Хроматин иммунопрецитификации в сочетании с следующего поколения секвенирования (ChIP-seq) является метод, используемый для установления взаимодействия между транскрипционными факторами и геномных последовательностей они контролируют. Этот протокол излагаются методы для выполнения CHIP-seq с бактериальными биопленками, используя Salmonella enterica serovar Typhimurium бактериальной биопленки в качестве примера.
Хроматин иммунопрецитификации следуют секвенирования (ChIP-seq) является метод, который может быть использован для обнаружения нормативных целей транскрипционных факторов, гистон модификации, и другие ДНК-связанных белков. Данные ChIP-seq также могут быть использованы для поиска дифференциальной привязки транскрипционных факторов в различных условиях окружающей среды или типах клеток. Первоначально, ChIP был выполнен путем гибридизации на microarray (ChIP-чип); однако, ChIP-seq стал предпочтительным методом благодаря технологическим достижениям, снижению финансовых барьеров на пути секвенирования и огромному объему высококачественных данных. Методы выполнения CHIP-seq с бактериальными биопленками, основным источником стойких и хронических инфекций, описаны в этом протоколе. CHIP-seq выполняется на Salmonella enterica serovar Typhimurium биопленки и планктонных клеток, ориентированных на мастер биопленки регулятора, CsgD, для определения дифференциального связывания в двух типах клеток. Здесь мы демонстрируем соответствующее количество биопленки для сбора урожая, нормализуем к планктонскому контрольному образцу, гомогенизируя биопленку для доступа к кросс-ссылкам и выполняя обычные шаги ChIP-seq для получения высококачественных результатов секвенирования.
Бактериальные биопленки, структурные агрегаты клеток, встроенных в самостоятельной матрицы, устойчивы к высыханию, антибиотики, и принимающих иммунных реакций1. Как таковые, они вызывают стойкие и хронические инфекции и представляют уникальные проблемы для исследователей из-за их решения для выживания и передачи инфекции. Сальмонеллы энтерика серовара Тифимуриум(S. Typhimurium) было установлено, чтобы установить фенотипично неоднородные популяции биопленки агрегатов, которые устойчивы к высыханию и антибиотики, и планктонных клеток, которые выражают вирулентность факторов в чистой культуре при воздействии экологического стресса (28 кВ, ограничивающих питательных веществ)2. Эти два типа клеток возникают из-за бистабильной экспрессии главного регулятора биопленки, CsgD3. Мы предположили, что это может быть ставка хеджирования стратегии для сальмонеллы, где планктонных клеток участвуют в краткосрочной передачи и биопленки клетки способны сохраняться в долгосрочной перспективе в окружающей среде, пока возможность заразить новый хозяин возникает2,4. Многие из нормативных элементов, которые контролируют экспрессию ргс оперона хорошо характеризуются5. Однако, кроме adrA и csg operon6,известно несколько нормативных целей CsgD. Определение нормативной сети CsgD поможет нам лучше понять жизненный цикл сальмонеллы и роль, которую играют биопленки в передаче.
Хроматин иммунопрецитификации следуют высокой пропускной способности секвенирования (ChIP-seq) является мощным in vivo метод для генома всей идентификации белково-ДНК взаимодействий и предоставляет информацию о нормативных процессов, связанных с транскрипции факторов, гистон изменения, или нуклеосомы7. Новые исследования использовали этот метод для оценки дифференциального связывания белка между условиями роста и типов клеток8. В хроматине иммунопреципиции (ЧИП) фрагменты ДНК с взаимодействующими белками обогащаются путем выбора антител белков-мишеней. Клетки собирают и ДНК-связывающих белков перекрестно ДНК in vivo через формальдегид кросс-ссылка лечения. Клетки лисицируются, высвобождая содержимое клеток, а хроматин срезается примерно в 200-600 bp фрагментов7. Фрагменты ДНК, привязанные к целевому белку, иммунопрецицицициционированы с помощью антител и изолированы путем декроссулинки с последующим перевариванием белка9. Эти фрагменты ДНК представляют собой места связывания белка, совмещенные путем гибридизации с микроаром (ChIP-чип) или путем глубокого секвенирования и отображения последовательности генома10,11. Хотя эксперименты с Чипом Чип-чипа дают адекватные нормативные данные, они ограничены из-за использования дорогих зондов, а также гибридизации и смещениямассива 12. ChIP-seq имеет больший динамический диапазон с увеличенным нуклеотидным разрешением и покрытием, улучшенным соотношением сигнала к шуму и меньшим количеством артефактов по сравнению с ChIP-чипом7.
CHIP был использован для анализа Sfh и OmpR регулирования в Сальмонеллы серововар Typhimurium13,14, кворум зондирования AphA регулирования в Vibrio alginolyticus15, RpoS регулирования в Эшер ichia coli16, вирулентность регулятора EspR регулирования в Mycobacterium туберкулеза17, потенциальные дигуанилат циклазы через регулирование Амре в Pseudomonas aeruginosa18, а также VraSR регулирование в золотистом стафилококке19. Бактериальные эксперименты ChIP-seq, которые были описаны, начинаются с выращивания клеток в жидких носителях и сбора урожая в одноклеточной форме. Тем не менее, анализ биопленок и соответствующее регулирование генов представляет собой новый набор задач для создания успешного протокола ChIP-seq. В этом протоколе, ChIP-seq используется для поиска дифференциальных нормативных целей CsgD, S. Тифимурий мастер биопленки регулятора в биопленки и планктонных типов клеток. Этот протокол описывает методы, используемые для определения соответствующего количества биопленки для CHIP-seq, сбора биопленки из колбы культуры, нормализовать биопленку и одноклеточных образцов управления, гомогенизировать биопленку, и полное иммунопреципции. Это будет полезно для изучения нормативных целей в бактериальных биопленок и может быть адаптирована для многих видов.
Этот протокол излагается метод для выполнения CHIP-seq с Salmonella enterica serovar Typhimurium биопленки и планктонных клеток из чистой культуры, чтобы найти нормативные цели мастер биопленки регулятора, CsgD. Мы ожидаем дифференциальной связывания информации из-за би-стабильности CsgD в двух типах клеток, с высоким уровнем в биопленки агрегатов и низких уровней в планктонных клетках2,3. Тем не менее, этот метод также может быть применен к другим бактериальным транскрипционным факторам, типам клеток или условиям роста. В частности, этот метод может быть адаптирован к другим бактериальным биопленкам с использованием экспериментально определяемого коэффициента преобразования Для CFU на единицу веса клеток биопленки.
ChIP-seq может быть подвержен усилению технической ошибки путем секвенирования; однако, подтверждение на критических шагах может предотвратить это27. Первичная специфичность антител важна для выбора только целевого фактора транскрипции и ДНК, который он контролирует во время иммунопреципиции7. В этом эксперименте, csgD был слит с плазмид-закодированной меткой 3xFLAG в конце 3′ гена, что соответствует C-терминусу CsgD22. Плазмида p3xFLAG без ргСД использовалась в качестве “контроля”(S. Тифимурий 14028 ЗсгД и p3xFLAG). Руководящие принципы ENCODE рекомендуют выполнять иммуноблоты с первичным антителом против интересующего белка, а также лисаты штаммов CHIP и штаммов удаления21. Важно обеспечить, чтобы условия роста были последовательными по всем репликациям, чтобы уменьшить изменчивость связывания транскрипции фактора и результатов секвенирования вниз по течению. Если кто-то тщательно, чтобы обеспечить инокулум размеры и до инокулум условия роста являются последовательными, биопленки рост в колбе культуры соответствует4. Важно подтвердить, что все биопленки были разбиты после гомогенизации, чтобы обеспечить равный доступ реагентов, особенно формальдегида кросс-ссылка, для всех клеток.
Несколько изменений могут позволить исследователям использовать этот протокол для других ДНК-связывающих белков, типов клеток, штаммов, условий роста или лабораторного оборудования. Если он используется для биопленки формирования видов, кроме S. Typhimurium, коэффициент преобразования колонии формирования единиц на единицу веса биопленки должна быть определена экспериментально путем сбора различных количеств биопленки, гомогенизировать биопленку тщательно, и выполнение серийных разбавлений и подсчета пластин для создания стандартной кривой, которая не может быть точной при более низких весах биопленки2. Передача энергии соникиров и сопротивление типа клеток могут отличаться; Поэтому, sonication асссы рекомендуется, чтобы найти количество звуковых очередей, которые будут производить диапазон размеров фрагмента, необходимых для подготовки библиотеки вниз по течению и секвенирования11. Фрагментация хроматина микрококковой нуклеазой является альтернативой звуковому, который производит высокое разрешение мест размещения; однако, этот метод может ввести смещение фрагментации7,28. Диапазон размеров ДНК может быть изменен в зависимости от комплектов подготовки библиотеки и платформ секвенирования. Вместо смесителя можно использовать и другие методы гомогенизации. Например, гомогенизатор стеклянной ткани может быть заменен, но он может аэрозолизировать или неполно разрушить биопленку. С точки зрения контроля, предиммунопрецитифицирующая ДНК может быть нормализована в постсековой обработке и анализе. Макет-IP управления с видами соответствия нормальной сыворотки антитела могут быть использованы в качестве контроля, а13.
Исследователи должны учитывать ограничения этого метода при рассмотрении эксперимента ChIP-seq. Для его адаптации для других типов биопленки могут потребоваться значительные изменения. Например, с Salmonella Typhimurium немедленное повторное приостановление биопленки в PBS приводит к измеримой потере биопленки агрегатов. Иммунопрециция, нацеленная на регулятивные цели транскрипционных факторов бактерий, может привести к очень небольшому количеству ДНК, что является проблемой для очистки и обнаружения на более поздних этапах. Предвзятость может быть введена во время стрижки и вниз по течению манипуляции во время обнаружения библиотеки9. Кроме того, этот метод не показывает уровни экспрессии in vivo в ответ на связывание фактора транскрипции. Исследователи, которые имеют небольшой опыт в области биоинформатики могут быть оспорены анализа трубопровода. Этот метод может быть трудоемким и дорогостоящим; однако стоимость секвенирования зачастую ниже, чем микросхема, и со временем она уменьшается по мере дальнейшего совершенствования технологий.
Немногие методы в литературе описывают ЦИП с бактериями, и большинство бактериальных экспериментов начинаются с простого состояния роста13,14,15,17,18. Подготовка образца CHIP с одиночными клетками проста и представляет меньше проблем, чем подготовка образца CHIP с биопленками агрегатов. Что касается ChIP-seq, предыдущие методы изучения цис-регуляторных схем, в том числе систематическое развитие лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), электрофоретические перебора подвижности (EMSA), ChIP-чип, удаление промоутера и анализ репортера были дополнены или заменены ChIP-seq29. ChIP-seq заменяет ChIP-чип за счет передовых технологий и доступности секвенирования. Глубокое секвенирование предоставляет исследователям огромные объемы данных, которые могут идентифицировать сайты с более низкой связывающей сродством и более высоким разрешением базовой пары с меньшим исходным материалом, чем ChIP-чип11,30. Анализ данных CHIP из организмов с высоким качеством эталонных геномов, как правило, быстрый и специфический. Кроме того, ChIP-seq является тщательным методом для обнаружения в силико предсказал связывания сайтов, которые не могут быть заняты во всех типах клеток, фазы роста, или экологических условий31.
В будущем этот протокол может быть использован для облегчения понимания бактериального патогенеза, особенно биопленкообразующих организмов. Широкое внедрение этого метода и наличие новых наборов данных может привести к интеграции данных для выявления групп белков, которые совместно локализуются для контроля клеточных процессов в биопленкообразующих микроорганизмах32. Кроме того, данные ChIP-seq и RNA-seq могут быть интегрированы для построения моделей систем ы регулирования33.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) (#2017-05737) АВ и через ярисловский кафедру в области биотехнологии. Депутат был поддержан NSERC-CREATE стипендию через комплексную программу обучения в области инфекционных заболеваний, безопасности пищевых продуктов и государственной политики (ITraP) в Университете Саскачевана.
Авторы хотели бы поблагодарить Дани Дейла за съемку и монтаж.
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |