genç fideyi dikkatlice 4' x 4' tencereye aktarın ve fideleri aynı odada tutun.
  3. Onlar sonraki agroinfiltrasyon için 4-8 bir yaprak aşamasına kadar yaklaşık 4 hafta boyunca odasında bitkilerin koruyun15.

2. TurboID füzyonların yapımı

  1. Hedef proteinin TurboID (Addgene plazmid #107177 PCR TurboID) ile füzyonunu oluşturmak için standart moleküler klonlama tekniğini kullanın. Burada, NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanını hedef protein olarak kullandık ve Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (p35S::TIR-TurboID) kontrolü altında TurboID'ye kaynaşmış tir inşa ettik.
    NOT: TurboID enziminin karboksil-terminus veya amino-terminusa füzyonu ilgi proteinine bağlıdır. Genellikle, bir sitoplazmik protein için, TurboID füzyon hedef proteinin işlevini etkilemediği sürece, her iki termini kabul edilebilir olmalıdır. Ancak, bir membran lokalize protein için, turboid füzyonu için hangi terminusun en iyi olduğunu belirlemeden önce protein topolojisi önceden karakterize edilmelidir.
  2. Sonraki kantitatif proteomik analiz için kontrol olarak hizmet etmek için aynı promotör altında bir TurboID-erimiş sitrin inşa.
    NOT: Hedef proteine proteom proksimalını belirlemek için turboid kontrolü oluşturmak önemlidir. TurboID füzyon kontrolü, TurboID-erimiş hedef proteinine benzer bir ifade düzeyi göstermelidir. Bu ampirik agroinfiltrasyon sırasında Agrobacterium konsantrasyonu ayarlayarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, kontrol proteininin hedef proteinine benzer bir hücre altı lokalizasyon desenine sahip olması önemlidir.

3. Tarımsal filtrasyon

  1. Plazmidlerin Agrobacterium'a dönüşümü
    1. Daha önce açıklandığı gibi hazırlanan 2.1 ve 2.2 ila 50 μL Agrobacterium tumefaciens zorlanma GV3101 yetkili hücreleri, üretilen plazmidlerin 0,5 g ekleyin16.
      NOT: GV2260 gibi diğer Agrobacterium suşları da kullanılabilir.
    2. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    3. 42 °C'de bir su banyosunda 60 s. için ısı şoku.
    4. Agrobacterium'a 400 μL LB orta (10 g/L tripton, 5 g/L maya ekstresi ve 10 g/L NaCl; pH = 7.0) ekleyin ve 90 dakika boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Plaka LB agar üzerinde tüp tesbih plazmid seçmek için uygun antibiyotikler ile takviye, yanı sıra Agrobacterium için (GV3101 için: 50 mg / L gentamicin ve 50 mg / L rifampisin).
    6. 28 °C'de 36-48 h boyunca tek tek koloniler görünene kadar kuluçka plakaları.
  2. Antibiyotiklerle taze bir LB agar plakaüzerine birkaç ayrı koloniseçin ve çizgi (adım 3.1.5 bakınız) ve 28 °C'de bir gecede büyüyün.
    NOT: Agrobacterium'dakibelirli ikili yapının varlığını doğrulamak için koloni PCR'sini gerçekleştirmek daha uygun olacaktır. Deneyimlerimize göre, kolonilerin %95'inden fazlasında tanıtılan ikili yapılar bulunur.
  3. 3 mL LB orta artı uygun antibiyotikler (bkz. adım 3.1.4) ilgi nin yapısını barındıran Agrobacterium kolonisi ile aşılave 28 °C'de bir gecede sallayarak kuluçkaya yatan Agrobacterium kültürünün OD600'ü 2.0'a ulaşın.
  4. Hücreleri 3.000 x g olarak santrifüj edin ve agroinfiltrasyon tamponunda OD600 = 1.0 'a geri alın (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5.6], 250 μM asetozeringone).
    NOT: Agroinfiltrasyon dan önce RT'de 2 saat inkübaksu en uygun uyguluyor olsa da, GV3101 suşu ile ilgili deneyimimizde, inkübasyonsuz vs. ile hedef protein ekspresyonu ile arasında büyük bir fark olmamıştır.
  5. Tam olgun N. benthamiana yapraklarının (abaxial) epidermisinde inoculumu sızdırmak için 1 mL iğnesiz şırınga kullanın.
    NOT: Üç biyolojik kopya için yeterli miktarda yaprak malzemesi hazırlamak için: bütün bir yaprağın tamamı genellikle sızılır, bitki başına üç yaprak sızılır ve her yapı için üç ila dört bitki kullanılır. Her yaprak için, resuspended agrobacteria 1.5-2.0 mL yeterlidir.
  6. 36 saat post-infiltrasyondan (hpi) sonra, TurboID yapıları ile önceden sızmış yapraklara 200 μM biotin (10 mM MgCl2 çözeltisinde) sızdırın.
  7. Bölüm 4'te açıklandığı gibi yaprak dokusunu hasat etmeden önce bitkiyi ek 3-12 saat boyunca koruyun.
    NOT: Biotin infiltrasyonu için 36 hpi'yi seçmenin nedeni, önceki çalışmalara göre hedef protein ekspresyonunun bu zaman diliminde zirve yapmamasıdır11. Bu ilgi hedef proteinoptimal ifade için gerekli zaman belirlemek için tavsiye edilir. Biyotin sonrası infiltrasyon süresi, incelenen deneysel tasarıma ve hedef proteine bağlıdır. Genellikle, biotin tedavisi 3-12 h TurboID füzyonlar tarafından hedef proteine proksimal en proteinlerin etiketleme sağlar.

4. Yaprak numunesi toplama

NOT: Yaprak numunelerinin sonraki işlenmesi için, numunelerin keratin kontaminasyonunu önlemek için steril eldiven giyin. Tüm reaktifler de mümkün olduğunca keratin içermez.

  1. Petiole tabanında sızmış yaprakları kesin, yaprak damarı kaldırmak, sonra sıvı azot yaprak dokusu flaş dondurun.
  2. Bir havaneli ve harç kullanarak yaprak dokusunu öğütün ve yaprak tozunu 15 mL veya 50 mL şahin tüpleri halinde -80 °C'de saklayın.
    NOT: Farklı bitkilerden gelen üç biyolojik kopyanın her biri için üç ila dört parça yaprak alın. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Sonraki adımlardan önce, immünoblot analizleri ile hedef proteinin protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunun değerlendirilmesi önerilir. Tipik batı lekeleri Şekil 2'degösterilmiştir.

5. Yaprak toplam protein inekstraksiyonu

  1. Yaklaşık 0,35 g yaprak tozunun 2 mL'lik bir tüpe aktarılması. Her örnek için iki tüp hazırlayın.
    DİkKAT: Sıvı nitrojen tarafından soğutulan herhangi bir nesneye dokunurken eldiven takın.
  2. 700 μL RIPA lysis tampon (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5] ekleyin, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %1 NP40 [v/v], %0.1 SDS [w/v], %0.5 sodyum deoksichoat [w/v], 1 mM DTT, 1 tablet proteaz inhibitörü kokteyli) 0.35 g yaprak tozu.
  3. 10 dakika boyunca tüpleri girdap.
  4. 30 dakika buz üzerinde örnekleri bırakın.
  5. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek her 4-5 dakikada bir içeriğini karıştırın.

6. Tuzsuzluk ile serbest biotin çıkarılması

NOT: Bu bölüm yaklaşık 50 dakika sürer.

  1. Tuzsuzlama sütununa dengeleyin.
    1. Tuzluk sütununun altındaki makarayı çıkarın ve kolonu 50 mL'lik bir tüpe koyun.
    2. Depolama çözeltisini 1000 x g ve 4 °C'de 2 dk'lık santrifüj ile çıkarın ve kapağın gevşetilmesini sağlayın.
    3. Tuzsuzma sütununa 50 mL'lik bir tüp koyun. 2 dk için 1000 x g ve 4 °C'de her santrifüj de santrifüj ve akış atarak 5 mL RIPA lysis tampon ile sütun 3x dengeleyin.
    4. Tuzsuzma sütununu yeni bir 50 mL boruya aktarın ve daha sonraki kullanım için geçici olarak 4 °C'de saklayın.
  2. Tüpleri 16.500 x g ve 4 °C'de 10 dk'da adım 5.4'ten döndürün ve iki tüpten süpernatant'ı yeni bir 2 mL tüpe aktarın.
  3. Dengedeki tuzsuzlama sütununun reçinesinin üstüne 1.500 μL protein ekstresi ekleyin (adım 6.1.4'ten itibaren). Protein ekstresi reşin eve girdiğinde, 100 μL RIPA lysis tamponu ekleyin.
    NOT: Yapraklardan protein ekstraksiyonu için 1.400 μL RIPA lysis tamponu kullanılmasına rağmen, protein çıkarma ve tuzdan arındırma sonrası toplam hacim, orijinal hacime göre bir dereceye kadar artırılmıştır. Bu nedenle, her gruptan alınan numunelerin 5.1 ve 5.4 adımlarında açıklandığı gibi bir kombinasyonu, numune başına en az 1.500 μL protein özüne neden olabilir.
  4. 2 dk için 1000 x g ve 4 °C'de santrifüj ve tuzsuz numuneleri geçici olarak buzüzerinde bırakın.

7. Bradford testi kullanarak tuzsuz protein özlerinin sayısallaştırılması

  1. Her degrade BSA çözeltisinin 50 μL'sini hazırlayın: 0 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL ve 1 mg/mL.
  2. 5 μL'lik bir numuneyi 45 μL ddH2O ile karıştırarak tuzsuz protein ekstresini seyreltin.
  3. 5x Bradford naibi (100 mg Coomassie parlak mavi G250 mg, metanol 47 mL, % 85 fosforik asit 100 mL, ddH2O 53 mL) seyrelterek 1x Bradford naibi hazırlayın.
  4. Her degrade BSA çözeltisinin 50 μL'sini ve seyreltilmiş protein ekstresini 1x Bradford naibinin 2,5 mL'sine ekleyin.
  5. 10 dakika RT'de kuluçka.
  6. Her numunenin 200 μL çözeltisini bir ELISA plakasının kuyuya ekleyin (numune başına üç teknik kopya).
  7. Mikroplaka okuyucu kullanarak OD595'i ölçün.
  8. Degrade BSA çözeltisinin değerine göre standart eğriyi çizin ve tuzsuz protein örneklerinin konsantrasyonunu hesaplayın. Genellikle yaprakların 0.7 g'ından elde edilen toplam protein konsantrasyonu 3-6 mg/mL arasında değişmektedir.
  9. Sonraki afinite saflaştırma için tuzsuz protein ekstresi 6-8 mg hazırlayın.

8. Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesi

  1. 2 mL'lik bir tüpiçine 200 μL streptavidn-C1 konjuge manyetik boncuk alın.
  2. STREPTAvidn-C1 konjuge manyetik boncukları 1 mL RIPA lysis tamponu ile RT'de 1 dakika boyunca dengeleyin.
  3. Her yıkamadan sonra, 3 dakika boyunca boncukları adsorb ve yavaşça pipetleme tarafından çözelti kaldırmak için manyetik raf kullanın.
  4. 8.2 ve 8.3 adımlarını yineleyin.
  5. Tuzsuz protein ekstresini dengelenmiş streptavidn-C1 konjuge manyetik boncuklara aktarın.
  6. Tüpü 4 °C'de 12 saat (veya bir gece) için bir rotatörde kuluçkaya yatırın ve biyotinylated proteinleri arındırın.
  7. Boncuklar tüpün bir tarafında toplanana kadar 4 dakika boyunca RT'de manyetik bir rafta boncukları yakalayın ve ardından pipetle süpernatantı nazikçe çıkarın.
  8. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu I (sudaki %2 SDS) ekleyin ve 8 dk. Tekrar adım 8.3 için RT'de rotatorda tutun.
  9. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %0,1 deoksikolik asit [w/v], %1 Triton X-100) ekleyin ve 8 dk. tekrar adım 8.3 için RT'de rotator da saklayın.
  10. Tüpe 1,7 mL yıkama tamponu III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [w/v], %1 NP40 [v/v]) ekleyin ve 8 dk. RT'de rotatorda tutun 8,3 adımını tekrarlayın.
  11. Deterjanı çıkarmak için 50 mM Tris-HCl'nin (pH = 7,5) 1,7 mL'sini ekleyin ve 8.3 adımını tekrarlayın.
  12. Boncukları yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve 8.11 ve 8.3 adımlarını tekrarlayın.
  13. Boncukları 5 dk'lık 6x'lık her bir dakika boyunca 50 mM amonyum bikarbonat tamponuyla RT'de yıkayın.
  14. Manyetik boncuklara 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin ve iyice karıştırın.
  15. Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesini onaylamak için immünoblot analizi için 100 μL boncuk çıkarın. Tipik bir batı lekesi Şekil 3'tegösterilmiştir.
  16. Geri kalan protein örneklerini flash-freeze ve -80 °C'de depolanan veya kuru buz üzerinde LC-MS/MS analizi için hemen gönderin.
    NOT: Tipik MS sonuçları bir önceki yayında görüntülenir (Zhang ve ark. 2019; Şekil 2, Ek Veri 1 ve Ek Veri 2)11. Tüm veri kümeleri MassIVE mevcuttur (bulunan ) tanımlayıcı kullanarak: MSV000083018 ve MSV000083019.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Açıklanan protokole dayalı olarak beklenen sonuçları gösteren temsili veriler, Zhang ve ark11'denuyarlanmıştır. Şekil 1 N. benthamianaTurboID tabanlı PL gerçekleştirmek için prosedürleri özetler. Şekil 2, inmiş N. benthamiana yapraklarındaki protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunu göstermektedir. Şekil 3, sızmış yapraklarda biyotinylated proteinlerin verimli sonraki kütle spektrometresi analizi için zenginleştirilmiş olduğunu göstermektedir. Streptavidn-C1 konjuge manyetik boncuklar kullanılarak biyotinylated proteinlerin zenginleştirilmesinden sonra, çeşitli boyutlarda farklı proteinler yakalandı ve zenginleştirilmiş proteinlerin batı leke analizi nde lekeli bantlar gösterilmiş olduğu unutulmamalıdır (Şekil 3). Benzer gözlemler birkaç yeni yayınlanan çalışmalarda yapılmıştır6,7,13,14.

Figure 1
Şekil 1: N. benthamiana'daTurboID tabanlı PL yöntemine genel bakış. TurboID-füzyon yapılarını barındıran agrobacterium N. benthamiana yapraklarına sızdı. 36 saat post-infiltrasyon, 200 μM biotin turboid-erimiş hedef protein proksimal endojen proteinlerin biyotinylation başlatmak için aynı yapraklara sızmış. Sızmış bitkiler daha sonra RT'de 3-12 saat kuluçkaya yatırılır, ardından sıvı nitrojende yaprak hasat ve öğütme yapılır. Yaprak tozu RIPA lysis tampon içinde lysed, ve bir tuzsuzluk sütun protein ekstresi serbest biotin kaldırmak için kullanılır. Biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin konjuge boncuk ile saflaştırılmış ve kütle spektrometresi ile tespit edildi. Bu rakam Zhang ve ark11'denEk Şekil 3'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Adım 4.2'de elde edilen protein özlerinin immünoblot analizi. (A) Ha etiketine karşı antikor ile tarıma sızmış yapraklardan çıkarılan proteinlerin Batı leke analizi. (B) Streptavidin-HRP ile tarımsal sızmış yapraklarda biyotinylated proteinlerin Batı leke analizi. Bu rakam Zhang ve ark11Ek Şekil 6B uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesini doğrulamak için 8.15 adımda elde edilen boncukların Batı leke analizi. Her yapı için üç bağımsız çoğaltma vardır (1, 2 ve 3). Streptavidin-HRP farklı örneklerde biyotinylated proteinlerin analizi için kullanılmıştır. Bu rakam Zhang ve ark11'denEk Şekil 7'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TurboID biotin ligaz BioID10maya ekran tabanlı yönlendirilmiş evrim tarafından oluşturulur. Diğer PL enzimlerine göre birçok avantajı vardır. TurboID, optimum büyüme sıcaklığı 25 °C10civarında olan sinek ler ve solucanlar da dahil olmak üzere diğer model sistemlerine PL uygulamasına olanak sağlar. PL yaklaşımı hayvan sistemlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bitkilerde uygulanması sınırlıdır. Burada açıklanan protokol N. benthamianaTurboID tabanlı PL kurmak için bir adım adım prosedür sağlar , yaygın bitki-patojen etkileşim çalışmalarında kullanılan bir model bitki. Bu protokol yaprak numunesi hazırlanması, serbest biyotin çıkarılması, çıkarılan proteinlerin nicelleştirilmesi ve biyotinylated proteinlerin zenginleştirilmesi özetliyor.

Hayvan hücresi kültür sistemlerinde serbest biotin büyük ölçüde PBS tampon4ile hücreleri yıkanarak kaldırılabilir rağmen, yaprak dokusunda serbest biyotin basit yıkama ile temizlenebilir. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, serbest biyotinin biyotinylated proteinlerin sonraki zenginleştirme ciddi etkileyebilir gösterdi11. Bu protokolde, protein ekstrelerinde serbest biotinin başarılı bir şekilde çıkarılması için bir tuzsuzluk sütunu kullanılır ve biyotinylated proteinlerin streptavidin boncuklarına verimli bir şekilde bağlanmasını sağlar.

Ayrıca, bu protokol diğer tesis sistemlerinde PL yürütülmesi için önemli bir referans olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, üç rapor ArabidopsisTurboID tabanlı PL kullandık12,13,14 ve domates kıllı kökü12, N. benthamiana yanında burada açıklanan. Hayvan hücre kültür sistemlerine benzer şekilde, serbest biotin çıkarılması protein ekstraksiyonu 66öncesinde bitki protoplastları yıkanarak elde edilmiştir. Ancak, proteine entegre olmayan daha düşük miktarda serbest biyotin molekülleri hücrenin iç kesimlerinde mevcut, bu da biyotinylated proteinlerin sonraki zenginleşmesinin etkinliğini etkilenebilmiştir. Bu nedenle, serbest biotin tamamen çıkarılması için bir tuzsuzlama prosedürü tavsiye edilir, böylece biyotinylated proteinlerin kurtarma verimliliğini artırarak.

Kolon iki tür, PD-10 ve Zeba, ücretsiz biotin kaldırma için kullanılmıştır11,12,13,14. Yaprak proteini özlerinde serbest biotin kaldırma bu iki sütunun verimliliğini karşılaştırmak için gelecekte ilgi olabilir. Ayrıca, bu protokol geçici N. benthamiana yaprakları ilgi hedef protein ifade etmek için bir kanonik şırınga aracılı tarımsal filtrasyon yöntemi kullanır. Daha sonra, biotin substrat hedef protein eproksimal proteinleretiketleme için yaprakları n içine reinfiltrated. Benzer operasyonlar da diğer iki son raporçalışmalardakullanılmıştır 12,13. Alternatif bir yöntem olarak, biotin vakum aracılı infiltrasyon hem N. benthamiana ve Arabidopsis14için geçerlidir. Buna ek olarak, tarımsal filtrasyon için uygun olmayan bitkilerde, hücre kültürleri hedef protein ekspresyonu için dönüştürülebilir, ardından biotin tedavisi ve yakınlık etiketleme tonu12. Bu son çalışmalar, ÜFE'lerin incelenmesinde TurboID tabanlı PL'nin sağlamlığını desteklemiş ve farklı bitki türlerinde TurboID tabanlı PL'nin gelecekteki uygulamalarının temelini oluşturmuştur.

Bu protokolde, n. benthamiana'da iyi kurulmuş Agrobacteriumaracılı geçici ifade, ilgi çekici hedef proteinin PPI'larını belirlemek için kullanılmaktadır. Geçici ifade füzyon proteinlerinin aşırı ekspresyonuna yol açabilir. Bu nedenle, daha uygun bir alternatif yerli bir organizatörün kontrolü altında TurboID füzyon mühendisi ve agroinfiltrasyon veya kararlı transgenik hatları n üretimi ile ifade etmektir. Genom düzenleme teknolojisinin gelişmesiyle, TurboID parçasını doğrudan ilgi çekici genlerin yerli genomik loci'ne vurmak da mümkündür.

Göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli faktör turboid füzyon ilgi hedef protein işlevini değiştirmez sağlamaktır. Bir önceki çalışmada, TURBOID erimiş NLR bağışıklık reseptörünün fonksiyonu Tütün mozaik virüs p50 effector11varlığında savunma aracılı hücre ölümü neden yeteneğini test ederek doğrulandı . TurboID GFP'den nispeten daha büyüktür (yani, 35 kDa) ve hedef proteine füzyonu hedef proteinin işlevini etkileyebilir. Bu gibi durumlarda, küçük miniTurboID10 kullanılabilir.

Ayrıca, hedef proteinin hangi terminusunun TurboID ile kaynaşmaya uygun olduğunu belirlemek de önemlidir. Bu tür fonksiyonel testler için genel bir yaklaşım TurboID füzyon hedef genin mutant bitki hattı tamamlayacak olup olmadığını belirlemektedir. Alternatif olarak, turboid füzyonunun hedef proteinin daha önce bilinen bir etkileşim ortağı ile etkileşiminin analizi kullanılabilir. Çoğu durumda, sitoplazmik proteinler için TurboID'nin N-terminal veya C-terminal etiketlemesi sonraki kütle spektrometresi analizinde karşılaştırılabilir veri kümeleri üretebilir. Ancak, membran lokalize proteinler için, vektör konstrüksiyonönce topoloji belirlemek önemlidir. Aksi takdirde, TurboID'nin ilgi çekici genlerin kodlama dizisinin yukarı veya aşağı akışıile füzyonu tamamen farklı sonuçlar doğuracaktır. Bu nedenle membran lokalize proteinlerin N-terminus veya C-terminusunun karşı karşıya olan taraflarını (örn. sitoplazmik veya lümen eki) belirlemek önemlidir. Bu, hedef proteinin beklenen proksimal prteomuelde edilmesini sağlar.

PL geçici veya zayıf PPI tespit etmek için geleneksel IP-MS yaklaşımları üzerinde çeşitli avantajları olmasına rağmen, kendi içsel sınırlamaları vardır. İlk olarak, bir aday etkileşim proteinlerinin belirlenmesi hemen yem proteini ile doğrudan veya dolaylı etkileşim anlamına gelmez, ama sadece yakın yakınlık yansıtır2. Bu nedenle, bağımsız in vivo tahliller (yani, ko-immünopredasyon, bimoleküler floresan kompleman [BiFC], veya in vitro GST-aşağı tahlil) daha fazla PPIs doğrulamak için yapılabilir.

İkinci olarak, çeşitli nedenlerle PL testinden yanlış negatifler veya yanlış pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir. Örneğin, yanlış negatifler zaman protein erişilebilir birincil aminler eksik oluşabilir. Buna ek olarak, bitkilerde BIN2 interaktörlerin son çalışmalar iki deney13verileri arasında kısmi bir örtüşme gösterdi , yetersiz MS kapsama nedeniyle yanlış negatif sonuçların varlığını gösteren. Hedef proteinin bazı interaktörler de zayıf TurboID-erimiş kontrol tarafından biyotinylated olabilir, kesme eşiği altında bir kat zenginleştirme ile sonuçlanan ve sonunda bazı gerçek interaktörlerin kaybı13,14. Bu nedenle, uygun kontroller ve kesme değerleri ile yeterli biyolojik çoğaltmalar yanlış negatiflerin sayısını en aza indirmek için ayarlanmalıdır11,14.

Ayrıca, uzun bir biyotin tedavi süresi nonspesifik proteinlerin biyotinylation artırabilir, yanlış pozitif sonuçlanan10. Bu nedenle, nonspesifik biyotinylation azaltmak için in vivo etiketleme zaman pencerelerini optimize etmek önemlidir, aynı zamanda analiz için biyotinylated proteinlerin üretimini etkilemez iken11,12,13,14. Buna ek olarak, sert ekstraksiyon ve sıkı yıkama koşulları boncuk17proteinlerin nonspesifik bağlanmasından elde edilen yanlış pozitif azaltmak için tavsiye edilir. Yukarıda açıklanan uyarılar yanı sıra, uygun bir negatif kontrol tasarımı yanlış interactors gerçek interactors ayırt etmek ve gerçek interactors11,12,,13,14eksik önlemek için çok önemlidir.

TurboID bioid 10 ,,11göre büyük10ölçüde geliştirilmiş etiketleme kinetik gösterdi. Ancak, bu da PL analizi sırasında daha yüksek bir arka plan yol açabilir. Bu nedenle, arka plan sinyallerini ortadan kaldırmak için uygun denetimler eklenmelidir. Biz bu protokol11sitrin-erimiş TurboID kullanılan ve benzer bir kontrol önceki çalışmalarda kullanılmıştır18. Belirli bir organel membran lokalize hedef proteinler için, TurboID aynı organel membran hedefleyen bir sinyal peptid ile eritme TurboID sitoplazma14ifade edilen bir ile eritme turboid daha iyi bir kontrol yapar.

Ayrıca, diğer ortaklarla etkileşimlerini belirleyen hedef proteindeki anahtar etki alanı veya amino asitler hakkında bilgi biliniyorsa, TurboID'nin anahtar etki alanında bir mutasyon la bir hedef proteinle kaynaşması en iyi kontrol olmalıdır ve hedef protein tarafından üretilen arka plan sinyallerini en üst düzeye çıkaracaktır. Buna ek olarak, TurboID enzimleri belirli sıcaklıkların yanı sıra uygun pH koşullarını gerektirir. ER, çekirdek ve mitokondri gibi hücredeki çoğu organeller için TurboID proksimal proteinleri başarıyla10olarak etiketledi. Ancak, bazı özel organeller (yani, bitki hücrelerinde vakuoller, olan pH çok düşük19) PL yaklaşımı kullanarak PPIs eğitimi için uygun olmayabilir. Ayrıca, stres tepkisi sırasında hücre altı ortamın pH düzeylerindeki veya oksidasyon azaltma durumlarındaki değişiklikler TurboID'nin etiketleme verimliliğini etkileyebilir.

Özetle, burada açıklanan protokol N. benthamianaTurboID kullanarak PPI araştırmak için temel sağlamak , yaygın bitki biyolojisi birçok açıdan kullanılan bir model bitki sistemi20. Arabidopsis bitkileri ve domates kıllı,kökleri12,13,14son zamanlarda açıklanan TurboID tabanlı PL çalışmaları ile, bu yöntem diğer bitki türleri için geçerli hale gelmesi beklenmektedir. Turboid tabanlı PL'nin bitki biyolojisi araştırmalarında PPI'ların incelenmesinde önemli bir rol oynayacağı tahmin edilebilen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Transgenik Bilim ve Teknoloji Programı (2019ZX08010-003-003'ten Y.Z.'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31872637'den Y.Z.'ye) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2019TC028-Y.Z.) ve NSF-IOS-1354434,. NSF-IOS-1339185 ve NIH-GM132582-01 Için S.P.D.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26, (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17, (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196, (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8, (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8, (1), 9212 (2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9, (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19, (1), 326 (2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36, (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10, (1), 3252 (2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6, (10), 26468 (2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9, (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24, (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6, (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56, (1), 405-426 (2018).
Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).More

Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter