La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de próxima generación (ChIP-seq) es un método utilizado para establecer interacciones entre los factores de transcripción y las secuencias genómicas que controlan. Este protocolo describe técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, utilizando Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bacteriano como ejemplo.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación (ChIP-seq) es una técnica que se puede utilizar para descubrir los objetivos reguladores de los factores de transcripción, las modificaciones de la histona y otras proteínas asociadas al ADN. Los datos ChIP-seq también se pueden utilizar para encontrar la unión diferencial de factores de transcripción en diferentes condiciones ambientales o tipos de células. Inicialmente, ChIP se realizaba a través de la hibridación en un microarray (ChIP-chip); sin embargo, ChIP-seq se ha convertido en el método preferido a través de avances tecnológicos, la disminución de las barreras financieras a la secuenciación y cantidades masivas de producción de datos de alta calidad. Las técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, una fuente importante de infecciones persistentes y crónicas, se describen en este protocolo. ChIP-seq se realiza en Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas, apuntando al regulador maestro de biopelícula, CsgD, para determinar la unión diferencial en los dos tipos de células. Aquí, demostramos la cantidad adecuada de biopelícula para cosechar, normalizando a una muestra de control planctónica, homogeneizando el biofilm para el acceso entre enlaces y realizando pasos rutinarios ChIP-seq para obtener resultados de secuenciación de alta calidad.
Las biopelículas bacterianas, los agregados estructurales de las células incrustadas en una matriz autoproducida, son resistentes a la desecación, los antibióticos y las respuestas inmunitarias del huésped1. Como tal, causan infecciones persistentes y crónicas y presentan desafíos únicos a los investigadores debido a sus soluciones a la supervivencia y la transmisión. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) se ha encontrado para establecer poblaciones fenotípicamente heterogéneas de agregados de biopelículas que son resistentes a la desecación y antibióticos, y células planctónicas que expresan factores de virulencia en el cultivo puro cuando se exponen al estrés ambiental (28 oC, limitando los nutrientes)2. Estos dos tipos de células surgen debido a la expresión biestable del regulador maestro de biopelícula, CsgD3. Hemos planteado la hipótesis de que esta puede ser una estrategia de cobertura de apuestas para Salmonella,donde las células planctónicas participan en la transmisión a corto plazo y las células de biopelícula son capaces de persistir a largo plazo en el medio ambiente hasta que surja una oportunidad de infectar a un nuevo huésped2,4. Muchos de los elementos reguladores que controlan la expresión csg operon están bien caracterizados5. Sin embargo, aparte de adrA y el csg operon6, se conocen pocos objetivos reglamentarios de CsgD. Identificar la red reguladora de CsgD nos ayudaría a comprender mejor el ciclo de vida de Salmonella y el papel que desempeñan las biopelículas en la transmisión.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) es una potente técnica in vivo para la identificación de interacciones proteína-ADN en todo el genoma y proporciona información sobre procesos reguladores que implican factores de transcripción, modificaciones de histona o nucleosomas7. Estudios más recientes han utilizado esta técnica para evaluar la unión diferencial a proteínas entre las condiciones de crecimiento y los tipos de células8. En la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), los fragmentos de ADN con proteínas que interactúan se enriquecen a través de la selección de anticuerpos de las proteínas diana. Las células se cosechan y las proteínas de unión al ADN se retuercen al ADN in vivo a través del tratamiento entre lancantes formaldehide. Las células se lysed, liberando el contenido celular, y la cromatina se cizalla en aproximadamente 200–600 bp fragmentos7. Los fragmentos de ADN unidos a la proteína diana se inmunoprecipitan mediante anticuerpos y se aíslan por la desvinculación seguida de la digestión proteica9. Estos fragmentos de ADN representan sitios de unión a proteínas emparejados por hibridación a un microarray (ChIP-chip) o mediante secuenciación profunda y mapeo a la secuencia del genoma10,11. Aunque los experimentos con chip ChIP producen datos reglamentarios adecuados, son limitados debido al uso de sondas costosas, así como la hibridación y el sesgo de matriz12. ChIP-seq tiene un rango dinámico más grande con mayor resolución y cobertura de nucleótidos, mejor relación señal-ruido, y menos artefactos en comparación con ChIP-chip7.
ChIP se ha utilizado para analizar la regulación Sfh y OmpR en Salmonella serovar Typhimurium13,14, regulación AphA con sensación de quórum en Vibrio alginolyticus15, Regulación RpoS en Escherichia coli16, regulador de virulencia Regulación EspR en Mycobacterium tuberculosis17, posibles citoclasas de dicguanilato a través de la regulación AmrZ en Pseudomonas aeruginosa18, así como VraSR regulación en Staphylococcus aureus19. Los experimentos bacterianos ChIP-seq que se han descrito comienzan con el crecimiento de células en medios líquidos y la cosecha en forma de una sola célula. Sin embargo, el análisis de las biopelículas y la correspondiente regulación genética representan un nuevo conjunto de desafíos para generar un protocolo ChIP-seq exitoso. En este protocolo, ChIP-seq se utiliza para encontrar objetivos regulatorios diferenciales de CsgD, la S. Regulador de biopelícula maestro Typhimurium en biopelículas y tipos de células planctónicas. Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las cantidades apropiadas de biopelícula para ChIP-seq, la biopelícula de cosecha del cultivo del matraz, normalizar muestras de biopelícula y control de células únicas, homogeneizar el biofilm y la inmunoprecipitación completa. Esto será útil para el estudio de los objetivos reguladores en biopelículas bacterianas y se puede adaptar para muchas especies.
Este protocolo describe una técnica para realizar ChIP-seq con Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas de cultivo puro, para encontrar objetivos reguladores del regulador maestro de biopelículas, CsgD. Esperamos información de unión diferencial debido a la biestabilidad de CsgD en los dos tipos de células, con altos niveles en agregados de biopelículas y niveles bajos en células planctónicas2,3. Sin embargo, esta técnica también se puede aplicar a otros factores de transcripción bacteriana, tipos de células o condiciones de crecimiento. En particular, esta técnica se puede adaptar a otras biopelículas bacterianas utilizando un factor de conversión experimentalmente determinado para la CFU por unidad de peso de las células de biopelícula.
ChIP-seq puede ser propenso a la amplificación de errores técnicos a través de la secuenciación; sin embargo, la confirmación en pasos críticos puede prevenir este27. La especificidad primaria de los anticuerpos es importante para seleccionar sólo el factor de transcripción objetivo y el ADN que controla durante la inmunoprecipitación7. En este experimento, csgD se fusionó con una etiqueta 3xFLAG codificada por plásmido en el extremo 3′ del gen, correspondiente al término C de CsgD22. El plásmido p3xFLAG sin csgD se utilizó como un “control” (S. Typhimurium 14028 écsgD + p3xFLAG). Las directrices ENCODE recomiendan realizar inmunoblots con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, y lisados de cepas ChIP y cepas de deleción21. Es importante asegurarse de que las condiciones de crecimiento sean coherentes entre las réplicas para reducir la variabilidad en los resultados de unión de factores de transcripción y secuenciación posterior. Si uno es cuidadoso para asegurar que los tamaños de inóculo y las condiciones de crecimiento pre-inóculo sean consistentes, el crecimiento de biopelículas en el cultivo del matraz es consistente4. Es importante confirmar que todo el biofilm se ha roto después de la homogeneización, para garantizar el acceso igualitario de los reactivos, particularmente el enlace cruzado formaldehído, a todas las células.
Varias modificaciones pueden permitir a los investigadores utilizar este protocolo para otras proteínas de unión al ADN, tipos de células, cepas, condiciones de crecimiento o equipos de laboratorio. Si se utiliza para especies formadoras de biopelículas que no sean S. Typhimurium, el factor de conversión de las unidades formadoras de colonias por unidad de peso de biopelícula, debe determinarse experimentalmente mediante la recolección de diferentes cantidades de biopelícula, la homogeneización completa de la biopelícula y la realización de diluciones en serie y el recuento de placas para crear una curva estándar, que puede no ser precisa en pesos de biopelícula inferiores2. La transferencia de energía del Sonicador y la resistencia al tipo de célula pueden diferir; por lo tanto, se recomienda un ensayo de sonicación para encontrar el número de ráfagas de sonicación que producirán el rango de tamaño de fragmento necesario para la preparación y secuenciación de la biblioteca aguas abajo11. La fragmentación de la cromatina por nucleasa microcócica es una alternativa a la sonicación que produce una alta resolución de los sitios de ocupación; sin embargo, este método puede introducir sesgo de fragmentación7,28. El rango de tamaño de ADN puede modificarse dependiendo de los kits de preparación de bibliotecas posteriores y las plataformas de secuenciación. Otros métodos de homogeneización se pueden utilizar en lugar del molino mezclador. Por ejemplo, un homogeneizador de tejido de vidrio puede ser sustituido, pero puede aerosolizarse o romper incompletamente el biofilm. En términos de controles, el ADN pre-inmunoprecipitado se puede normalizar en el procesamiento y análisis posteriores a la secuenciación. También se puede utilizar como control13un control de IP simulado con suero de anticuerpos normales emparejado con especies.
Los investigadores deben tener en cuenta las limitaciones a este método al considerar un experimento ChIP-seq. Pueden ser necesarias modificaciones significativas para adaptarla a otros tipos de biopelículas. Por ejemplo, con Salmonella Typhimurium la suspensión inmediata de biopelícula en PBS conduce a una pérdida mensurable de agregados de biopelícula. La inmunoprecipitación dirigida a los objetivos reguladores de los factores de transcripción en bacterias puede resultar en cantidades muy pequeñas de ADN, lo que es un desafío para la purificación y detección en pasos posteriores. El sesgo se puede introducir durante el cizallamiento y la manipulación aguas abajo durante la detección de la biblioteca9. Además, este método no revela los niveles de expresión in vivo en respuesta a la unión del factor de transcripción. Los investigadores que tienen poca experiencia en bioinformática pueden ser desafiados por la canalización de análisis. Este método puede ser costoso y de tiempo intensivo; sin embargo, el costo de la secuenciación es a menudo menor que un microarray y está disminuyendo con el tiempo a medida que se siguen realizando mejoras tecnológicas.
Pocos métodos en la literatura describen ChIP con bacterias, y la mayoría de los experimentos bacterianos comienzan con una condición de crecimiento simple13,14,15,17,18. La preparación de muestras ChIP con células individuales es sencilla y presenta menos desafíos que la preparación de muestras ChIP con agregados de biopelícula. En cuanto a ChIP-seq, los métodos anteriores de estudio de los circuitos cis-reglamentarios, incluida la evolución sistemática de los ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), los ensayos de cambio de movilidad electroforético (EMSA), ChIP-chip, la eliminación del promotor y el análisis de reporteros han sido complementados o reemplazados por ChIP-seq29. ChIP-seq está reemplazando ChIP-chip debido al avance de las tecnologías y la disponibilidad de secuenciación. La secuenciación profunda proporciona a los investigadores cantidades masivas de datos que pueden identificar sitios con menor afinidad de enlace y mayor resolución de par base con menos material de partida que ChIP-chip11,30. El análisis de los datos de ChIP de organismos con genomas de referencia de alta calidad es generalmente rápido y específico. Además, ChIP-seq es un método exhaustivo para descubrir en silico sitios de enlace predichos que pueden no estar ocupados en todos los tipos de células, fase de crecimiento, o condiciones ambientales31.
En el futuro, este protocolo se puede utilizar para facilitar la comprensión de la patogénesis bacteriana, en particular los organismos formados por biopelículas. La amplia adopción de esta técnica y la disponibilidad de nuevos conjuntos de datos pueden conducir a la integración de datos para identificar grupos de proteínas que se colocalizan para controlar los procesos celulares en microorganismos formadores de biopelículas32. Además, los datos ChIP-seq y RNA-seq se pueden integrar para construir modelos de sistema regulador33.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) (#2017-05737) a AW y a través de la Cátedra Jarislowsky en Biotecnología. MP fue apoyado por una beca NSERC-CREATE a través del Programa Integrado de Capacitación en Enfermedades Infecciosas, Seguridad Alimentaria y Políticas Públicas (ITraP) en la Universidad de Saskatchewan.
Los autores quieren agradecer a Dani Dale por el rodaje y la edición.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |