Kromatin immünopresididimi yeni nesil dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde transkripsiyon faktörleri ile kontrol ettikleri genomik diziler arasındaki etkileşimleri kurmak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, salmonella enterica serovar Typhimurium bakteriyel biyofilm örnek olarak kullanarak, bakteriyel biyofilm ile ChIP-seq gerçekleştirmek için teknikleri özetliyor.
Kromatin immünopresidididial (ChIP-seq) transkripsiyon faktörlerinin düzenleyici hedeflerini, histon modifikasyonlarını ve dna ile ilişkili diğer proteinleri keşfetmek için kullanılabilecek bir tekniktir. ChIP-seq verileri, transkripsiyon faktörlerinin farklı çevre koşullarında veya hücre tiplerinde diferansiyel bağlanmasını bulmak için de kullanılabilir. Başlangıçta, ChIP bir mikrodizi (ChIP-chip) hibridizasyon yoluyla yapıldı; ancak, ChIP-seq teknolojik gelişmeler, sıralama için mali engelleri azaltarak ve yüksek kaliteli veri çıkışı büyük miktarlarda ile tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bu protokolde, kalıcı ve kronik enfeksiyonların önemli bir kaynağı olan bakteriyel biyofilmlerle ChIP-seq yapmanın teknikleri açıklanmıştır. ChIP-seq Salmonella enterica serovar Typhimurium biyofilm ve planktonik hücreler üzerinde yapılır, ana biyofilm regülatörü hedefleyen, CsgD, iki hücre tipinde diferansiyel bağlayıcılığı belirlemek için. Burada, hasat için uygun miktarda biyofilm göstermek, bir planktonik kontrol örneğine normalleştirme, çapraz bağlayıcı erişim için biyofilm homojenleştirme, ve yüksek kaliteli sıralama sonuçları elde etmek için rutin ChIP-seq adımları gerçekleştirerek.
Bakteriyel biyofilmler, kendi kendine üretilen bir matris gömülü hücrelerin yapısal agregalar, desiccation dirençli, antibiyotikler, ve ev sahibi bağışıklık yanıtları1. Bu nedenle, kalıcı ve kronik enfeksiyonlara neden olur ve hayatta kalma ve bulaşma çözümleri nedeniyle araştırmacılara benzersiz zorluklar sunarlar. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tiphimurium) desiccation ve antibiyotiklere dirençli biyofilm agregalarının fenotipik heterojen popülasyonları ve çevresel strese maruz kaldığında saf kültürde virülans faktörlerini ifade eden planktonik hücreler (28 °C, besinlerisınırlayan)2 . Bu iki hücre tipi ana biyofilm regülatörü, CsgD3bistable ekspresyonu nedeniyle ortaya çıkar. Biz bu Salmonellaiçin bir bahis koruma stratejisi olabileceğini varsaydığımız varsayılmaktadır , planktonik hücreler kısa vadeli iletim katılmak ve biyofilm hücreleri yeni bir konak enfekte etmek için bir fırsat ortaya çıkana kadar çevrede uzun vadeli devam edebiliyoruz2,4. Csg operon ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici unsurların çoğu5ile karakterize edilir. Ancak, dışında adrA ve csg operon6,CSGD birkaç düzenleyici hedefleri bilinmektedir. CsgD düzenleyici ağının belirlenmesi Salmonella yaşam döngüsünü ve biyofilmlerin iletimde oynadığı rolü daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır.
Chromatin immünopresidümünde yüksek iş yapma lı sekanslama (ChIP-seq) protein-DNA etkileşimlerinin genom çapında tanımlanması için güçlü bir in vivo tekniğidir ve transkripsiyon faktörleri, histon modifikasyonları veya nükleozomları içeren düzenleyici süreçler hakkında bilgi sağlar7. Yeni çalışmalar büyüme koşulları ve hücre tipleri arasında diferansiyel protein bağlanması değerlendirmek için bu tekniği kullandık8. Kromatin immünopresipitendinde (ChIP), etkileşen proteinlere sahip DNA parçaları hedef proteinlerin antikor seçimi ile zenginleştirilmiştir. Hücreler hasat edilir ve DNA bağlayıcı proteinler formaldehit çapraz bağlayıcı tedavisi ile in vivo DNA’ya bağlanır. Hücreler lysed, hücre içeriğini serbest, ve kromatin yaklaşık 200-600 bp parçaları7içine ayrılır. Hedef proteine bağlı DNA parçaları antikor kullanılarak immünopsipitated ve protein sindirim9takip de-crosslinking tarafından izole edilir. Bu DNA parçaları bir mikrodizi (ChIP-chip) veya derin sıralama ve genom dizisi10,11için haritalama ile hibridizasyon ile eşleşen protein bağlayıcı siteleri temsil eder. ChIP-chip deneyleri yeterli düzenleyici veri sağlamak rağmen, pahalı probların kullanımı nedeniyle sınırlıdır, yanı sıra hibridizasyon ve dizi önyargı12. ChIP-seq artan nükleotit çözünürlüğü ve kapsama alanı, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ve ChIP-chip7ile karşılaştırıldığında daha az eser ile daha büyük bir dinamik aralığı vardır.
ChIP Salmonella serovar Typhimurium13Sfh ve OmpR regülasyon analiz etmek için kullanılmıştır,14, Vibrio alginolyticus15çoğunluk algılama AphA düzenleme, Escher RpoS düzenleme ichia coli16, Mycobacterium tuberculosisvirülans düzenleyici EspR düzenleme17, Pseudomonas aeruginosaAmrZ düzenleme ile potansiyel diguanylate siklazlar18, yanı sıra VraSR Staphylococcus aureus19yönetmelik. Tarif edilen bakteriyel ChIP-seq deneyleri sıvı ortamda büyüyen hücreler ve tek hücre şeklinde hasat ile başlar. Ancak, biyofilmlerin analizi ve buna karşılık gelen gen düzenlemesi, başarılı bir ChIP-seq protokolü oluşturmak için yeni bir dizi zorluğu temsil etmektedir. Bu protokolde, ChIP-seq CsgD, S diferansiyel düzenleyici hedefleri bulmak için kullanılır. Biyofilm ve planktonik hücre tiplerinde tiporium ana biyofilm regülatörü. Bu protokol, ChIP-seq için uygun miktarda biyofilm belirlemek, şişe kültüründen hasat biyofilm, biyofilm ve tek hücre kontrol örneklerini normalleştirmek, biyofilm homojenize ve komple immünopresitam immünopredimi belirlemek için kullanılan teknikleri tanımlar. Bu bakteriyel biyofilmlerde düzenleyici hedefleri incelemek için yararlı olacak ve birçok tür için adapte edilebilir.
Bu protokol, ana biyofilm düzenleyicisi CsgD’nin düzenleyici hedeflerini bulmak için Salmonella enterica serovar Typhimurium biyofilm ve planktonik hücrelerle ChIP-seq yapmak için bir teknik özetlerilmektedir. Biyofilm agregalarında yüksek seviyelerde ve planktonik hücrelerde düşük seviyelerde olan csgD’nin iki hücre tipinde iki stabilitesi nedeniyle diferansiyel bağlama bilgileri bekliyoruz2,3. Ancak, bu teknik aynı zamanda diğer bakteriyel transkripsiyon faktörleri, hücre tipleri, ya da büyüme koşulları uygulanabilir. Özellikle bu teknik, biyofilm hücrelerinin birim ağırlığı başına CFU için deneysel olarak belirlenmiş bir dönüşüm faktörü kullanılarak diğer bakteriyel biyofilmlere uyarlanabilir.
ChIP-seq sıralama yoluyla teknik hata amplifikasyon eğilimli olabilir; ancak, kritik adımlarda onay bu27önleyebilirsiniz. Primer antikor özgüllüğü sadece hedef transkripsiyon faktörünü ve immünoprediyağış sırasında kontrol edilen DNA’yı seçmek için önemlidir7. Bu deneyde, csgD genin 3′ sonunda plazmid kodlanmış 3xFLAG etiketine kaynaşmış, CsgD22C-terminusuna karşılık gelen . CSGD’siz p3xFLAG plazmidi “kontrol” (S. Tiphimurium 14028 ,csgD + p3xFLAG). ENCODE kılavuzları ilgi proteinkarşı primer antikor ile immünoblots performans öneririz, ve ChIP suşları ve silme suşları lysates21. Transkripsiyon faktörü bağlama ve aşağı sıralama sonuçlarında değişkenliği azaltmak için büyüme koşullarının çoğaltmalar arasında tutarlı olduğundan emin olmak önemlidir. Bir inokül boyutları ve pre-inoculum büyüme koşulları tutarlı olduğundan emin olmak için dikkatli ise, şişe kültüründe biyofilm büyüme tutarlı4. Tüm biyofilm homojenizasyon dan sonra parçalanmış olduğunu onaylamak için önemlidir, reaktifler eşit erişim sağlamak için, özellikle formaldehit çapraz bağlayıcı, tüm hücrelere.
Çeşitli değişiklikler, araştırmacıların bu protokolü diğer DNA bağlayıcı proteinler, hücre tipleri, suşlar, büyüme koşulları veya laboratuvar ekipmanları için kullanmalarına olanak sağlayabilir. S dışındaki biyofilm oluşturan türler için kullanılırsa. Tiphimurium, biyofilm birim ağırlığı başına koloni oluşturan birimlerin dönüşüm faktörü biyofilm farklı miktarlarda hasat, iyice biyofilm homojenleştirme ve düşük biyofilm ağırlıkları doğru olmayabilir standart bir eğri oluşturmak için seri seyreltme ve plaka sayma gerçekleştirerek deneysel olarak belirlenmelidir2. Sonicator enerji transferi ve hücre tipi direnci farklı olabilir; bu nedenle, bir sonication tsay downstream kitaplık hazırlama ve sıralama11için gerekli parça boyutu aralığı üretecek sonication patlamaları sayısını bulmak için tavsiye edilir. Mikrokokal nükleaz ile kromatin parçalanması, doluluk bölgelerinin yüksek çözünürlüğü üreten sonication’a alternatiftir; ancak, bu yöntem parçalanma önyargı7,28tanıtabilir. DNA boyutu aralığı, alt kitaplık hazırlama kitlerine ve sıralama platformlarına bağlı olarak değiştirilebilir. Mikser değirmeni yerine diğer homojenizasyon yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, bir cam doku homogenizer değiştirilebilir, ancak aerosolize veya tamamen biyofilm kırmak olabilir. Kontroller açısından, pre-immünpresipitatDNA post-sekans işleme ve analiz normalize edilebilir. Türlere uygun normal antikor serumu ile bir mock-IP kontrolü de13kontrol olarak kullanılabilir.
Araştırmacılar bir ChIP-seq deneyi göz önünde bulundurularak bu yöntemin sınırlamaları dikkate almalıdır. Diğer biyofilm tipleri için uyarlamak için önemli değişiklikler gerekebilir. Örneğin, Salmonella Typhimurium ile PBS biyofilm hemen resuspension biyofilm agregalarının ölçülebilir kaybına yol açar. Bakterilerdeki transkripsiyon faktörlerinin düzenleyici hedeflerini hedefleyen immünopresipitasyon çok az miktarda DNA’ya neden olabilir ve bu da daha sonraki adımlarda arınma ve algılama için bir meydan okumadır. Önyargı, kütüphane algılama sırasında kırpma ve aşağı işleme sırasında tanıtılabilir9. Buna ek olarak, bu yöntem transkripsiyon faktörü bağlama yanıt olarak in vivo ifade düzeyleri ortaya değildir. Biyoinformatik alanında çok az deneyimi olan araştırmacılar analiz boru hattı tarafından meydan olabilir. Bu yöntem zaman yoğun ve pahalı olabilir; ancak, sıralama maliyeti genellikle bir mikrodizi daha düşüktür ve teknolojik gelişmeler yapılmaya devam ettikçe zaman içinde azalmaktadır.
Literatürde birkaç yöntem bakteriler ile ChIP açıklamak, ve en bakteriyel deneyler basit bir büyüme durumu ile başlar13,14,15,17,18. Tek hücrelerle ChIP numune hazırlama basittir ve biyofilm agregaları ile ChIP numune hazırlama daha az zorluklar sunar. ChIP-seq gelince, üstel zenginleştirme (SELEX), elektroforetik hareketlilik kayması tahlilleri (EMSA), ChIP-chip, organizatör silme ve muhabir analizi tarafından ligandların sistematik evrimi de dahil olmak üzere cis-düzenleyici devre, çalışma önceki yöntemler tamamlanmıştır veya ChIP-seq29ile değiştirildi . ChIP-seq, ilerleyen teknolojiler ve sıralama nın kullanılabilirliği nedeniyle ChIP çipinyerini alıyor. Derin sıralama chip-chip11daha az başlangıç malzemesi ile daha düşük bağlayıcı afinite ve daha yüksek baz çifti çözünürlüğü ile siteleri tanımlayabilirsiniz veri büyük miktarlarda araştırmacılar sağlar,30. Yüksek kaliteli referans genomlara sahip organizmalardan elde edilen ChIP verilerinin analizi genellikle hızlı ve spesifiktir. Ayrıca, ChIP-seq tüm hücre tipleri, büyüme aşaması veya çevre koşullarında işgal olmayabilir silico öngörülen bağlama sitelerinde keşfetmek için kapsamlı bir yöntemdir31.
Gelecekte, bu protokol bakteriyel patogenezin, özellikle biyofilm oluşturan organizmaların anlaşılmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin geniş benimsenmesi ve yeni veri kümelerinin kullanılabilirliği, biyofilm oluşturan mikroorganizmalarda hücresel süreçleri kontrol etmek için birlikte lokalize protein gruplarını belirlemek için veri entegrasyonuna yol açabilir32. Buna ek olarak, ChIP-seq ve RNA-seq verileri düzenleyici sistem modelleri oluşturmak için entegre edilebilir33.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi’nin (#2017-05737) AW’ye ve Jarislowsky Biyoteknoloji Kürsüsü’ne verdiği bir bağışla desteklenmiştir. MP, Saskatchewan Üniversitesi’nde Bulaşıcı Hastalıklar, Gıda Güvenliği ve Kamu Politikası (ITraP) Entegre Eğitim Programı aracılığıyla NSERC-CREATE bursu ile desteklenmiştir.
Yazarlar, dani Dale’e çekim ve kurgu için teşekkür etmek isterler.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |