Summary
La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de próxima generación (ChIP-seq) es un método utilizado para establecer interacciones entre los factores de transcripción y las secuencias genómicas que controlan. Este protocolo describe técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, utilizando Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bacteriano como ejemplo.
Abstract
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación (ChIP-seq) es una técnica que se puede utilizar para descubrir los objetivos reguladores de los factores de transcripción, las modificaciones de la histona y otras proteínas asociadas al ADN. Los datos ChIP-seq también se pueden utilizar para encontrar la unión diferencial de factores de transcripción en diferentes condiciones ambientales o tipos de células. Inicialmente, ChIP se realizaba a través de la hibridación en un microarray (ChIP-chip); sin embargo, ChIP-seq se ha convertido en el método preferido a través de avances tecnológicos, la disminución de las barreras financieras a la secuenciación y cantidades masivas de producción de datos de alta calidad. Las técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, una fuente importante de infecciones persistentes y crónicas, se describen en este protocolo. ChIP-seq se realiza en Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas, apuntando al regulador maestro de biopelícula, CsgD, para determinar la unión diferencial en los dos tipos de células. Aquí, demostramos la cantidad adecuada de biopelícula para cosechar, normalizando a una muestra de control planctónica, homogeneizando el biofilm para el acceso entre enlaces y realizando pasos rutinarios ChIP-seq para obtener resultados de secuenciación de alta calidad.
Introduction
Las biopelículas bacterianas, los agregados estructurales de las células incrustadas en una matriz autoproducida, son resistentes a la desecación, los antibióticos y las respuestas inmunitarias del huésped1. Como tal, causan infecciones persistentes y crónicas y presentan desafíos únicos a los investigadores debido a sus soluciones a la supervivencia y la transmisión. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) se ha encontrado para establecer poblaciones fenotípicamente heterogéneas de agregados de biopelículas que son resistentes a la desecación y antibióticos, y células planctónicas que expresan factores de virulencia en el cultivo puro cuando se exponen al estrés ambiental (28 oC, limitando los nutrientes)2. Estos dos tipos de células surgen debido a la expresión biestable del regulador maestro de biopelícula, CsgD3. Hemos planteado la hipótesis de que esta puede ser una estrategia de cobertura de apuestas para Salmonella,donde las células planctónicas participan en la transmisión a corto plazo y las células de biopelícula son capaces de persistir a largo plazo en el medio ambiente hasta que surja una oportunidad de infectar a un nuevo huésped2,4. Muchos de los elementos reguladores que controlan la expresión csg operon están bien caracterizados5. Sin embargo, aparte de adrA y el csg operon6, se conocen pocos objetivos reglamentarios de CsgD. Identificar la red reguladora de CsgD nos ayudaría a comprender mejor el ciclo de vida de Salmonella y el papel que desempeñan las biopelículas en la transmisión.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) es una potente técnica in vivo para la identificación de interacciones proteína-ADN en todo el genoma y proporciona información sobre procesos reguladores que implican factores de transcripción, modificaciones de histona o nucleosomas7. Estudios más recientes han utilizado esta técnica para evaluar la unión diferencial a proteínas entre las condiciones de crecimiento y los tipos de células8. En la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), los fragmentos de ADN con proteínas que interactúan se enriquecen a través de la selección de anticuerpos de las proteínas diana. Las células se cosechan y las proteínas de unión al ADN se retuercen al ADN in vivo a través del tratamiento entre lancantes formaldehide. Las células se lysed, liberando el contenido celular, y la cromatina se cizalla en aproximadamente 200–600 bp fragmentos7. Los fragmentos de ADN unidos a la proteína diana se inmunoprecipitan mediante anticuerpos y se aíslan por la desvinculación seguida de la digestión proteica9. Estos fragmentos de ADN representan sitios de unión a proteínas emparejados por hibridación a un microarray (ChIP-chip) o mediante secuenciación profunda y mapeo a la secuencia del genoma10,11. Aunque los experimentos con chip ChIP producen datos reglamentarios adecuados, son limitados debido al uso de sondas costosas, así como la hibridación y el sesgo de matriz12. ChIP-seq tiene un rango dinámico más grande con mayor resolución y cobertura de nucleótidos, mejor relación señal-ruido, y menos artefactos en comparación con ChIP-chip7.
ChIP se ha utilizado para analizar la regulación Sfh y OmpR en Salmonella serovar Typhimurium13,14, regulación AphA con sensación de quórum en Vibrio alginolyticus15, Regulación RpoS en Escherichia coli16, regulador de virulencia Regulación EspR en Mycobacterium tuberculosis17, posibles citoclasas de dicguanilato a través de la regulación AmrZ en Pseudomonas aeruginosa18, así como VraSR regulación en Staphylococcus aureus19. Los experimentos bacterianos ChIP-seq que se han descrito comienzan con el crecimiento de células en medios líquidos y la cosecha en forma de una sola célula. Sin embargo, el análisis de las biopelículas y la correspondiente regulación genética representan un nuevo conjunto de desafíos para generar un protocolo ChIP-seq exitoso. En este protocolo, ChIP-seq se utiliza para encontrar objetivos regulatorios diferenciales de CsgD, la S. Regulador de biopelícula maestro Typhimurium en biopelículas y tipos de células planctónicas. Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las cantidades apropiadas de biopelícula para ChIP-seq, la biopelícula de cosecha del cultivo del matraz, normalizar muestras de biopelícula y control de células únicas, homogeneizar el biofilm y la inmunoprecipitación completa. Esto será útil para el estudio de los objetivos reguladores en biopelículas bacterianas y se puede adaptar para muchas especies.
Protocol
1. Crecimiento de células de cultivo de frascos
- A partir de caldos congelados, las cepas de Salmonella serovar Typhimurium en el agar LB (20 ml de medios sólidos en placa Petri de 100 mm) con el antibiótico adecuado e incuban a 37oC durante 16-20 h para obtener colonias aisladas.
- Inocular caldo LB de 5 ml que contiene el antibiótico adecuado en un tubo de cultivo de borosilicato de 25 mm x 150 mm con 1-3 colonias de placas de rayas del paso 1.1. Incubar a 37oC con agitación a 200 rpm durante 7 h.
- Mida OD600 de cultivo de caldo utilizando un espectrofotómetro. Diluir una alícuota del cultivo 1 en 4 en PBS en una cubeta de 2 ml y medir la absorbancia a 600 nm. Hemos encontrado que el factor más crítico en este paso es el momento del crecimiento. Los valores OD se utilizan para normalizar los cultivos para entregar el número deseado de celdas en el paso 1.4.
- Añadir el volumen de 1,0 OD600 equivalente del cultivo celular (es decir, 109 células) a un matraz Erlenmeyer que contenga 100 ml de 1% de triptona con el antibiótico adecuado. Incubar a 28oC con agitación a 200 rpm durante 13 h.
Nota: Las células de Biofilm aparecerán como escamas agregadas y las células planctónicas individuales están en los medios turbios.
2. Recolección sin células acondicionado 1% triptona
- Recoger el cultivo de matraz para sin células acondicionado 1% tryptone. Cultivo de matraz de pipeta varias veces para mezclar antes de añadir a un tubo de centrífuga.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min a 10oC para peletizar todas las células.
- Decant sobrenadante en una unidad de filtro de 0,2 m, filtro de vacío y dispensa en un tubo nuevo.
Nota: Los agregados de Biofilm son adherentes en soluciones convencionales (por ejemplo, PBS) y se adhieren a los lados de los tubos y las puntas de las pipetas. Dado que permite una manipulación más fácil, utilizamos medios acondicionados (1% de triptona) para mover biopelícula inicialmente y utilizar PBS caliente inmediatamente antes de la reticulación (paso 4.5) para eliminar cualquier sustrato reticulado de proteínas que pueda estar presente en los medios.
3. Separar el biofilm y las células planctónicas de los cultivos matraz2
- Utilizando una pipeta estéril de 25 ml, el cultivo de matraz de alícuota en tubos de 15 ml. Centrífuga a velocidad lenta (210 x g) durante 2 min, para separar los dos tipos de celda.
Nota: Las células de Biofilm deben formar un pellet suelto en la parte inferior del tubo - Pipetear el sobrenadante que contiene células planctónicas en dos tubos centrífugos de 40 ml para más adelante (paso 5). Retire todo el líquido restante, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Repita el proceso hasta que los tipos de celda se hayan separado de todos los medios de cultivo del matraz.
4. Preparación de agregados de biopelículas
Nota: La biopelícula se cosecha por peso húmedo para producir 25 g de ADN, el material de partida mínimo recomendado para ChIP. El factor de conversión de Biofilm (BCF) de S. Typhimurium es 1.73 x 108 CFU/mg2. Los investigadores que preparen otros tipos de biopelículas tendrán que definir empíricamente el número de células por unidad de peso de biopelícula, que se utiliza para encontrar el peso de la biopelícula necesaria para 25 g de material de partida de ADN utilizando esta ecuación:
- Pesar con precisión una tapa de presión de 2 ml o un tubo de tapa de tornillo.
- Resuspenda el pellet de biopelícula en 1 ml de triptona condicionada. Mueva la biopelícula resuspendida en una tapa de presión de 2 ml o un tubo de tapa de tornillo prepesados.
- Centrífuga durante 1 min a 11 000 x g a 20oC
- Retire con cuidado todo el sobrenadante del tubo y pese el tubo con precisión. Restar el peso del tubo del peso del tubo con biopelícula para encontrar el peso de la biopelícula. Debe ser del 10% del peso de la biopelícula objetivo.
- Lave las células para eliminar la triptona condicionada restante. Añadir 1 ml de PBS caliente al tubo y al vórtice suavemente para resuspender el pellet. Centrífuga durante 3 min a 8 000 x g a biopelícula de pellets y retire el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBS al tubo y al vórtice para resuspender el pellet.
5. Preparación de células planctónicas
- Registre el volumen y la OD600 del sobrenadante planctónico a partir de centrifugación de velocidad lenta (paso 3.2) utilizando un espectrofotómetro
- Calcule el volumen requerido para un ODfinal 600 de 6.0:
- Enfriar la centrífuga a 10oC y las células planctónicas de sedimentos por centrifugación (10.000 x g,10 min a 10oC)
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el volumen final de PBS calculado en el paso 5.2.
- Remeasure la OD600 de las células plancttónicas utilizando un espectrofotómetro y dispensar el volumen de 6.0 OD600 células planctónicas en una tapa de presión de 2 ml o tubo de tapa de tornillo.
- Lleve el volumen a 1 ml con PBS.
6. Homogeneización de células
- Añadir una perla de acero inoxidable esterilizado de 5 mm a cada uno de los tubos.
- Homogeneizar utilizando un molino mezclador durante 5 min a 30 Hz. Observe los tubos agregados para confirmar que el biofilm se ha roto.
- Transfiera las células homogeneizadas a un nuevo tubo de 1,5 ml, evitando el cordón metálico. Lleve el volumen a 1 ml con PBS.
Nota: Realice diluciones en serie para enumerar las celdas de entrada y compruebe que el número de celda final está cerca del número deseado o predicho.
7. La retitulación de proteínas al ADN
- Dispensar formaldehyde fresco en tubos de muestra a una concentración final del 1%. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria.
Precaución: El formaldehído es corrosivo, una piel, un ojo e irritante respiratorio, e inflamable. Dispensar en una capucha de humo. - Añadir 1 M de glicina a una concentración final de 125 mM para detener el entrecruzado. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria.
8. Lavar las celdas para eliminar el exceso de retitulador cruzado
- Sedimenta las células a 8.000 x g durante 3 min y retira el sobrenadante
- Resuspenda el gleta en 20 sL de 25 inhibidores de la proteasa y 500 l de PBS esterilizado por filtro.
- Tubo centrífugo durante 3 min a 8000 x g y retire el sobrenadante.
9. Células de lisiado
- Resuspenda el pellet en un tampón de Lysis de 600 ol (consulte la Tabla 1)e incubar sobre hielo durante 10 min.
- Agregue 1,4 ml de búfer de dilución IP (consulte la Tabla 1) a un tubo estéril de 15 ml y mueva las células lysed al tubo de 15 ml. Mantenga el tubo sobre hielo durante 1,5–2 h, y vórtice suavemente y ocasionalmente.
Nota: Algunos materiales celulares resistentes pueden permanecer en tubos. Un largo período de incubación sobre hielo con vórtice ocasional romperá el material. El resto se romperá a través de la sonicación.
10. Fragmentación del ADN por sonicación
- Coloque el tubo de 15 ml en un vaso de hielo y coloque la sonda de 3 mm dentro del tubo.
- Realiza 5 rondas de sonicación de 30 s en 20-40% de 400 W con 2 minutos de enfriamiento en hielo entre ráfagas.
- Material precipitado por sedimento por centrifugación (8000 x g,10 min a 4oC). Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Opcionalmente, realice el desenlace a 65 oC durante 30-60 min y digiere el ARN y la proteína a 45 oC durante 30-60 min antes de correr con un gel de agarosa del 2% para comprobar si hay fragmentos de tamaño adecuado.
Nota: Sumerja la sonda en el caso de la célula. Mantenga la solución en hielo mientras sonica y descansa. No retire el tubo mientras la sonda sónica esté pulsando. La solución debe aparecer en la presonicación turbia y una clara post-sonicación.
11. Complejos inmunoprecipitados de anticuerpos de PROTEÍNA-ADN
- Preparación
- Dispensar una alícuota de 1,35 ml para inmunoprecipitación y una alícuota de 200 l como control de entrada. Almacene el control de entrada a -80 oC hasta que se realicen los pasos de desentrelazado y digestión.
- Inmunoprecipitación con anticuerpo primario
- Añadir 10 g de anticuerpo primario específico de proteína purificada a la alícuota de 1,35 ol. Incubar durante la noche a 4oC en una rueda giratoria.
Nota: El anticuerpo primario puede ser un anticuerpo monoclonal, suero policlonal de alta calidad o anticuerpo epítopo comercial (es decir, anti-FLAG). - Añadir 50 s de perlas magnéticas de proteína G a los tubos del paso 11.2.1 e incubar a 4 oC durante 3 h en una rueda giratoria.
- Coloque el búfer de lavado IP 1, el búfer de lavado IP 2 y EL pH 8.0 (consulte la Tabla 1)en un cubo de hielo. Tampón de elución caliente a 65 oC.
Nota: No coloque la solución que contenga el tampón de elución en el hielo. - Enlazar las perlas magnéticas de proteína G al lado de los tubos utilizando un soporte magnético
- Realizar lavados: lavar 2x con tampón de lavado de IP frío de 750 ml 1, lavar 1x con tampón de lavado de IP frío de 750 l 2 y lavar 2 x con TE frío de 750 l a pH 8.0. Mantenga los tubos en el soporte magnético durante los lavados.
- Añadir 450 l de búfer de elución IP (consulte la Tabla 1) a cada tubo e incubar a 65 oC durante 30 minutos con un suave vórtice cada 5 min.
- Enlazar las perlas al lado de los tubos usando un soporte magnético. Espere al menos 2 minutos hasta que la solución esté clara.
- Dispensar el sobrenadante despejado a un nuevo tubo de 1,5 ml, teniendo cuidado de no molestar el pellet de perlas magnéticas.
- Añadir 10 g de anticuerpo primario específico de proteína purificada a la alícuota de 1,35 ol. Incubar durante la noche a 4oC en una rueda giratoria.
12. Desentrelazando los complejos de proteínas de ADN y digieris el ARN y las proteínas co-purificantes
- Añadir 2 g de RNase A y NaCl a una concentración final de 0,3 M a cada tubo.
- Incubar a 65oC, durante 6 h o durante la noche.
- Completa la digestión proteica añadiendo 180 g de Proteinase K a cada tubo, luego incubando a 45oC durante 3-5 h.
13. Preparación y secuenciación de la biblioteca
- Purificar el ADN usando cuentas magnéticas
Nota: Los perlas magnéticas son preferidas para aislar las pequeñas cantidades de ADN generalmente recuperadas durante ChIP con células bacterianas. - Prepare bibliotecas utilizando un kit compatible con la plataforma de secuenciación seleccionada.
- Compruebe la concentración de la biblioteca con un fluorómetro y un kit dsDNA de amplia gama o un kit de cuantificación de la biblioteca qRT-PCR.
Nota: En nuestra experiencia, las mediciones del fluorómetro pueden sobreestimar la concentración de ADN. - Bibliotecas de grupos, que tienen en cuenta la cobertura adecuada para cada muestra de biblioteca. Para la secuenciación de Illumina con Salmonella,agrupamos de 10 a 12 bibliotecas. Añadir Tris-HCl pH 8.0 a una concentración final de 1 mM.
- Secuencia de acuerdo con las especificaciones de la plataforma seleccionada.
Representative Results
La preparación de muestras de inmunoprecipitación de cromatina a partir de biopelícula bacteriana implica varios pasos, como se muestra en la Figura 1. Estos incluyen el cultivo de biopelículas en el cultivo de matraz, la recolección de medios acondicionados, la recolección de una cantidad adecuada de biopelícula y células planctónicas como control, lavado de células en PBS, homogeneización, proteínas reticulantes al ADN, lisiamiento de células, fragmentación del ADN por sonicación, inmunoprecipitación de ADN con los anticuerpos adecuados y cuentas de proteína G, lavado y elución de ADN inmunoprecipitado, y purificación del ADN inmunoprecipitado para la preparación y la secuenciación de la biblioteca.
S. Las células de Typhimurium cultivadas en cultivos líquidos en condiciones de inducción de biopelículas se someten a cambio según el fenotipo para formar agregados de biopelícula multicelular y células planctónicas. Esta población contendrá aproximadamente un 40% de agregados de biopelícula, que expresan niveles más altos de temperaturas dinilosas (DCC) y reguladores de biopelículas, y 60% de células planctónicas, que expresan niveles más altos de genes asociados a la virulencia2,4 (Figura 2A). En este protocolo, describimos un método para cosechar ambos tipos de células para comparar sitios de transcripción a través de ChIP-seq; sin embargo, este protocolo se puede adaptar para otros tipos de biopelículas formadas por otras especies bacterianas. Los agregados de biopelícula y las células planctónicas están separados por centrifugación a velocidad lenta, que pellets biopelícula y deja células planctónicas en el sobrenadante2 (Figura 2B). A continuación, los tipos de celda se tratan por separado para los pasos posteriores del protocolo.
La cantidad recomendada de entrada de ADN para ChIP-seq es de 10-25 g20. En S. El cultivo del matraz de Typhimurium, 30 mg de biopelícula produce aproximadamente 25 g de ADN. Dado que los agregados de biopelículas tienen una abundancia de material extracelular proteico, hipotetizamos que esto interferiría con la eficiencia de la reticulación. Si simplemente normalizamos los diferentes tipos de células por número celular, el tratamiento de las células planctónicas puede resultar en una cantidad desigual de producto reticulado presentado para la inmunoprecipitación. Se realizó un ensayo proteico para determinar la cantidad equivalente de material celular planctónico para que coincida con 30 mg de biopelícula(Figura 3). 6.0 OD600 de células planctónicas se cosecharon para que coincidan con 30 mg de biopelícula.
Los agregados de Biofilm primero deben separarse para permitir el acceso igualitario del retivíador a todas las celdas. Encontramos que la forma más uniforme y de alto rendimiento de homogeneizar las células era utilizando un molino mezclador y una perla de acero inoxidable de 5 mm(Figura 4A). Las células planctónicas se tratan de la misma manera para reducir variables en el experimento ChIP-seq(Figura 4B).
Una vez que el ADN ha sido fragmentado por sonicación, reticulado, y tratado con RNase y Proteinase K, se puede visualizar en un gel de agarosa del 2%. El ADN sonicado se descompone en una colección de fragmentos que aparecen como un frotis en el gel de agarosa. El tamaño medio del fragmento disminuye con un número creciente de ráfagas de sonicación(Figura 5). La transferencia de energía variará para diferentes unidades de sonicadores, por lo que se recomienda un ensayo de sonicación para determinar el número de ráfagas de sonicación necesarias para fragmentar el ADN a un promedio de menos de 1 kb. Para nuestro experimento ChIP-seq, elegimos 5 ráfagas.
Las directrices ENCODE recomiendan una confirmación de la actividad de unión diana de anticuerpos con un inmunoblot21. En este caso, medimos la especificidad y la fuerza de unión de nuestros anticuerpos por inmunoblot en los lysaatos de células enteras preparados para ChIP(Figura 6). Confirmamos que el anticuerpo se une a CsgD-3xFLAG; las señales anti-FLAG y anti-CsgD colocalizan al peso molecular esperado (28 kDa)22.
Los procedimientos de ChIP a menudo producen bajas concentraciones de ADN. Por lo tanto, se eligió un método de purificación que elimina contaminantes y conserva una alta proporción del ADN. La purificación de perlas magnéticas se eligió sobre la purificación basada en columnas porque retuvo mejor las bajas concentraciones de ADN ChIP de entrada(Figura 7)y eliminó contaminantes (datos no mostrados).
Debido a la reducción de las cantidades iniciales de ADN, la preparación de la biblioteca de ADN ChIP puede requerir adaptadores diluidos y enriquecimiento de PCR. Antes de la secuenciación, las bibliotecas pueden ser visualizadas por el seguimiento del Bioanalyzer para confirmar la distribución correcta del tamaño antes y después del enriquecimiento de PCR(Figura 8). Además, si existe un objetivo reglamentario conocido del factor de transcripción, se debe utilizar qPCR para confirmar el enriquecimiento de las regiones de unión comparando el cambio de pliegue (-Ct) entre la abundancia de secuencia de genes de referencia y objetivo conocido en el ADN de entrada inmunoprecipitado y sonicado.
Los datos de secuenciación de ChIP deben analizarse asignando puntuaciones de calidad, recortando bases de baja calidad, alineando lecturas hacia delante y hacia atrás (en secuenciación final emparejada), ensamblando a un genoma de referencia de alta calidad, encontrando picos por encima del fondo y realizando análisis posteriores(Figura 9A). El análisis posterior debe incluir la visualización y anotación de picos, la coherencia con las muestras de réplica biológica y el análisis de motivos, y podría incluir análisis de unión diferencial entre condiciones o tipos de células, e integración de datos con expresión génica de vías conocidas. Para los datos ChIP-seq como el nuestro, los picos deben identificarse como significativamente por encima del fondo(Figura 9B,C, barras rojas) con una determinación de valor p, no simplemente por cambio plegado. En el análisis final, las lecturas asignadas se visualizan con la anotación del genoma de referencia(Figura 9D). Un mal resultado de ChIP-seq aparecería como input-seq sin ningún pico significativo por encima del fondo.
Figura 1: Ilustración de pasos en ChIP-seq con biopelículas bacterianas. En el procedimiento descrito, S. Las células de Typhimurium se cultivan en un cultivo de matraz de triptona al 1% a 28 oC con temblor (1), se recogen medios acondicionados sin células para manipular tipos de células de biopelícula (2), que se utiliza para recoger una cantidad adecuada de biopelícula y células planctónicas (3). Estas células se lavan con PBS y se homogeneizan para romper el biofilm (4). Las proteínas se recruzan al ADN con un reticulante de formaldehida, después de lo cual las células se lysed para liberar el contenido celular (5). El ADN en el islato celular se fragmenta por sonicación (6). El ADN reticulado a la proteína diana se selecciona a través de la inmunoprecipitación con un anticuerpo que se une a la proteína diana y a las cuentas magnéticas de la proteína G (7). El ADN seleccionado se lava y se eluye de las perlas magnéticas de la proteína G (8) y se purifica para la preparación y secuenciación de la biblioteca (9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Modelo de matraz in vitro para el estudio S. Desarrollo de biopelícula de Typhimurium. (A) S. Las células de Typhimurium cultivadas en 1% de triptona durante 13 h a 28 oC se someten a un cambio de fenotipo para formar agregados de biopelícula y células planctónicas en la fase líquida del cultivo del matraz. ( B ) Los agregadosdeBiofilm y las células planctónicas del cultivo del matraz en (A) se separaron mediante centrifugación a 210 x g durante 2 min. El sobrenadante fue cosechado para preparaciones de células planctónicas y el pellet fue cosechado para preparaciones celulares de biopelícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Concentraciones totales de proteínas para células planctónicas y muestras de células de biopelícula cosechadas de S. Cultivo de matraz Typhimurium. Se realizaron ensayos de proteínas colorimétricas y se midieron cantidades de proteínas en relación con una curva estándar de BSA a 750 nm. El contenido de proteínas de las muestras de células planctónicas lysed a 4.0, 6.0 y 8.0 OD600 se comparó con 30 mg de agregados de biopelícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Homogeneización de muestras celulares de S. Cultivos de matraz de biopelícula Typhimurium. (A) Los agregados de Biofilm del cultivo del matraz resuspendidos en PBS (izquierda) se homogeneizaron utilizando un molino mezclador a 30 Hz durante 5 min (derecha). (B) Las células planctónicas del cultivo del matraz resuspendidas en PBS fueron procesadas por el molino mezclador a 30 Hz durante 5 min para asegurar la consistencia entre las muestras de tipo de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo de sonicación con lisados de células pre-ChIP. Las muestras de agregados de biopelículas y células planctónicas fueron separadas, homogeneizadas, reticuladas y lysed. Los complejos de proteínas de ADN fueron sonicados hasta 8 veces a 30 s y 2 minutos de distancia en hielo para dividir el ADN en fragmentos más pequeños. Una porción del islao sonicado se separó en un gel de agarosa del 2%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Especificidad de unión a objetivos del anticuerpo anti-FLAG utilizado en ChIP-seq. La especificidad de los anticuerpos se evaluó inmunoblotando contra los lysaatos de células enteras preparados a partir de los cultivos de matraz de la S. Las cepas de Typhimurium como se muestra. Las muestras de biopelícula sin tensión s/csgD +p3xFLAG/csgD y WT representan agregados de biopelícula cosechados a partir de matraces, mientras que las células planctónicas de la cepa decsgD a p3xFLAG y WT representan células planctónicas. El CsgD purificado de Su etiqueta fue cargado como control. Se normalizaron los lisatos de células enteras, de modo que se analizaron 30 g de proteína total en cada carril. Los números de la izquierda se refieren al tamaño (en kDa) de los marcadores de peso molecular preconfigurados. El anticuerpo primario utilizado para la mancha superior fue el anticuerpo policlonal rabbit-anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), mientras que la mancha inferior fue incubada con conejo-anti-FLAG junto con un anticuerpo monoclonal específico de CsgD2. Se utilizaron IgG anticonejo de cabra (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) y IgG antiratón de cabra (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) como anticuerpos secundarios. Las señales fluorescentes se visualizaron utilizando el sistema de imágenes Odyssey CLx y el paquete de software Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Se muestran imágenes representativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Estrategias de purificación basadas en cuentas magnéticas o de columna para pequeñas cantidades de ADN resultantes de experimentos ChIP-seq. Las muestras de cantidades conocidas de ADN se purificaron utilizando kits basados en columnas o perlas magnéticas y la concentración del eluido se midió después de la purificación. Los perlas magnéticas mostraron una mejor recuperación a niveles bajos de ADN, similares a las bajas cantidades de ADN que normalmente se encuentran al final del protocolo ChIP-seq, pero antes de la preparación de la biblioteca NGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Preparaciones de ADN ChIP y bibliotecas posteriores visualizadas por Bioanalyzer. (A) El tamaño medio del fragmento del ADN genómico después de la lisis celular y la sonicación fue de <1000 bp, con la mayoría de los fragmentos en el rango de 200-500 bp. (B) El material de inicio para la preparación de la biblioteca estaba por debajo de la detección. (C) La ligadura del adaptador y el enriquecimiento de PCR permiten la amplificación de los fragmentos de la biblioteca. (D) Una mala preparación de la biblioteca tiene picos de ADN bajos, picos de peso molecular impar o alto, o picos de adaptador abundantes a aproximadamente 100 bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Los datos de ChIP-seq se analizan utilizando herramientas bioinformáticas y visualizados en un navegador genómico. A. Diagrama de flujo para el análisis bioinformático típico de los datos ChIP-seq. Las lecturas en bruto para biofilm (cepac-sgD + p3xFLAG/csgD) ycélulasplanctónicas (csgD + p3xFLAG) se limpiaron para lecturas y adaptadores de baja calidad, y se asignaron a S. Genomas de Typhimurium 14028s (NC_016856.1 para el cromosoma y NC_016855.1 para el plásmido) de Bowtie2 (v2.3.3.1) con los parámetros predeterminados23. MACS2 (v2.1.2) se utilizó para llamar a los picos con parámetros de '-q 0.01 -- nomodel', tomando réplicas de biopelículas como conjuntos de datos de prueba y plancónicos como control24. El módulo MACS2 bdgcmp se utilizó además para generar una pista de enriquecimiento plegable con parámetros de '-m FE'. El archivo de pico significativo con pista de enriquecimiento plegable se transformó en un archivo de peluca utilizando bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 y visualizado en el genoma de referencia utilizando Integrative Genomics Viewer v2.5.126. Se muestran picos representativos (barras rojas). (B) La región grande de 40 kbps, que contiene varios picos, es un resultado atípico pero todavía potencialmente valioso. (C) Este es un resultado más típico, que muestra dos regiones pico significativas. (D) Acercar el pico izquierdo en C, mostrando la asignación de lecturas a la región de la S. Typhimurium 14028s genoma que contiene promotores divergentes para uspA y uspB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búferes de lisis celular |
| Buffer de Lysis |
| 50 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| EDTA de 10 mM |
| 1% SDS |
| inhibidores de la proteasa |
| Búfer de dilución IP |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| EDTA de 2 mM |
| 150 mM NaCl |
| 1% Tritón X-100 |
| 0.01% SDS |
| Búferes de inmunoprecipitación |
| Búfer de lavado IP 1 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| EDTA de 2 mM |
| 50 mM NaCl |
| 1% Tritón X-100 |
| 0.1% SDS |
| Búfer de lavado IP 2 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 250 mM LiCl |
| EDTA de 1 mM |
| 1% NP-40 |
| 1% ácido desoxicólico |
| TE (T10E1) pH 8,0 |
| 10 mM Tris-HCl |
| EDTA de 1 mM |
| Búfer de elución |
| 1% SDS |
| 100 mM NaHCO3 |
Tabla 1. Recetas de búfer.
Discussion
Este protocolo describe una técnica para realizar ChIP-seq con Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas de cultivo puro, para encontrar objetivos reguladores del regulador maestro de biopelículas, CsgD. Esperamos información de unión diferencial debido a la biestabilidad de CsgD en los dos tipos de células, con altos niveles en agregados de biopelículas y niveles bajos en células planctónicas2,3. Sin embargo, esta técnica también se puede aplicar a otros factores de transcripción bacteriana, tipos de células o condiciones de crecimiento. En particular, esta técnica se puede adaptar a otras biopelículas bacterianas utilizando un factor de conversión experimentalmente determinado para la CFU por unidad de peso de las células de biopelícula.
ChIP-seq puede ser propenso a la amplificación de errores técnicos a través de la secuenciación; sin embargo, la confirmación en pasos críticos puede prevenir este27. La especificidad primaria de los anticuerpos es importante para seleccionar sólo el factor de transcripción objetivo y el ADN que controla durante la inmunoprecipitación7. En este experimento, csgD se fusionó con una etiqueta 3xFLAG codificada por plásmido en el extremo 3' del gen, correspondiente al término C de CsgD22. El plásmido p3xFLAG sin csgD se utilizó como un "control" (S. Typhimurium 14028 écsgD + p3xFLAG). Las directrices ENCODE recomiendan realizar inmunoblots con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, y lisados de cepas ChIP y cepas de deleción21. Es importante asegurarse de que las condiciones de crecimiento sean coherentes entre las réplicas para reducir la variabilidad en los resultados de unión de factores de transcripción y secuenciación posterior. Si uno es cuidadoso para asegurar que los tamaños de inóculo y las condiciones de crecimiento pre-inóculo sean consistentes, el crecimiento de biopelículas en el cultivo del matraz es consistente4. Es importante confirmar que todo el biofilm se ha roto después de la homogeneización, para garantizar el acceso igualitario de los reactivos, particularmente el enlace cruzado formaldehído, a todas las células.
Varias modificaciones pueden permitir a los investigadores utilizar este protocolo para otras proteínas de unión al ADN, tipos de células, cepas, condiciones de crecimiento o equipos de laboratorio. Si se utiliza para especies formadoras de biopelículas que no sean S. Typhimurium, el factor de conversión de las unidades formadoras de colonias por unidad de peso de biopelícula, debe determinarse experimentalmente mediante la recolección de diferentes cantidades de biopelícula, la homogeneización completa de la biopelícula y la realización de diluciones en serie y el recuento de placas para crear una curva estándar, que puede no ser precisa en pesos de biopelícula inferiores2. La transferencia de energía del Sonicador y la resistencia al tipo de célula pueden diferir; por lo tanto, se recomienda un ensayo de sonicación para encontrar el número de ráfagas de sonicación que producirán el rango de tamaño de fragmento necesario para la preparación y secuenciación de la biblioteca aguas abajo11. La fragmentación de la cromatina por nucleasa microcócica es una alternativa a la sonicación que produce una alta resolución de los sitios de ocupación; sin embargo, este método puede introducir sesgo de fragmentación7,28. El rango de tamaño de ADN puede modificarse dependiendo de los kits de preparación de bibliotecas posteriores y las plataformas de secuenciación. Otros métodos de homogeneización se pueden utilizar en lugar del molino mezclador. Por ejemplo, un homogeneizador de tejido de vidrio puede ser sustituido, pero puede aerosolizarse o romper incompletamente el biofilm. En términos de controles, el ADN pre-inmunoprecipitado se puede normalizar en el procesamiento y análisis posteriores a la secuenciación. También se puede utilizar como control13un control de IP simulado con suero de anticuerpos normales emparejado con especies.
Los investigadores deben tener en cuenta las limitaciones a este método al considerar un experimento ChIP-seq. Pueden ser necesarias modificaciones significativas para adaptarla a otros tipos de biopelículas. Por ejemplo, con Salmonella Typhimurium la suspensión inmediata de biopelícula en PBS conduce a una pérdida mensurable de agregados de biopelícula. La inmunoprecipitación dirigida a los objetivos reguladores de los factores de transcripción en bacterias puede resultar en cantidades muy pequeñas de ADN, lo que es un desafío para la purificación y detección en pasos posteriores. El sesgo se puede introducir durante el cizallamiento y la manipulación aguas abajo durante la detección de la biblioteca9. Además, este método no revela los niveles de expresión in vivo en respuesta a la unión del factor de transcripción. Los investigadores que tienen poca experiencia en bioinformática pueden ser desafiados por la canalización de análisis. Este método puede ser costoso y de tiempo intensivo; sin embargo, el costo de la secuenciación es a menudo menor que un microarray y está disminuyendo con el tiempo a medida que se siguen realizando mejoras tecnológicas.
Pocos métodos en la literatura describen ChIP con bacterias, y la mayoría de los experimentos bacterianos comienzan con una condición de crecimiento simple13,14,15,17,18. La preparación de muestras ChIP con células individuales es sencilla y presenta menos desafíos que la preparación de muestras ChIP con agregados de biopelícula. En cuanto a ChIP-seq, los métodos anteriores de estudio de los circuitos cis-reglamentarios, incluida la evolución sistemática de los ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), los ensayos de cambio de movilidad electroforético (EMSA), ChIP-chip, la eliminación del promotor y el análisis de reporteros han sido complementados o reemplazados por ChIP-seq29. ChIP-seq está reemplazando ChIP-chip debido al avance de las tecnologías y la disponibilidad de secuenciación. La secuenciación profunda proporciona a los investigadores cantidades masivas de datos que pueden identificar sitios con menor afinidad de enlace y mayor resolución de par base con menos material de partida que ChIP-chip11,30. El análisis de los datos de ChIP de organismos con genomas de referencia de alta calidad es generalmente rápido y específico. Además, ChIP-seq es un método exhaustivo para descubrir en silico sitios de enlace predichos que pueden no estar ocupados en todos los tipos de células, fase de crecimiento, o condiciones ambientales31.
En el futuro, este protocolo se puede utilizar para facilitar la comprensión de la patogénesis bacteriana, en particular los organismos formados por biopelículas. La amplia adopción de esta técnica y la disponibilidad de nuevos conjuntos de datos pueden conducir a la integración de datos para identificar grupos de proteínas que se colocalizan para controlar los procesos celulares en microorganismos formadores de biopelículas32. Además, los datos ChIP-seq y RNA-seq se pueden integrar para construir modelos de sistema regulador33.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) (#2017-05737) a AW y a través de la Cátedra Jarislowsky en Biotecnología. MP fue apoyado por una beca NSERC-CREATE a través del Programa Integrado de Capacitación en Enfermedades Infecciosas, Seguridad Alimentaria y Políticas Públicas (ITraP) en la Universidad de Saskatchewan.
Los autores quieren agradecer a Dani Dale por el rodaje y la edición.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
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